完整版TRIZOL.docx
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完整版TRIZOL
TRIZOL®Reagent
Cat.No.15596-026Size:
100ml
Storeat2to8°C.
警告:
在与皮肤接触及吞咽有毒。
可导致烧伤。
与皮肤接触后,应立即用洗涤剂和大量水冲洗。
如感到身体不适,应就医(如需要,应出示本产品标签)。
本产品含有苯酚(108-95-2)和其他成分(NJTSRN80100437-5000P)。
已经证明TRIZOL在室温下可稳定保存12个月。
不过,我们建议在储存于2-8°C,以保证最佳性能。
描述:
TRIzol试剂(美国专利号,5346994)是即用型细胞和组织总RNA提取试剂。
该试剂是一步法苯酚和异硫氰酸胍解决方案,是对Chomczynski和Sacchi开发的单步RNA提取法
(1)的改善。
在匀质化或溶解样品中,TRIzol试剂可保持RNA的完整性,同时能破坏细胞及溶解细胞成分。
加入氯仿离心后,裂解液分离成水相和有机相。
RNA存在于水相。
水相转移后,RNA通过异丙醇沉淀回收。
移去水相后,样品中DNA和蛋白质可通过相继沉淀回收
(2)。
用乙醇沉淀可从中间相得到DNA,加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质
(2)。
与DNA的共纯化可能对不同样品得到的RNA的归一化有用。
此技术可完美应用于少量人类、动物、植物或细菌来源的组织(50-100毫克)和细胞(5×106),以及大量的组织(≥1g)和细胞(>107)。
该TRIzol试剂方法简单,允许大量样本同时处理。
整个过程可在一小时内完成。
用TRIZOL提取总RNA可避免蛋白质和DNA污染。
可用于Northernblot分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
聚合酶链反应(PCR反应)中,当两条引物位于单个外显子时,推荐使用扩增级DNA酶I(Cat.No.18068)处理分离出的RNA。
TRIzol试剂方便提取不同种类、不同分子大小的RNA。
例如,从大鼠肝中提取RNA,经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色,高分子量RNA离散带其长度可高达7kb和15kb,(组成mRNA’s和hnRNA’s),两个主要的核糖体RNA带在~5kB(28S)和~2Kb(18S)。
低分子量RNA介于0.1和0.3kB之间(tRNA,5S)。
分离出的RNA用TE稀释,其A260/A280比值≥1.8。
防止RNA酶污染的注意事项
通过不当的技术操作,RNA酶可在任何提取程序中意外引入RNA的制备中。
由于酶的活性难以抑制,所以必须防止其引入。
进行RNA工作时,下列准则应予以遵守。
•总是戴着手套。
皮肤上通常包含的细菌和霉菌,可污染RNA的制备,同时也是RNA酶的一个来源。
良好的微生物操作技术可防止微生物污染。
•使用无菌制品,专为RNA工作准备的一次性塑料器皿和自动吸管可以避免与共用设备的RNA酶交叉污染。
例如,一个实验室正在使用的RNA探针可能用得上RNA酶A或RNA酶T1以减少过滤背景,其中任何非一次性物品(如自动吸管)可能是大量RNA酶的来源。
•TRIzol试剂的存在,可保护RNA酶对RNA的污染。
下游样品处理要求非一次性的玻璃器皿或塑料器皿无RNA酶。
玻璃物品可以在150°C烘烤4小时,塑料制品,可浸泡10分钟的0.5MNaOH溶液,然后用清水彻底冲洗,并高压蒸汽灭菌。
其他需要注意的事项:
•用小于2毫升体积的TRIZOL试剂工作时,建议使用一次性透明聚丙烯管。
•对于较大的体积,用玻璃(Corex)或聚丙烯管,并测试以确保该管装满TRIzol试剂和氯仿时可承受12,000×g的离心力,不要使用泄漏或有裂纹的管子。
•离心前小心平衡管子的重量
