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观察TFCS对痛风性肾病的调控机制
观察TFCS对痛风性肾病的调控机制
【摘要】目的:
研究中药玉米须总黄酮提取物(TFCS)对痛风性肾病模型大鼠肾脏血液灌注、肾脏功能、体液组成比例及肾脏组织形态的影响,探讨TFCS对痛风性肾病的调控机制。
方法:
灌服腺嘌呤联合乙胺丁醇(2.5:
1,350mg/kg)14天,建立尿酸性肾病大鼠模型,连续给予TFCS(1,2,4mg/kg)3周,检测模型动物血、尿中早期肾损害敏感指标中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾损伤分子1(KIM-1)、β2-微球蛋白(β2-MG)、尿酸(UA)、微量白蛋白(ALB)、尿素氮(BNU)、肌酐(CR)等含量及检测在体模型动物肾脏的血液灌注情况,体液组成成分比例,并制备肾脏病理切片,观察肾脏组织形态变化情况。
结果:
模型组动物尿液中NGAL、KIM-1、β2-MG、ALB检出量明显增加(P<0.05);血清中UA,BNU,Cr的浓度显著升高(P<0.05);肾脏血流灌注水平降低(P<0.05)。
玉米须总黄酮提取物1,2,4mg/kg组均可显著的降低模型大鼠尿液中NGAL、KIM-1、β2-MG、ALB的浓度(P<0.05);降低血清中UA,BNU,Cr的浓度(P<0.05);提高模型动物肾脏血液灌注水平(P<0.05);提高动物体内总含水量比率、细胞外液比例;降低脂肪含量百分比;病理组织观察可见给药组模型动物肾脏炎症明显减轻,肾小球体积趋于正常组,系膜轻度增生。
结论:
玉米须黄酮提取物能够降低模型动物体内尿酸、肌酐、尿素氮的浓度,降低尿液中β2-MG、ALB、NGAL、KIM-1的浓度,提高模型大鼠肾脏血液灌注水平;提高模型动物体内总含水量比率、细胞外液比例;降低脂肪含量百分比,修复模型动物肾脏损伤,进而对肾脏起到一定保护作用。
【关键词】玉米须黄酮提取物;尿酸性肾病;肾脏血液灌注;体液平衡
ObservetheregulatorymechanismofTFCSongoutnephropathy
【Abstract】ObjectiveInthisstudy,weinvestigatedtheeffectoftotalflavonesextractedfromstigmamaydis(TFSM)onrenalbloodperfusion,renalfunctionandnephrograminratswithgoutnephropathy.Exploretheregulationmechanismoftheextractionofflavonoidsfromcorn.Methods:
Weestablishedagoutynephropathyratmodelbyoraladministrationofadenineandethambutol(2.5:
1,350mg/kg)for2weeks,treatedthroughgastrogavageeitherwithTFSMatthreedifferentdoses(25,50,100mg/kg)for3weeks,thendetectsomesensitiveindexesofearlyrenaldamageinvolvesβ2-MG,NAG,UA,BNU,CR,TRF,ALBandRBPinbloodandurineofmodelanimals,Bloodperfusioninthekidneyswasdetected,andTherenalpathologicalsectionwaspreparedandthemorphologicalchangesofthekidneywereobserved.FinallytriedtoexplainhowTFSMaffectratswithgoutnephropathy.Results:
Theresultsshowedthatthedetectionofuricacidinthemodelanimalswasincreased,theconcentrationsofUA,BNUandCRintheserumofmodelanimalsweredecreased,whichindicatedthatTFSMcouldreducethelevelofuricacidinmodelanimalsandpromoterenalexcretionofuricacid.Atthesametime,thelowerconcentrationsofβ2-MG,NAG,TRF,ALB,RBPintheurineoftreatmentgroup,whichwasstatisticallysignificant,.Therenalbloodperfusionintheexperimentalanimalswassignificantlyimprovedandnormal.Thepathologicaltissueobservationshowedthattherenalinflammationoftheanimalmodelwassignificantlyreduced,andtheglomerularvolumetendedtobenormalandthemembranewasmildlyhyperplasia.Conclusion:
TheseresultsshowedthattheTFSMcouldregulatetheconcentrationofuricacidinthebodyofexperimentalanimals,improvethegoutkidneymodelratrenalbloodperfusion,andthustodamagethekidneysplayaprotectiverole.
