基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素宝典.docx
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基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素宝典.docx
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基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素宝典
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典]
基因丄程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的丄艺
一,背景知识
1,基因工程
科技名词定义
中文名称:
基因工程
英文名称:
geneticengineering:
geneengineering
其他名称:
重组脱氧核糖核酸技术(recombinantDNAtechnique)定义1:
狭义的基因工程仅指用体外重组D\A技术去获得新的重组基因;广义的基因工程则指按人们意愿设讣,通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。
如用重组DYA技术,将外源基因转入大肠杆菌中表达,使大肠杆菌能够生产人所需要的产品;将外源基因转入动物,构建具有新遗传特性的转基因动物;用基因敲除手段,获得有遗传缺陷的动物等。
定义2:
将在体外进行修饰、改造的脱氧核糖核酸分子导入受体细胞中进行复制和表达的技术。
扩充:
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用,包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组D\A技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
一个完整的、用于生产H的的基因工程技术程序包括的基本内容有:
(1)外源口标基因的分离、克隆以及口标基因的结构与功能研究。
这一部分的工作是整个基因工程的基础,因此乂称为基因工程的上游部分;
(2)适合转移、表达载体的构建或LI标基因的表达调控结构重组;(3)外源基因的导入;(4)外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选;(5)外源基因表达产物的生理功能的核实;(6)转基因新品系的选育和建立,以及转基因新品系的效益分析;(7)生态与进化安全保障机制的建立;(8)消费安全评价。
基本操作步骤(上游技术)
提取LI的基因
获取LI的基因是实施基因工程的笫一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因,种子的贮藏蛋白的基因,以及人的胰岛素基因干扰素基因等,都是LI的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的LI的基因,是十分不易的。
科学家们经过不懈地探索,想岀了许多办法,其中主要有两条途径:
一条是从供体细胞的D\A中直接分离基因;另一条是人工合成基因。
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”,乂叫“散弹射击法”。
鸟枪法的具体做法是:
用限制酶将供体细胞中的DYA切成许多片段,将这些片段分别载入运载体,然后通过运载体分别转入不同的受体细胞,让供体细胞提供的D\A(即外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增),从中找出含有LI的基因的细胞,再用一定的方法把带有LI的基因的DM片段分离出来。
如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用鸟枪法获得U的基因的优点是操作简便,缺点是工作量大,具有一定的盲H性。
乂由于真核细胞的基因含有不表达的DYA片段,一般使用人工合成的方法。
LI前人工合成基因的方法主要有两条。
一条途径是以L1的基因转录成的信使RNA为模版,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的作用下合成双链D\A,从而获得所需要的基因。
另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列,推测出相应的信使RNA序列,然后按照碱基互补配对的原则,推测出它的基因的核昔
酸序列,再通过化学方法,以单核昔酸为原料合成LI的基因。
如人的血红蛋口基因胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。
LI的基因与运载体结合
基因表达载体的构建(即LI的基因与运载体结合)是实施基因工程的笫二步,也是基因工程的核心。
将U的基因与运载体结合的过程,实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。
如果以质粒作为运载体,
首先要用一定的限制酶切割质粒,使质粒出现一个缺口,露出黏性末端。
然后用同一种限制酶切断LI的基因,使其产生相同的黏性末端(部分限制性内切酶可切割出平末端,拥有相同效果)。
将切下的LI的基因的片段插入质粒的切口处,首先碱基互补配对结合,两个黏性末端吻合在一起,碱基之间形成氢键,再加入适量DNA连接酶,催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键,从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来,形成一个重组D\A分子。
如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒D\A分子结合,形成重组
DNA分子(也叫重组质粒)的。
将LI的基因导入受体细胞
将U的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。
U的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后,下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。
基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌,枯草杆菌,土壤农杆菌,酵母菌和动植物细胞等。
用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞,主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
例如,如果运载体是质粒,受体细胞是细菌,一般是将细菌用氯化钙处理,以增大细菌细胞壁的通透性,使含有LI的基因的重组质粒进入受体细胞。
LI的基因导入受体细胞后,就可以随着受体细胞的繁殖而复制,山于细菌的繁殖速度非常快,在很短的时间内就能够获得大量的LI的基因。
LI的基因的检测和表达
LI的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过检测与鉴定才能知道。
这是基因工程的笫四步工作。
以上步骤完成后,在全部的受体细胞中,真正能够摄入重组D\A分子的受体细胞是很少的。
因此,必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了LI的基因进行检测。
检测的方法有很多种,例如,大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因,当这种质粒与外源D\A组合在一起形成重组质粒,并被转入受体细胞后,就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了U的基因。
重组DNA分子进入受体细胞后,受体细胞必须表现出特定的性状,才能说明LI的基因完成了表达过程。
2,糖尿病
糖尿病(diabetes)是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋口质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征。
临床上以高血糖为主要特点,典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现,即“三多一少”症状,糖尿病(血糖)一旦控制不好会引发并发症,导致肾、眼、足等部位的衰竭病变,严重者会造成尿毒症。
糖尿病人应常煮紫芝水喝,来控制血糖,预防并发症。
3,胰岛素
科技名词定义
中文名称:
胰岛素
英文名称:
insulin
定义:
胰腺朗格汉斯小岛所分泌的蛋口质激素。
lllA、B链组成,共含51个氨基酸残基。
能增强细胞对葡萄糖的摄取利用,对蛋白质及脂质代谢有促进合成的作用。
性质
K英文》Insulin
显微镜下的胰岛beta细胞
K化学本质》蛋口质
K分子式》C257H383N65077S6
K分子量》5807.69
K性状》白色或类白色的结晶粉末
K熔点》233?