•玻璃管必须用封口膜密封,密封时封口膜要覆盖有螺丝处,聚丙烯管离心前必须盖好。
RNA提取的指导:
警告:
当使用TRIzol试剂工作时,应使用手套,并保护眼睛(屏蔽、安全护目镜)。
避免与皮肤或衣服接触。
使用化学通风橱。
避免吸入蒸气。
除非特别注明,所有程序均在15-30°C下进行,试剂也放置于15-30°C。
需要的试剂为:
•氯仿
•异丙醇
•75%酒精(溶于DEPC处理的水中)
•无RNase的水或0.5%SDS溶液[RNase-free水的准备:
把水加入到RNase-free的玻璃瓶中,加入diethylpyrocarbonate(DEPC)至0.01%(v/v).静置过夜,高压蒸汽灭菌。
SDS溶液必须使用DEPC处理的水,并高压灭菌。
]
1.均质化(seenotes1-3)
a.组织
均质50-100毫克组织样本需要1毫升的TRIzol试剂,使用特富龙玻璃®或强力均质机(Polytron,orTekmar'sTISSUMIZER®TISSUMIZER®或相当的仪器)。
均质时样本体积不应超过TRIzol试剂体积的10%。
b.单层细胞
直接在培养皿中裂解细胞,3.5厘米直径的皿中加入TRIzol试剂1毫升,并通过抽吸几次促进细胞裂解。
TRIzol试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目(每10平方厘米加入1毫升)。
TRIzol试剂量不足可能会导致分离出的RNA有DNA的污染。
c.悬浮细胞
离心沉淀细胞。
在TRIzol试剂中重复吹打以裂解细胞。
1毫升试剂用于5-10×106的动物、植物或酵母细胞,或1×107细菌细胞。
使用TRIzol试剂前应避免洗涤细胞,因为这增加了mRNA降解的可能性。
一些酵母和细菌细胞的裂解可能需要使用均质器。
可选:
一些样品可能需要额外的分离步骤,这些样品蛋白质、脂肪、多糖或细胞外基质含量高,如肌肉、脂肪组织、以及部分植物块茎。
同质化之后,2-8°C、12000×g离心10分钟,移除不溶物。
由此产生的沉淀含有细胞外膜结构、多糖、分子量高的DNA,而上清含有RNA。
从脂肪组织等脂肪过多的样本收集的上层脂肪应弃去。
在每种情况下,均应转移净化后的均质溶液到新管,加入氯仿进行下述相分离。
2.相分离
15-30°C孵育5分钟,以利于匀浆样品中核蛋白体完全分离。
每1毫升的TRIzol试剂添加0.2毫升氯仿。
小心盖好样品管。
用手大力摇管15秒,15-30°C孵育2-3分钟。
2-8°C,不超过12,000×g离心15分钟。
离心后,混合物分离为红色下层(酚-氯仿相)、中间相以及上层的无色水相。
RNA存在于水相。
水相体积约为60%均质时使用的TRIzol试剂量。
3.RNA沉淀
水相转移到一个新管,并保存有机相(如希望分离DNA或蛋白质)。
混合异丙醇以从水相中沉淀RNA。
每1毫升用于初始的同质化的TRIzol试剂使用0.5毫升异丙醇。
15到30℃孵育样品10分钟,2-8°C,不超过12,000×g离心10分钟。
往往离心前RNA沉淀不可见,离心后在管侧面和底部形成一个凝胶样沉淀。
4.RNA洗涤
弃上清。
用75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次。
每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂使用至少1毫升75%的乙醇。
涡旋混合。
2-8°C,不超过7,500×g离心5分钟。
5.重新溶解RNA
在该过程结束时,简单干燥RNA沉淀(空气干燥或真空干燥5-10分钟)。
不要真空离心干燥RNA。
重要的是不要让RNA沉淀完全干燥,因为这将大大降低其溶解度。
部分溶解RNA样品,其A260/280比值<1.6。
在无RNA酶的水中或0.5%SDS溶液中吹打几次溶解RNA,并在55-60°C孵育10分钟。
(如RNA将用于之后的酶反应,应避免使用SDS。