【Keywords】StigmaMaydis;Hyperuricemia;Goutkidney;Bodyfluidequilibrium;RenalBloodPerfusion
尿酸性肾病是人体内尿酸水平升高和尿酸结晶在肾脏中沉积而造成的肾损害,一般在30岁以后发病,其比例约占85%[1-2]。
但是,随着人们饮食结构改变,大量高嘌呤食物的摄入,尿酸性肾病也在不断的低龄化。
高尿酸血症已经成为独立的危险因素逐渐侵蚀着人类的健康。
长期发作的痛风病患者很容易引起痛风性肾的发生,大约有1/2的痛风病人都会有显著的肾衰竭表现[3]。
特别是在发展中国家,高尿酸血症和痛风的发病几率逐年升高,而且也在逐渐的年轻化,高尿酸已经成为继高血脂、高血糖、高血压“三高”后,威胁人类大健康的“第四高”[4]。
本研究通过制备痛风性肾病模型评价TFCS对尿酸性肾病模型大鼠肾脏血流灌注情况、肾脏功能及其对损伤肾脏的保护作用。
进一步探索TFCS是否可以促进肾脏血流灌注,调节机体相关因子的水平,改善模型动物肾脏的损伤程度。
1材料
1.1实验动物:
SPF级Wistar雄性大鼠60只,体重180~220g,光照12h/12h明暗交替、温度(24±2)℃、相对湿70%条件下。
1.21.2实验仪器:
PeriCamPSI散斑血流成像仪(帕瑞医学,瑞典)、BS-400全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)、酶标仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)、UV2550分光光度计(日本岛津)、5810R离心机(德国艾本德)、病理切片机(莱卡,德国)
1.3药品与试剂:
玉米须总黄酮(TFCS)、别嘌醇片、乙胺丁醇、腺嘌呤;β2-MG、NGAL、KIM-1、ALB,酶联免疫试剂盒;UA、BUN、Cr检测试剂。
1.4玉米须总黄酮制备:
取玉米须药材加8倍量水煎煮3次,每次1小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩,离心30min,取上清液,以AB-8型大孔树脂纯化,湿法装柱,静置吸附2小时,先用5BV的盐酸(pH2)溶液洗脱,再用5BV的50%乙醇(pH10)洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩相对密度为1.05(80℃),再依次用乙酸乙酯和水饱和正丁醇分别萃取3次,合并提取液,回收溶剂,得提取物,紫外分光光度及测得总黄酮含量按芦丁计为58.17%[5]。
2方法
2.1造模与给药
60只Wistar大鼠适应性饲养一周后,除空白对照组10只外,其余50只大鼠每天灌服乙胺丁醇加腺嘌呤(250:
100mg/kg),连续灌胃14天,14d后,将大鼠放置代谢笼内,接取大鼠24h尿液,过滤、离心、取上清,检测动物尿液中早期肾损害指标Kim-1、NGAL,评价模型是否成功[6-8]。
模型制备成功后,将50只大鼠随机分为模型组、阳性药物组、给药1,2,4mg/kg量组,每组10只。
第15天开始模型组灌胃给予生理盐水10ml/kg/天,阳性对照组灌胃别嘌醇(5mg/kg),TFCS(高、中、低)剂量组分别灌胃给予TFCS混悬液(1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg),连续给药治疗15天,给药治疗第14天接取大鼠24小时尿液,离心、处理后酶联免疫法检测尿中β2-MG、NGAL、KIM-1、ALB。
第15天末次给药2小时后,戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉动物,进行在体肾脏血流监测,腹主动脉取血分离血清,检测血中尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cr)、尿酸(UA)。
摘取肾脏称重,计算肾重指数,多聚甲醛固定,制备病理切片,方法见2.1.2。
肾重指数=肾重/体重
2.1.1在体肾脏血流监测操作步骤
戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉动物,俯卧固定于手术台上,剪去肾脏所在区域的毛发,用手术剪将动物背部皮肤剪开,小心清理肾脏周围的组织,暴露肾脏,用散斑血流成像仪检测肾脏血流变化,检测高度8.5cm,检测面积4cm2,检测频率10张/秒,检测时间30秒。
