专题2 实验突破二生物 人教版 选择性必修3新标准渝辽苏闽湘鄂京津鲁琼.docx
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实验突破二 多聚酶链式反应扩增DNA片段
一、原理
1.PCR技术:
即多聚酶链式反应,是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。
它能以极少量的DNA为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
2.引物:
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3′端延伸DNA链,因此,DNA复制需要引物。
3.合成方向:
总是从子链的5′端向3′端延伸。
4.原理:
DNA的热变性原理,即:
5.条件
二、步骤
1.实验用具
名称
作用
PCR仪
自动调控温度,实现DNA的扩增
微量离心管
实际上是进行PCR反应的场所
微量移液器
用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体,每吸取一种试剂后,其上的枪头都必须更换
2.实验步骤
准备:
按照PCR反应需要的物质和条件,将需要的试剂和仪器准备好
↓
移液:
用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各试剂
↓
混合:
盖严离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管的侧壁,使反应液混合均匀
↓
离心:
将微量离心管放在离心机上,离心约10s,使反应液集中在离心管底部
↓
反应:
将离心管放入PCR仪中进行反应
3.DNA含量的测定
(1)测定原理:
DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,峰值的大小与DNA含量有关。
(2)计算方法:
DNA含量(μg/mL)=50×(260 nm的读数)×稀释倍数。
1.PCR扩增DNA的过程中是否还需要解旋酶?
提示 不需要。
2.PCR循环之前,常要进行一次预变性,预变性的目的是什么?
提示 预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。
3.PCR实验中离心的目的是什么?
在离心的过程中,微量离心管的盖子一定要盖严的原因是什么?
提示 离心的目的是使反应液集中在离心管底部,提高反应效率。
微量离心管的盖子一定要盖严,防止实验中脱落或液体外溢。
4.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌,为什么这样操作?
还有哪种操作与此目的相同?
提示 为避免外源DNA等的污染。
在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。
5.如何判断DNA扩增成功?
提示
(1)可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。
(2)电泳检测的方法,可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中,正确的是( )
A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从5′端延伸DNA链
B.DNA复制不需要引物
C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D.PCR扩增的对象是氨基酸序列
答案 C
解析 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3′端延伸DNA链,故DNA复制需要引物,A、B错误;引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合,C正确;PCR扩增的对象是DNA,不是氨基酸序列,D错误。
2.(2019·江西赣州月考)下列有关PCR技术的叙述,不正确的是( )
A.多聚酶链式反应,是用DNA聚合酶在体外扩增DNA片段的技术
B.在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似
C.PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行,只需提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸即可
D.PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为变性、复性和延伸三步
答案 C
解析 多聚酶链式反应是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,A正确;在用PCR技术扩增DNA片段时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似,B正确;PCR反应进行时,需要在一定的缓冲溶液中才能进行,需提供DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶,同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行,C错误;PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为变性、复性和延伸三步,D正确。
3.下列关于PCR操作过程的叙述,错误的是( )
A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌
B.PCR缓冲液和酶应分装成小份,在-20℃储存
C.PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化
D.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换
答案 C
解析 PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌,A正确;PCR缓冲液和酶应分装成小份,在-20℃储存,B正确;PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出来之后,应放在冰块上缓慢融化,这样才能使缓冲液中稳定性较差的成分和酶的活性不被破坏,C错误;在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,D正确。
4.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题,而被广泛应用,与细胞内的DNA复制相比,PCR可以快速扩增所需的DNA片段。
请分析回答下列有关问题:
(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA,而PCR技术中的解旋原理是
。
(2)此过程需要一种TaqDNA聚合酶。
该酶是从 中分离的。
(3)与普通DNA聚合酶相比,TaqDNA聚合酶具有的特性是 。
(4)与体内DNA复制相比较,PCR反应要在 中才能进行,并且要严格控制 条件。
(5)PCR中加入的引物有 种,加入引物的作用是 。
答案
(1)DNA的热变性原理
(2)水生耐热细菌Taq (3)耐高温 (4)一定的缓冲溶液 温度 (5)两 作为DNA复制的起点
解析
(1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开,从而完成解旋,其原理是DNA的热变性原理。