(分解)
K比旋度》-64?
?
8?
(C二2,0.003mol/LNaOH)
K溶解性》在水、乙醇、氯仿或乙瞇中儿乎不溶;在矿酸(无机酸)或氢氧化碱溶液中易溶
K酸碱性II两性,等电点PI5.35-5.45
结构
不同种族动物(人、牛、羊、猪等)的胰岛素功能大体相同,成分稍有差异。
图中为人胰岛素化学结构。
胰岛素由A、B两个肽链组成。
人胰岛素(InsulinHuman)A链有11种21个氨基酸,B链有13种30个氨基酸,共26种51个氨基酸组成。
其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的疏基形成两个二硫键,使A、B两链连接起来。
此外A链中A6(Cys)与All(Cys)之间也存在一个二硫键。
品种
按来源不同分类
1、动物胰岛素:
从猪和牛的胰腺中提取,两者药效相同,但与人胰岛素相比,猪胰岛素中有1个氨基酸不同,牛胰岛素中有3个氨基酸不同,因而易产生抗体。
2、半合成人胰岛素:
将猪胰岛素笫30位丙氨酸,置换成与人胰岛素相同的苏氨酸,即为半合成人胰
岛素。
3、生物合成人胰岛素(现阶段临床最常使用的胰岛素):
利用生物工程技术,获得的高纯度的生
物合成人胰岛素,其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。
功能
胰岛素能促进全身组织对葡萄糖的摄取和利用,并抑制糖原分解和糖原异生,因此,胰岛素有降低血糖的作用。
促进肌肉、脂肪组织等处的靶细胞细胞膜载体将血液中的葡萄糖转运入细胞。
通过共价修饰增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高cGMP浓度,从而使糖原合成酶活性
增加、磷酸化酶活性降低,加速糖原合成、抑制糖原分解。
,通过激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶而使丙酮酸脱氢酶激活,加速丙酮酸氧化为乙酰辅酶A,加快糖的
有氧氧化。
通过抑制PEP竣激酶的合成以及减少糖异生的原料,抑制糖异生。
,抑制脂肪组织内的激素敬感性脂肪酶,减缓脂肪动员,使组织利用葡萄糖增加。
二,基因工程大肠杆菌生产重组人胰岛素的步骤1,提取LI的基因
本工艺的U的基因采用人工合成的方法,以U的基因转录成的信使RNA为模版,反转录成互补的单链DM,然后在酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需要的基因。
具体的操作步骤如下:
取材:
人胰腺细胞
试剂:
DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿,异丙醇,无水乙醇,
0.05,0.1,DEPC,H2O,75,乙醇,
TE缓冲液,琼脂糖。
提取方法:
TRIzol抽提法
(异硫氛酸弧/酚,TRNzol总RNA提取试剂)
TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后,样品中的D\A和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
共纯化D\A对于样品间标准化RNA的产量十分有用
操作步骤详解:
(1),获取所有的mRNA。
a(样品处理:
A:
培养细胞:
收获细胞1-5X107,移入1.5ml离心管中,加入1ml
Trizol,混匀,室温静置omin。
B:
组织:
取50-100mg组织(新鲜或-70?
及
液氮中保存的组织均可)置l・5nil离心管中,加入lmlTrizol充分匀浆,室温静
宜,mmo
b(加入0.2ml氯仿,振荡15s,静置2min。
c(4?
离心,12000gXlomin,取上清。
d(加入0・5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置lOmin。
e(4?
离心,
12000gXlOmin,弃上清。
f(加入lml75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。
4?
7500gX5min,弃上清。
g.晾干,加入适量的DEPCH20溶解(65?