(见示意图)
2.1.2动物体液检测方法
实验动物用戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉动物后,将头部、四肢和尾部展平,放到操作板上。
在大鼠鼻尖正中处用标号比标记作为电极插入的第一个位置,沿该标记2cm正中处,再标记第二个电极插入位置位置;同样的方法,在大鼠尾骨正中处标记第三个位置,沿第三个位置2cm出(尾部)标记第四个位置。
测量第二个标记与第三个标记之间的距离,作为大鼠体长。
打开仪器,连接电极,调节仪器相应参数。
用5号针头分别插入大鼠标记处,连接次序从第一个标记处开始电极连接分别为红、黄、蓝、黑。
输入大鼠体重、体长、年龄等相关参数,进行测量。
(见示意图)
2.1.3病理切片制备方法
取固定好的肾脏样本,再将样本加入梯度酒精中脱水,脱水后取出样本,二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片(厚度5μm)、脱蜡、苏木素-伊红染色、封片。
HE染色,观察肾脏组织病理变化,并依据Taal等方法进行病理半定量评分[TaalMW,Zandi-NejadK,WeeningB,etal.Proinflammatorygeneexpressionandmacrophagerecruitmentintheratremnantkidney[J].KidneyInt,2000,58(4):
1664-1676.]。
评分标准:
根据肾小球体积变化,系膜增生及基底膜增厚情况和炎性细胞浸润病变等情况分为无病变为0分,轻度病变为1分,中度病变为2分,重度病变为3分,累加各项评分的总分作为病理评分。
2.2生化分析
2.2.1血清、尿液生化指标分析
尿中β2-MG、NGAL、KIM-1、ALB用酶联免疫法检测,血清中UA、BUN、Cr采用全自动生化分析仪进行检测。
β2-MG、NGAL、KIM-1、ALB按照试剂说明书进行操作。
UA、ALB、Cr按照试剂说明书进行仪器参数设定检测。
2.3统计方法
实验数据均采用均数±标准差表示,应用SPSS20.0统计软件,多组间资料比较采用单因素方差分析,P<0.05为有统计学意义。
当正态性(及方差齐性)假设满足时,参数检验将被应用;方差不齐时用非参数检验。
3结果
3.1肾脏指数及表观形态
痛风性肾病动物模型肾脏水肿严重,肉眼观察表面有白色颗粒状斑点,无血色,体积较正常动物的肾脏大,给药组动物的肾脏较模型组体积有所减小,颜色趋于正常组,表面白色颗粒状斑点明显减少,脏器指数显示模型组的脏器指数最大,且与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05),给予TFCS各组脏器指数较模型组均有所降低,说明TFCS能够对痛风性肾病模型动物的肾脏起到一定的保护作用。
见表1,图1
表1.痛风性肾病模型动物各组肾脏指数变化情况(x±s,n=10)
组别
肾重指数×100
空白组
0.38±0.04
模型组
0.58±0.09++
阳性对照组
0.43±0.03**
4mg/kg
0.42±0.02**
2mg/kg
0.43±0.07**
1mg/kg
0.55±0.05
注:
与空白组比较+P<0.05,++P<0.01;与模型组比较*P<0.05,**P<0.01
图1TFCS对痛风性肾病大鼠肾脏器官的影响
注:
A:
空白组,B:
模型组,C:
阳性组,D:
高剂量组,E:
中剂量组,F:
低剂量组
3.2痛风性肾病模型动物血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Cr)、尿酸(UA)的含量
模型组动物血清中UA、Cr、BUN浓度均显著升高(P<0.05),玉米须总黄酮提取物给药高、中、低剂量组模型大鼠UA、Cr、BUN浓度较模型组均显著降低(P<0.05或P<0.01),以上指标提示TFCS能降低痛风性肾病模型动物血清中UA、CR、BUN的浓度,调节体内UA、CR、BUN指标的水平,维持体内动态平衡。
见表2
表2痛风性肾病模型动物各组血清中BUN、Cr、UA的含量变化情况(x±s,n=10)