)RNA也可以用100%甲酰胺(去离子)再溶解并保存于-70℃(5)。
RNAIsolationNotes:
1.从少量组织(1-10毫克)或细胞(102-104)分离RNA:
加入800µlTRIZOL到thetissueorcells.样品裂解后,加入氯仿,遵循上述步骤2进行相分离。
在异丙醇沉淀的RNA之前,加入5-10微克无RNA酶的糖原(Cat.No10814),以承载水相。
为了降低粘度,加入氯仿前以2-26号针头剪切基因组DNA。
糖原保留在水相,与RNA一起沉淀下来。
浓度高达4mg/mL的糖原既不抑制第一条链的合成,也不抑制PCR。
2.同质化后,加入氯仿前,样品也可以存放在-60至-70℃至少一个月。
RNA沉淀(步骤4,RNA洗涤)可以存储在75%乙醇中2-8℃至少一周,或在-5至-20°C至少一年。
3.最大离心力只有2,600×g的桌面型离心机也适合用于这些程序,只是在步骤2和3中,其离心时间应提高到30-60分钟。
DNA提取的指导:
如RNA分离方法所描述,完全除去水相后,位于中间相和苯酚相的DNA可被能分离。
经沉淀和系列洗涤,DNA可溶解于8mM氢氧化钠。
使用TRIzol试剂可从组织和培养细胞完全回收DNA,可用于分析样品DNA含量
(2)。
同时提取的基因组DNA可用于每个基因组northern结果的归一化分析,而不是使用变动更大的总RNA或组织的重量。
(根据来源,在进行其他程序之前,获得的DNA沉淀可能需要额外纯化(如酚提取))。
需要的试剂:
•100%乙醇
•0.1M柠檬酸钠in10%乙醇
•75%乙醇
•8mMNaOH
除非特别注明,所有程序均在15-30°C下进行。
1.沉淀DNA
移去水相后,用乙醇沉淀中间相和有机相中的DNA。
每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加0.3毫升100%乙醇,颠倒混合。
然后,15-30℃静置2-3分钟,2-8°C,不超过2,000×g离心5分钟以沉淀DNA。
仔细移去水相,对于分离DNA的质量很重要。
2.DNA洗涤
移去苯酚-乙醇上清液(如需要,保存上清用于蛋白质分离)。
用0.1M的柠檬酸钠溶液(溶于10%乙醇)洗两次沉淀的DNA。
每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加1毫升溶液。
每次清洗时,15-30℃静置30分钟DNA沉淀(间歇混匀),2-8°C,2,000×g离心5分钟。
洗涤2此后,用75%乙醇悬浮沉淀的DNA(每毫升TRIzol试剂加入75%乙醇1.5-2毫升),在15-30°C静置10-20分钟(间歇混匀),然后2-8°C,2,000×g离心5分钟。
对于包含>200µgDNA或大量非DNA物质的大沉淀,需要0.1M柠檬酸钠-10%乙醇溶液额外的洗涤。
3.重溶DNA
打开离心管口,空气干燥DNA5-15分钟。
(不要离心干燥,因为溶解更难。
)用8mM氢氧化钠溶解DNA,至DNA浓度为0.2–0.3µg/µl。
通常添加300–600µlof8mMNaOHtoDNAisolatedfrom107cellsor50–70mgoftissue.强烈推荐在弱碱中重悬,因为分离的DNA在水中或Tri缓冲液中不能重悬。
8mMNaOH的pH值只有~9,一旦DNA溶解于其中,可以很容易的用TE或HEPES进行调节。
在此期间,DNA(尤其是来自组织的DNA)中可能含有不溶性胶状物(膜碎片等等),>12,000×g离心10分钟去除不溶物。
将含DNA的上清转移到一个新管。
在8mMNaOH中溶解的DNA可储于4°C过夜。
如长期贮存,样品液应使用HEPES调整pH值至7-8(见表)并添加1mMEDTA。
一旦pH值调整后,DNA就可以储存在4°C或-20°C。
溶于8mMNaOH的DNA可在4℃保存数月,-20℃保存一年,-70℃未测定。
DNA定量与产量预测:
在8mMNaOH中溶解的DNA,取出一部分与水混合,并测量其A260的值。
用A260的值计算双链DNA含量。
1A260单位=50µg双链DNA/mL。
按照样本细胞数计算,每1×106人、大鼠或小鼠二倍体细胞可分别产生:
7.1µg,6.5µg和5.8µg的DNA(3)。
每mg肝和肾组织产生3-4ugDNA,每mg骨骼肌、脑和胎盘可产生2-3ugDNA;每106人、大鼠和小鼠来源的培养细胞可产生5-7ugDNA。
应用
PCR扩增DNA:
在8mMNaOH中溶解DNA后,用HEPES调整pH值为8.4(见表)。
添加0.1-1.0µgDNA样本至PCR反应混合物,执行标准PCR程序。
限制酶反应:
用HEPES调整DNA溶液的pH至希望的值(见表)。
样本也可用1mMEDTA,pH7-pH8.0进行透析。
每µgDNA使用3-5个units的酶。
对特殊的酶,使用酶制造商建议的条件,并让反应持续3-24小时。
在一般实验中,80-90%的DNA可被消化。
溶解于8mMNaOH的DNA样品的pH调整:
(1ml8mMNaOH使用以下量的0.1M或1MHEPES调整,不用酸)
DNAIsolationNotes:
1.苯酚相和中间相可在2-8°C保存过夜。
2.溶解于75%乙醇的样品可在2-8°C下保存数月。
3.溶解于8mMNaOH的样品可在2-8°C下保存过夜。
为长期保存,应调整其pHto7-8,并调整EDTA浓度至1mM。
蛋白质分离指导:
用乙醇沉淀DNA(步骤1,DNA沉淀)后,蛋白质可从苯酚-乙醇上清中获得。
由此产生的蛋白质可用于Westernblotting分析
(2)。
需要的试剂:
•异丙醇
•0.3M盐酸胍(溶于95%乙醇)
•100%乙醇
•1%SDS
1.蛋白沉淀
酚-乙醇上清液(每毫升TRIzol试剂上清体积大约0.8毫升)中加入异丙醇可沉淀出蛋白质。
每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加1.5毫升异丙醇。
15-30°C静置样品10分钟,然后2-8°C,12,000×g离心10分钟以沉淀蛋白质。
2.蛋白洗涤
弃去上清,用0.3M盐酸胍溶液(溶于95%乙醇)洗涤蛋白质沉淀3次。
每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加2毫升洗涤液。
每次洗涤中,15-30°C静置蛋白沉淀20分钟,2-8°C,7,500×g离心5分钟。
最后清洗后,加入2毫升乙醇,漩涡混匀蛋白沉淀。
15-30°C静置蛋白沉淀20分钟,2-8°C,7,500×g离心5分钟。
3.重溶蛋白沉淀
真空干燥蛋白质沉淀5-10分钟。
吹打溶于1%SDS。
蛋白质沉淀的完全溶解可能需要在50°C孵育样品。
2-8°C,10,000×g离心10分钟,沉淀任何不溶物,并转移上清至新管。
该样品可直接用于Westernblotting或可储存在-5至-20℃以备将来使用。
ProteinIsolationNotes:
1.用0.3M盐酸胍溶液(溶于95%乙醇)或乙醇悬浮的蛋白质沉淀可在2-8°C保存至少一个月,或-5至-20℃保存至少一年。
2.为更有效地回收蛋白,可采用下述替代方法:
在2-8℃,更换3次0.1%SDS,透析苯酚-乙醇上清。
透析物10,000×g离心10分钟。
上清用于Westernblotting。
3.如果SDS浓度足够低(<0.1%),蛋白质可用Bradford法量化,这样SDS它就不会对结果有干扰。
如没有出现洗涤剂-界面问题,就不应依赖A260/A280比值的测量(痕量的苯酚就可能导致蛋白质浓度被高估)。
问题与解答:
RNAISOLATION
•每mg组织或1×106培养的细胞RNA产量的估计
肝脏和脾脏:
6-10µg
肾脏:
3-4µg
骨骼肌和脑:
1-1.5µg
胎盘:
1-4µg
上皮细胞(1×106个培养的细胞):
8-15µg
成纤维细胞(1×106个培养的细胞):
5-7µg
•产量低