促溶10-15min)。
(2),mRNA的分离。
方法:
分离的总RNA可利用mRNA3,端含有poly(A)的特点,用。
ligo(dT)纤维
素柱分离,当RNA流经。
ligo(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在。
ligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸憎水中,mRNA被洗下。
然后经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。
纯化的mRNA在70%乙醇中-70?
可保存一年以上。
试剂:
IX柱层析加样缓冲液:
20mmol/LTris.Cl,pH7.6;0.5mol/LNaCl;lmmol/L
EDTA,pH8.0;0.1%SDS.
灭菌洗脱缓冲液:
10mmol/LTris.Cl,PH7.6;lmmol/LEDTA,pH8.0:
0.05%SDS.
步骤:
A.用lml0.lmol/LNaOH悬浮500mgoligo(dT)纤维素.用lml0.lmol/L
NaOH悬浮500mg
oligo(dT)纤维素・
B.将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌喊玻璃棉的巴斯德吸
管中,柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
C.用IX柱层析加样缓冲液冲洗柱床,知道流出液的pH值小于8.0。
D.将提取的总RNA液于65?
温育5分钟后迅速冷却至室温,加入等体积2X柱层析缓冲液,上样,
立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后,加入1倍柱床体积的IX柱层析加样
溶液。
E.测定每一管的0D260,当洗出液中0D为0时,加入2〜3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液,以1/3
至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
F.测定0D260,合并含有RNA的洗脱组分。
G.加入1/10体积的3mol/LNaAC(pH5.2)、2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20?
放置30分钟。
H.4?
下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4?
下12000g离心5分
钟。
I.小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟。
J.用少量水溶解RNA液,即可用于CDNA合成(或保存在70%乙醇中并贮存于-70?
中)。
(3),分离LI的mRNA。
将RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳
9,1RNA样品
2〜3,1上样液轻轻混匀,
上样
电泳:
120伏,10,20分钟
,注意:
电泳槽的清洁及新的电泳液〜
琼脂糖凝胶要新鲜配制〜
紫外透射仪观察电泳结果
(4),逆转录。
以mRNA为模板的D\A聚合酶,形成与RNA碱基相互补D\A链,后者称为互补DNA,
cDNAo
RNAaseH的活性:
切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。
⑸,PCR扩增。
在一微量离心管中依次加入下列试剂:
cDNA4,110,PCRbuffer(含MgC12)5,1
dNTPs(lOmmol/L)1,1
5'引物(10,mol/L)1,1
3'引物(10,mol/L)1,1
去离子水(补足反应体系)39,1
TaqDNApol.(2U/,1)1,1
轻弹管底混合(用离心机甩一下)
PCR仪设定的反应条件:
94?
C45SDNA变性
55?
C45SDNA复性
72?
C1min产物链延伸
25-30个循环后72?
ClOmin
2,口的基因与运载体结合
载体:
pBR322
工具酶:
BamH?
>T4DNA连接酶。
操作步骤详解:
首先,用BamH?
酶来切pBR322以产生这个酶的特异性黏性末端。
同时用PBR322酶切割外源DM使其产生同样的黏性末端。
然后,通过T4DM连接酶连接切割过的载体和外源DNA片段。
山于载体和外源DNA上的黏性末端会立刻配对,DNA连接酶封闭切口,使两个DNA分子共价连接。
3,将LI的基因导入受体细胞
(1),受体细胞的预处理:
氯化钙处理。
氯化钙法转化细胞的原理是细菌处于0?
及CaC12低渗溶液中时,菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的疑基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42?
短时间热击处理促进细胞吸收DNA复合物。
(2),大肠杆菌感受态细胞重组质粒的转化。
a,取100微升感受态细胞,加入相当于50ng载体的重组连接液,混匀;b,冰浴放置半小时;
c,在42摄氏度保留两分钟;
d,快速将转化细胞转移至冰浴中放置1到2分钟;
e,加入1毫升培养基,于37摄氏度培养一小时;,4,目的基因的检测和表达上面两个步骤得到的不可能全是我们所需要的重组子,所以我们要对获得的细
胞进行检测与表达,来找到我们需要的重组子。
在上面的步骤中,我们会得到自身连接的质粒、自身连接的插入子以及重组子形成的混合物。
在这个实验中,我们用了有两种抗性标记的PBR322,—种抗性标记用来正选择转化子,列一种通过插入失活而可以鉴定重组子。
本实验中,如果氨茱青霉素平板上出现的菌落必定是获得了质粒的转化子,在此基础上,如果氨节青霉素抗性转化子乂抗四环素,那么此转化子的质粒是空载体;若氨节青霉素抗性转化子对四环素敬感,则说明在载体中有外源片段插入而使四环素抗性基因失活,这就是我们需要的重组子。
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