Parameters
UA(μmol/l)
Cr(μmol/l)
BUN(mmol/l)
Blank
43.34±4.60
54.04±3.87
20.42±1.99
Control
54.03±2.58**
57.93±9.41*
21.74±2.15**
Modle
107.34±9.54++
98.93±5.97++
35.46±5.94++
4mg/kg
52.96±5.51**
76.24±9.12**
17.97±3.43**
2mg/kg
76.28±5.81**
90.81±8.48*
28.26±1.98*
1mg/kg
89.39±7.35**
92.05±9.03
30.16±2.13*
注:
与空白组比较+P<0.05,++P<0.01;与模型组比较*P<0.05,**P<0.01
3.3尿中β2-MG、KIN-1、ALB、NGAL
尿中β2-MG、ALB、NGAL、KIM-1指标能过反应出肾脏的早期肾损害程度[10],在肾脏早期肾损害的过程中,以上指标均有不同程度的改变,从本次研究中可以发现腺嘌呤联合乙胺丁醇造模2周后的各组大鼠,β2-MG、ALB、NGAL、KIM-1指标均比空白组有所升高(P<0.05)。
经过15天的给药治疗后,与给药前相比均有显著的治疗作用,TFCS高、中剂量组均能够显著降低β2-MG、ALB水平,且与模型组比较具有显著的统计学意义(P<0.01),尿中NGAL、KIM-1的含量变化能够反映出肾脏的损伤程度,本研究中给药治疗组高、中、低剂量组尿液中NGAL、KIM-1含量明显下降(P<0.05)。
以上结果表明TFCS能够改善由腺嘌呤联合乙胺丁醇所致大鼠痛风性肾病模型动物的肾脏损伤,同时可促进尿酸的排泄,减轻肾脏损伤程度。
见表3-4
表3模型动物各组尿中β2-MG、NAG、ALB的含量变化情况(x±s,n=10)
组别
β2-MG(mg/L)
ALB(mg/L)
给药前
给药后
给药前
给药后
空白组
5.46±1.26
5.08±0.71
6.62±1.58
5.50±4.79
阳性组
38.52±9.34
26.08±5.42*#
16.67±2.49
8.54±2.75*#
模型组
37.66±10.81
39.44±10.14+
16.46±2.21
17.81±2.81+
4mg/kg
39.28±11.95
22.82±6.67*#
17.05±4.37
8.73±3.71*#
2mg/kg
37.64±9.83
27.64±6.13*#
17.63±3.52
11.21±1.10*#
1mg/kg
38.24±10.19
32.72±8.32#
17.69±5.24
10.04±5.04*#
注:
*P<0.05与模型组比较;#P<0.05与给药前比较;+P<0.05与空白组比较。
表4模型动物各组尿中NGAL、KIM-1的含量变化情况(x±s,n=10)
组别
KIM-1(ng/L)
NGAL(ng/L)
给药前
给药后
给药前
给药后
空白组
17.95±1.34
18.35±2.32
76.81±7.15
84.23±9.61
阳性组
88.29±10.48
50.42±11.59*#
323.40±25.74
251.27±22.59*#
模型组
87.26±11.84
86.41±8.75
330.47±24.35
343.29±20.16
4mg/kg
87.06±8.71
48.58±13.26*#
328.51±22.84
246.52±21.05*#
2mg/kg
88.72±11.94
50.28±12.79*#
327.65±27.49
287.69±25.22*#
1mg/kg
87.57±12.37
58.13±10.07*#
329.44±26.85
277.33±17.63*#
注:
*P<0.05与模型组比较;#P<0.05与给药前比较。
3.4肾脏血流灌注
尿酸性肾病是体内过多的尿酸以尿酸结晶的形式沉积在肾脏导致的肾脏损害,其生理功能会显著降低,肾脏的血流量也会受到影响[11],通过检测肾脏血流的变化可以反映出药物对肾脏生理功能的影响。
本研究通过散斑血流成像仪对实验动物肾脏的血液灌情况进行评价,实验发现模型组肾脏血流灌注较空白组明显减低,三个剂量的给药组其肾脏血流灌注均有所提高(P<0.05)。
提示TFCS能够改善尿酸性肾病动物肾脏的血流变化,进而对损伤的肾脏有一定的保护作用。