样品均质化或裂解不完全。
最终的RNA沉淀没有被完全重溶。
•A260/A280比值<1.65
进行分光光度分析之前,RNA样品溶于水中而不是TE中。
低离子强度和低pH值溶液可升高280nm的吸光度(6,7)。
使用太小体积的试剂进行均质化。
均质化后,样品没有在RT放置5分钟。
水相中包含有苯酚相。
最终的RNA沉淀没有完全溶解。
•RNA降解
从动物身体取得组织后没有立即处理或进行冷冻。
用于分离的样品,或分离后的RNA保存在-5to-20°C,而不是-60to-70°C。
用胰蛋白酶消化时细胞被破坏。
水溶液或管子不是RNase-free。
用于琼脂糖凝胶电泳的甲醛,其pH低于3.5。
•DNA污染
使用太小体积的试剂进行均质化。
用于分离的样品含有有机溶剂(e.g.,ethanol,DMSO)、强buffers、or碱性溶液。
•蛋白多糖和多糖污染
经修改的下述RNA的沉淀步骤(步骤3)可从分离出的RNA中去除这些污染物。
每毫升用于初始同质化的TRIzol试剂添加0.25ml异丙醇到水相中,然后加入0.25ml高盐沉淀液(0.8M柠檬酸钠和1.2M氯化钠)。
混合溶液,离心,然后按照正常描述的程序进行分离。
修改后,可有效沉淀RNA,并把多糖和糖蛋白保持在可溶状态。
从含有很高多糖物质的植物样品中分离、纯化RNA,需要在初始匀浆后使用修改后方法进行沉淀,并额外离心(RNA分离程序note2)。
DNAISOLATION
•每mg组织或1×106培养的细胞DNA产量的估计
肝脏和肾脏:
3-4µg
骨骼肌、脑、胎盘:
2-3µg
培养的人、大鼠、小鼠细胞(1×106):
5-7µg
成纤维细胞:
5-7µg
•产量低
样品没有完全均质化或裂解。
最终的DNA沉淀没有完全重溶。
•A260/280比值<1.70
进行分光光度分析之前,DNA样品溶于水中而不是TE中。
苯酚没有从DNA中有效去除。
用溶于10%乙醇的0.1M柠檬酸钠再洗涤DNA一次。
•DNA降解
从动物身体取得组织后没有立即处理或进行冷冻。
用于分离的样品,或分离后的RNA保存在-5to-20°C,而不是-60to-70°C。
样品使用Polytron或其他高速均质器进行均质。
•RNA污染
水相没有完全去除。
DNA沉淀没有用溶于10%乙醇的0.1M柠檬酸钠进行有效洗涤。
•其他应用
进行PCR扩增之前,调整pH至8.4。
对于DNA的限制性内切酶消化,调整pH值为所需的值,,每µgDNA使用3-5个units的酶。
对特定的酶,在酶作用最佳条件下,反应3-24小时。
通常80-90%的DNA会被消化。
PROTEINISOLATION
•产量低
样品没有完全均质化或裂解。
最终DNA沉淀没有完全重溶。
•蛋白质降解
从动物身体取得组织后没有立即处理或进行冷冻。
•PAGE电泳时条带变形
蛋白质沉淀没有有效洗涤。
References:
1.Chomczynski,P.,andSacchi,N.(1987)Anal.Biochem.162,156.
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6.Wilfinger,W.,Mackey,K.andChomczynski,P.(1997)BioTechniques22,474.
7.Fox,D.K.(1998)FOCUS20,37.
Teflon®isaregisteredtrademarkofE.I.DuPontdeNemours&Co.
TISSUMIZER®isaregisteredtrademarkofTekmarCo.
TRIZOL®isaregisteredtrademarkofMolecularResearchCenter,Inc.
*PCRiscoveredbyapatentheldbyHoffmanLaRocheCorporation.
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