实时荧光定量 PCR技术的应用.docx
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实时荧光定量 PCR技术的应用.docx
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实时荧光定量PCR技术的应用
荧光定量PCR技术简介
2007-1-1421:
21:
37 信息来源:
来源网络
∙ 荧光定量PCR技术简介
生物谷网站
国内最先进的荧光定量PCR检测系统,是国际上最新研制的一种核酸定量技术,该技术在PCR反应系统中引入了荧光标记探针,具有高灵敏性、高特异性、和高精确性的特点。
目前已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变和多态性研究等多个领域。
荧光定量PCR(简称FQ-PCR)由美国PE公司1995年研制成功,该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的,与普通PCR相比,FQ-PCR具有许多优点:
1、封闭反应,无需PCR后处理。
2、特异性强,灵敏度高。
3、采用对数期分析,摒弃终点数据,定量准确。
4、定量范围宽,可达到10个数量级。
5、仪器在线式实时检测,结果直观,避免人为判断。
6、可实现一管双检或多检。
7、操作安全,缩短时间,提高效率。
荧光定量PCR是一个方法,我们可根据临床科室的不同要求开展检测项目欢迎临床医生积极与我们联系,以有利于疾病的诊断和科研课题的研究。
目前拟开展的检测项目有:
乙肝病毒DNA定量检测
巨细胞病毒DNA定量检测
肺炎支原体DNA定量检测
生殖道淋球菌DNA定量检测
生殖道沙眼衣原体DNA定量检测
生殖道解脲支原体DNA定量检测
人乳头瘤病毒DNA定量检测(HPV-6,-11,-16,-18)
EB病毒DNA定量检测
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荧光定量PCR技术及其应用
(一)
2007-1-414:
57:
35 信息来源:
来源网络
∙ 荧光定量PCR技术及其应用
(一)
生物谷网站
荧光定量PCR(也称TaqManPCR,以下简称FQ-PCR)是美国PE(PerkinElmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术,该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的,与变通PCR相比,FQ-PCR具有许多优点。
本文拟就该技术的特点、原理和方法以及应用作一简要叙述。
1特点
FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性,而且由于荧光探针的应用,可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果,所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性,克服了常规PCR的许多缺点。
如一般PCR产物都需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测,不仅需要多种仪器,而且费时费力,所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害,这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会。
而FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子,其后的过程完全是闭管操作,不需要PCR后处理,避免了常规PCR操作中的诸多弊端。
实验一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR扩增仪。
该仪器具有以下特点:
①应用广泛:
可用于DNA和RNA的PCR产物定量、基因表达研究、病原体检测及PCR条件的优化等。
②独特的定量原理:
采用荧光标记探针,经激光激发后荧光量随PCR循环而累积,从而达到定量目的。
③工作效率高:
内置9600型PCR扩增仪,电脑控制1~2小时全自动同步完成96个样品的扩增及定量。
④无须凝胶电泳:
无须对样品进行稀释和电泳,只须通过特殊探头在反应管内直接检测。
⑤无管道内污染:
采用独特全封闭反应管及光电传导系统,无须顾及污染。
⑥结果重现性好:
定量动态范围高达五个数量级。
所以自从此项技术研制成功以来,受到许多科研工作者的重视并在多个领域得到应用。
2原理和方法
FQ-PCR的工作原理[1~4]是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性,在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。
该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交,探针的5’端标以荧光发射基因FAM(6-羧基荧光素,荧光发射峰值在518nm处),靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基若丹明,荧光发射峰值在582nm处),探针的3’开端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。
当探针保持完整时,淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。
发射基团一旦与淬灭基团发生分离,抑制作用被解除,518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。
复性期探针与模板DNA发生杂交,延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动,当移动到探针切断,淬灭作用被解除,荧光信号释放出来(见图)。
模板每复制一次,就有一个探针被切断,伴随一个荧光信号的释放。
由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系,因此用该技术可对模板进行准确定量。
实验仪器一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR扩增仪,也可用其它PCR仪。
如果用ABI7700型反应型反应系统进行实验,反应结束后,通过电脑分析,可直接给出定量结果。
如果用其他PCR仪,则需要同时使用荧光探测仪测量反应管中的荧光信号,计算出RQ+、RQ-、△RQ。
RQ+代表样品管荧光发射基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率,RQ-代表空白管中二者的比率,△RQ(△RQ=RQ+-RQ-)代表PCR过程中荧光信号变化量,经过数据处理,即可得出定量结果。
由于荧光探针的引入,显著提高了实验的特异性。
探针设计一般应符合以下条件[2]:
①探针长度应在20~40个碱基左右,以保证结合的特异性。
②GC碱基含量在40%~60%,避免单核苷酸序列的重复。
③避免与引物发生杂交或重叠。
④探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度,因此探针的Tm值要比引物的
Tm值至少高出5℃。
另外,探针的浓度、探针与模板序列的同源性,探针与引物的距离都对实验结果有影响。
图.TaqManPCR反应模式(A)聚合反应;(B)链置换;(C)裂解;(D)聚合完成(R:
FAM;Q:
TAMRA,FP:
上游引物;RP:
下游引物)
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荧光定量PCR技术及其应用
(二)
2007-1-415:
11:
33 信息来源:
来源网络
∙ 荧光定量PCR技术及其应用
(二)
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3应用
由于FQ-PCR具有高灵敏性,高特异性和高精确性的特点,目前,该项技术已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。
3.1病原体测定
由于PCR技术的问世,使得病原体检测能够快速而方便的进行。
但由于其高灵敏性,实验操作很容易受到污染而出现假阳性。
只要有微量病原体存在,PCR扩增即可为阳性结果,但并不能作为诊断依据,只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义,因此结模板定量显得特别重要。
常规PCR由于不能定量而限制了其应用,然而,PE公司研制的FQ-PCR技术给解决这一问题提供了可能。
目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。
Morris等[3]用FQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒(HCV)进行了研究。
测定显示,可测得的样品浓度相当于每毫升13个基因组。
与巢式PCR比较显示,FQ-PCR有着与巢式PCR相同的敏感性。
另外,还对48例临床丙型肝炎病人血清样品进行了测试,32例样品两种检测方法均为阳性,10例均为阴性;另有6例用两种方法测定的结果不一致。
该6例样品又让第三个实验室用巢式PCR方法重新测定,其结果与FQ-PCR测定的结果一致率为100%。
FQ-PCR技术在保持巢式PCR高度敏感性的同时又能提高效率,因此可作为一种检测HCV的有效方法。
同时,由于FQ-PCR可以测出血清中病原体浓度,故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据。
与宫颈癌及其癌前病变有关的人类乳头瘤病毒(HPV)有多种类型,以HPV-16、18、31、33、35等类型危险性最高。
Swan等[4]1997年用FQ-PCR技术对子宫阴道灌洗标本进行了研究。
他们发现,由于荧光探针的应用,对各型HPV的检测变得十分方便和准确。
由于HPV-16的特异引物可以和HPV-66的模板DNA发生错配,用一般PCR方法扩增时,如有HPV-66存在,即可扩增出HPV-66片段而发生误诊,但是HPV-16特异探针的应用使HPV-66在TaqMan系统中不能扩增。
因此,FQ-PCR对不同亚型的病毒检测具有高度特异性。
同时也发现FQ-PCR具有高度敏感性,用一般PCR方法检测不到的HPV模板浓度在TaqMan系统中却可检测到。
对于HPV-16、18、31、33、35类型敏感高达到每100~1000个细胞中含有一个拷贝的HPV基因组,平均每300个细胞中含有一个拷贝的HPV基因组。
以前常规检测大肠杆菌的方法,都是采用多种选择性培养基培养分离法,对产志贺氏毒素的大肠杆菌(SLTEC)缺乏特异性,因此这种菌株的检测又费时又困难。
后来又有应用抗体的免疫学方法和核酸序列测定的生化方法及以DNA扩增为基础的PCR方法等,都因为繁琐,需要大量的PCR后处理过程及不能对标本定量而受到限制。
美国Witham等[5]1996年将FQ-PCR技术应用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究。
针对不同血清变异型的大肠杆菌,他们设计应用不同的探针,从而提高了实验特异性。
他们同时还对探针相对于引物的位置、反应液中探针浓度、镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验,以提高实验的准确性和精确性。
由于TaqMan系统可以一次测量96管样品,还可对模板进行准确定量,又不需要进行电沪及EB染色后处理过程,实际应用方便,从而提高了实验的参考价值和应用价值。
因此该实验方法是食品检测方面的一个突破。
此外,加拿大Chen等[6]1997年也把FQ-PCR技术用于食品中沙门氏杆菌的检测研究。
在抗痨治疗开始后,结核病人痰中可持续存在有结核杆菌,为了研究结核病人痰标本DNA定量结果是否与有活力的结核杆菌数量相符合并监测治疗反应,1998年美国Desardin等[7]用FQ-PCR和竞争性PCR两种方法定量检测治疗期间连续收集的结核病人痰标本,结果显示两种方法有较好的重复性和准确性。
痰中结核杆菌DNA定量结果与抗酸染色显微镜下计数的结果一致。
3.2肿瘤研究
意大利Gelmini等[2]用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况。
他们以β-肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件,当扩增循环数在28~31之间时,△RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系。
他们在此条件下扩增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因,发现△RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系,虽然二者斜率不同,但是各个实验浓度下二者的△RQ之比却是恒定的。
说明尽管二者发光效率不同,却不影响定量效果。
为了检验FQ-PCR的准确性和对不同基因拷贝数的分辨率,他们将c-erbB-2基因的DNA样本用正常胎盘DNA做不同倍数稀释后进行实验,测得的结果与期望值高度相关(r=0.997)。
他们将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性(n=25,r=0.94,P〈0.01)。
1998年法国Bieche等[8]用FQ-PCR测定了108例乳腺癌标本。
他们选择扩增频率较高的myc、ccnd1和erbB2基因进行扩增,在108例标本中,发现10%的myc基因、23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷贝数增加,拷贝数增加的最大值分别为4.6、18.6、15.1。
同时他们又将这些数据与Southern印迹的结果进行比较,显示了较好的相关性。