见表5,图2。
表5痛风性肾病模型动物各组肾脏血流灌注变化(x±s,n=10)
组别
平均检测面积(mm2)
平均曲线下面积(PU*S)
平均灌注量
空白组
191.13±12.17
8971.45±338.27**
308.81±16.47**
模型组
196.30±11.47
6689.36±523.58
243.09±17.67
阳性组
193.91±11.02
7547.09±642.23**
275.23±16.05**
4mg/kg
197.76±17.70
8180.33±463.37**
283.08±12.89**
2mg/kg
193.89±10.17
7268.67±338.27**
276.22±16.47**
1mg/kg
196.11±10.34
6816.57±278.40
272.63±10.71**
注:
与模型组比较*P<0.05,**P<0.01
图2痛风性肾病模型动物各组肾脏血流灌注变化曲线
注:
每组动物监测时间为30S,横坐标为灌注时间(ms),纵坐标为灌注量(PU),图中的血流灌注图是各组1号动物肾脏血流最低灌注和最高灌注的对比图。
从灌注曲线可以发现空白组的平均灌注基线明显高于其他各组,而模型组平均灌注基线最低,给药组的平均灌注基线显著高于模型组,而且TFCS高剂量组平均灌注基线与空白组相当,这说明TFCS能够显著改善尿酸性肾病模型动物肾脏的低灌注情况,维持肾脏正常的生理功能。
3.5大鼠体液组成成分变化
TFCS高、中剂量组的动物体内总含水量比率较模型组比较升高(P<0.05),TFCS三个剂量组的细胞外液比例显著提高(P<0.01),脂肪含量百分比较模型组显著降低(P<0.01)。
这种结果说明TFCS能够调节尿酸性肾病模型动物的体液平衡,使动物体内总含水量、细胞内、外液达到稳态水平,进而对尿酸性肾病动物模型损伤的肾脏起到一定的修复作用。
另外我们发现给予腺嘌呤/乙胺丁醇的动物脂肪含量出现明显升高(模型组:
25.66±4.75%,空白对照组:
15.93±8.03%),且TFCS对尿酸性肾病模型动物有一定的降脂作用。
尿酸性肾病与脂肪含量是否正相关还须进一步的研究。
见表6、图6-3。
表6各组大鼠主要体组成成分含量变化情况(x±s,n=10)
组别
总含水量%
细胞外液百分比%
脂肪含量百分比%
模型对照组
54.41±3.48
41.09±1.12
25.66±4.75
空白对照组
61.54±5.88**
45.33±5.39*
15.93±8.03**
阳性对照组
54.92±2.23
45.54±1.72**
26.21±3.98
4mg/kg
60.49±4.68*
50.21±8.59**
18.23±7.81*
2mg/kg
58.59±2.69*
46.28±4.39**
19.95±3.67*
1mg/kg
55.71±4.01
46.39±2.86**
20.92±2.61*
注:
与模型组比较*P<0.05,**P<0.01
3.6肾脏形态学变化
病理切片可见,模型组肾脏内炎症显著,肾小球体积明显增大,系膜重度增生、基底膜弥漫性增厚。
阳性组肾脏炎症明显减轻,肾小球体积趋于正常组,系膜轻度增生。
高剂量组肾脏炎症显著减轻,肾小球体积较模型组显著减小,系膜轻度增生;中剂量组肾脏炎症显著减轻,肾小球体积较模型组减小,系膜中度增生、偶见基底膜增厚。
低剂量组较模型组肾脏炎症略微减轻,肾小球体积较模型组略小,系膜中度增生、基底膜弥漫性增厚。
见图3(100×)
TFCS对尿酸性肾病模型动物肾脏组织病理学评分(x±s,n=10)
组别
样本量(只)
总分
空白对照组
10
0.2±0.4**
模型对照组
10
6.1±0.8
阳性对照组
10
4.2±0.7**
4mg/kg
10
3.2±0.6**
2mg/kg
10
3.7±0.8**
1mg/kg
10
4.5±1.1*
注:
与模型组比较*P<0.05,**P<0.01
注:
病理图为各组1号动物肾脏HE染色病理图
图3TFCS对痛风性肾病模型动物肾脏的组织形态的影响(400×)
4讨论
尿酸性肾病是尿酸水平升高及其结晶沉积与
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- 观察 TFCS 痛风 肾病 调控 机制