3.3基因表达研究
由于TaqMan系统及荧光探针的应用,对mRNA的检测显得较以前常用的方法如Northern印迹、RT-PCR定量法要方便、快速、准确得多。
为了探测骨髓基质血小板生成因子(TPO)在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢(ITP)、再生障碍性贫血(AA)和特发性血小板多症(ET)等疾病过程中的病理生理意义,日本Hirayama等[9]用TaqManEZRT-PCR试剂盒在ABI7700反应系统测定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基质细胞TPOmRNA水平,又用ELISA方法测定了骨髓和末梢血的TPO浓度。
结果显示ITP和AA病人TPOmRNA水平明显升高,而ET病人的TPOmRNA水平则正常,经类固醇治疗后ITP病人TPOmRNA水平下降;骨髓TPO的浓度与其mRNA水平有相关性;在正常人和ITP病人,TPOmRNA表达水平与巨核细胞计数也有相关性。
这个实验对阐明TPO的作用提供了依据。
日本Shimokawa等[10]也用FQ-PCR技术对鼠成肌细胞系C2C12中肌肉调节因子的表达水平及动态变化进行了研究。
3.4免疫组份分析
对免疫T细胞群体V-β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段,可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行[11,12]。
流式细胞法是通过对细胞群体进行直接而方便的V-β表达方面的研究,但需要一整套单克隆抗体和大量细胞来进行染色分析,而且人类V-β特异性抗体尚不完备,因此该方法有许多不便之处。
如果用FQ-PCR方法,即不需要大量细胞,引物设计也很方便,而且已有多种定量方法,包括锚式PCR法、半定量PCR法、竞争性PCR法等[13,14],但都因PCR产物的后处理过程需凝胶电泳、EB染色和光密度测量等既费时,又降低了准确性,还增加了污染机会,使得FQ-PCR的应用受到限制。
1997年Lang等[15]用FQ-PCR技术进行实验,从而避免了这些问题,他们在反应系统中引入荧光探针,将下游引物与探针固定,然后,针对不同的V-β成份,选用特异的上游引物进行扩增,再对反应中产生的荧光信号进行处理,即可获得各个成份的数据。
3.5基因突变及多态性的研究
美国Ibrahim等[16]1997用FQ-PCR技术对正常痘病毒多态性进行了研究。
他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段结合的引物,并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针,用荧光标记后进行实验,顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。
该技术也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的单核苷酸变异多态的研究。
3.6其他方面
日本Isono[17]利用FQ-PCR进行叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系的研究。
他们以核基因Cab作为内参照,进行叶绿体基因rbc1拷贝数测定,结果发现子叶出现以后,叶绿体基因拷贝数显著增加,进而把叶绿体的基因拷贝数增加与光诱导的叶绿体成熟过程联系起来。
1998年美国Higgins等[18]还建立起一套用荧光探针检测鼠疫纤溶酶原激活基因(pla)的实验方法。
4结语
综上所述,FQ-PCR作为一种核酸定量技术,应用较多且较成熟的主要是在病原体检测方面,其优越性在此方面也得以充分体现。
因此将该项技术进一步开发应用于临床,具有很大潜力。
但是在遗传病和肿瘤研究方面,尤其是基因表达的研究,该技术目前应用的还较少,在此方面加强研究应用,将会有广阔的前景。
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实时荧光定量 PCR技术原理与应用
2007-1-3021:
18:
27 信息来源:
东胜创新技术通讯第200412期
∙ 实时荧光定量PCR技术原理与应用
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聚合酶链式反应(PCR)可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。
在扩增反应结束之后,我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析,也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。
无论定性还是定量分析,分析的都是PCR终产物。
但是在许多情况下,我们所感兴趣的是未经PCR信号放大之前的起始模板量。
例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。
在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。
所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR反应中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图(如图1)。
图1实时荧光扩增曲线图
一般而言,荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段:
荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,我们无法判断产物量的变化。
而在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加。
PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析。
为了定量和比较的方便,在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念:
荧光阈值和CT值。
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值(thresholdvalue)(如图2所示)。
图2.荧光定量标准曲线
CT值与起始模板的关系研究表明,每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值(如图3所示)。
因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
图3阈值线和CT值
荧光探针和荧光染料
实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种,探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加,非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。
前者由于增加了探针的识别步骤,特异性更高,但后者则简便易行。
1.SYBRGreenI
图4SYBRGREENI工作原理
SYBRGreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。
与双链DNA结合后,其荧光大大增强。
这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。
SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。
在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
图4.SYBRGREENI工作原理
SYBRGreenI在核酸的实时检测方面有很多优点,由于它与所有的双链DNA相结合,不必因为模板不同而特别定制,因此设计的程序通用性好,且价格相对较低。
利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质,通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体,因而可以、区分非特异扩增,进一步地还可以实现单色多重测定。
此外,由于一个PCR产物可以与多分子的染料结合,因此SYBRGreenI的灵敏度很高。
但是,由于SYBRGreenI与所有的双链DNA相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。
通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响1。
由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBRGreenI得到定量结果。
2.分子信标(molecularbeacon)
分子信标是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。
在此发夹结构中,位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。
在此结构中,荧光基团被激发后不是产生光子,而是将能量传递给淬灭剂,这一过程称为荧光谐振能量传递(FRET)。
由于"黑色"淬灭剂的存在,由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。
如果第二个荧光基团是淬灭剂,其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。
分子信标的茎环结构中,环一般为15-30个核苷酸长,并与目标序列互补;茎一般5-7个核苷酸长,并相互配对形成茎的结构。
荧光基团连接在茎臂的一端,而淬灭剂则连接于另一端。
分子信标必须非常仔细的设计,以致于在复性温度下,模板不存在时形成茎环结构,模板存在时则与模板配对。
与模板配对后,分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。
当荧光基团被激发时,它发出自身波长的光子(图5)。
图5.分子信标工作原理
3.TaqMan探针
TaqMan探针是多人拥有的专利技术。
TaqMan探针是一种寡核苷酸探针,它的荧光与目的序列的扩增相关。
它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。
荧光基团连接在探针的5’末端,而淬灭剂则在3’末端。
当完整的探针与目标序列配对时,荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。
但在进行延伸反应时,聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切,使得荧光基团与淬灭剂分离。
TaqMan探针适合于各种耐热的聚合酶,如DyNAzymeTMIIDNA聚合酶(MJResearch公司有售)。
随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。
因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。
图6.Taqman探针工作原理
4.LUXPrimers
LUX(lightuponextention)引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。
目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。
在没有单链模板的情况下,该引物自身配对,形成发夹结构,使荧光淬灭。
在没有目标片断的时候,引物与模板配对,发夹结构打开,产生特异的荧光信号(如图7)。
图7.LUX引物工作原理
与Taqman探针和分子信标相比,LUX引物通过二级结构实现淬灭,不需要荧光淬灭基团,也不需要设计特异的探针序列。
因为LUX引物是一个相对较新的技术,所以其应用还有待实践的检验。
实时荧光定量PCR技术的应用
实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。
运用该项技术,我们可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。
定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。
前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度;后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。
除此之外我们还可以对PCR产物或样品进行定性分析:
例如利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体,以区分非特异扩增;利用特异性探针进行基因型分析及SNP检测等。
目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。
其中最主要的应用集中在以下几个方面:
1.DNA或RNA的绝对定量分析。
包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测,RNAi基因失活率的检测等。
2.基因表达差异分析。
例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等),特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证
3.基因分型。
例如SNP检测,甲基化检测等。
随着实时荧光定量PCR技术的推广和普及,该技术必然会得到更广泛的应用。
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