(2)TaqDNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。
(3)与普通DNA聚合酶相比,TaqDNA聚合酶在90℃以上的环境中不变性,具有耐高温的特性。
(4)PCR反应需要适宜的温度和pH,因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行,并需严格控制好温度条件。
(5)PCR需要两种引物,引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。
PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA,作用是引导DNA复制,可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键,成为DNA复制的起点。
题组一 PCR技术
1.(2019·广东广州测试)下列有关PCR的叙述,正确的是( )
A.PCR反应所需要的引物只是RNA
B.PCR反应所需要的原料是核糖核苷酸
C.PCR反应所需要的酶在60℃会变性
D.PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行
答案 D
解析 PCR反应所需要的引物是一小段DNA或RNA,A错误;PCR要合成的是DNA,所以需要的原料是脱氧核苷酸,B错误;PCR所需的酶至少要耐受DNA变性时的温度,即90℃以上的温度,C错误;酶发挥作用需要一定的pH等条件,因此需要缓冲溶液,D正确。
2.(2019·河北唐山校级月考)DNA的复制需要引物,主要原因是( )
A.可加快DNA的复制速度
B.引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合
C.引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链
D.DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链
答案 D
解析 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3′端延伸DNA链。
因此,DNA的复制需要引物。
3.(2018·河南安阳高中段考)PCR利用了DNA的热变性原理,PCR仪实际上也是一种能自动调控温度的仪器。
下列有关PCR过程中“温度的控制”的说法,错误的是( )
A.PCR反应需要高温,这是为了确保模板是单链
B.延伸的温度必须高于复性温度,而低于变性温度
C.要用耐高温的DNA聚合酶
D.需要耐高温的解旋酶
答案 D
解析 PCR是体外DNA扩增技术,DNA双链的解开不需要解旋酶,而是通过高温使其变性解聚。
题组二 PCR的实验操作
4.PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器,它调控不同温度的目的是( )
①95℃,使DNA分子变性,失去生物活性
②95℃,使DNA分子变性,解开双螺旋
③55℃,使DNA分子开始复制、延伸
④55℃,使引物与DNA单链结合
⑤72℃,使DNA分子开始复制、延伸
⑥72℃,使DNA分子恢复双螺旋结构,恢复活性
A.①③⑤B.②③⑤C.②④⑤D.②④⑥
答案 C
解析 在PCR的反应过程中,当温度上升到90℃以上时,DNA分子变性,解开双螺旋结构;温度下降到50℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合;温度上升到72℃左右,DNA分子开始复制、延伸,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链,故②④⑤正确。
5.下列有关DNA含量测定的叙述,错误的是( )
A.可利用DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰这一特点来进行DNA含量的测定
B.测定时通常需要对样品进行稀释
C.直接将样品放在波长260nm处,测定其光吸收值
D.可利用“DNA含量=50×光吸收值×稀释倍数”来计算样品的DNA含量
答案 C
解析 对样品进行测定前要以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计的读数调节至零,而不能直接测定样品的光吸收值。
6.(2018·北京密云测试)以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图。
据图分析,下列说法正确的是( )
A.催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶,都能耐高温
B.催化①过程的酶是RNA聚合酶
C.④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
D.如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%,则一个双链DNA中,A与U之和也占该DNA碱基含量的40%
答案 C
解析 图中②⑤过程为DNA复制,这两个过程都需要DNA聚合酶的催化,其中催化⑤过程的DNA聚合酶能耐高温,但催化②过程的酶不耐高温,A错误;①为逆转录过程,该过程需要逆转录酶的催化,B错误;④为复性过程,发生的变化是两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合,C正确;根据碱基互补配对原则A—T,U—A,如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%,则一个双链DNA中,A与T之和也占该DNA碱基含量的40%,DNA分子中不含碱基U,D错误。
7.(2019·合肥一六八中学月考)利用PCR技术将某DNA分子扩增n代的过程中,下列叙述错误的是( )
A.引物越短,PCR扩增出来的非目标DNA就越多
B.适温延伸过程中,需要提供ATP
C.引物中G/C含量越高,复性温度越高
D.共有(2n-1)对引物参与子代DNA分子的合成
答案 B
解析 引物越短越有可能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应,引物越短,PCR技术扩增出来的非目标DNA就越多,A正确;PCR技术扩增DNA的适温延伸过程中,不需要提供ATP,B错误;引物中G/C含量越高,DNA模板中G/C含量越高,高温变性的温度就越高,复性温度也越高,C正确;PCR技术的原理是DNA复制,共有(2n-1)对引物参与子代DNA分子的合成,D正确。
8.(2018·山东济南校级月考)如图为PCR中DNA变性和复性示意图,下列相关说法正确的是( )
A.箭头向右的过程为加热(80~100℃)后DNA变性的过程
B.箭头向左的过程是迅速降温后DNA复性的过程
C.DNA变性与DNA在人体内解旋的条件、实质都相同
D.图中DNA双链片段共有4个游离的磷酸基团、4个3′端
答案 A
解析 题图箭头向右的过程为加热(80~100℃)后DNA变性的过程,即高温变性,使DNA解旋,A正确;箭头向左的过程是缓慢冷却后,DNA复性的过程,B错误;PCR中DNA变性不需要解旋酶,高温条件下氢键断裂,双链解开;DNA在人体内解旋需要解旋酶,在常温条件下进行,C错误;图中DNA双链片段共有2个游离的磷酸基团、2个3′端,D错误。
9.(2018·天津和平期末)用PCR技术特异性地拷贝“X基因”,两种引物及其与模板链的结合位置如图所示。
经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子,下列叙述错误的是( )
A.第一轮复制得到2个DNA分子,即①②各一个
B.第二轮复制得到4个DNA分子,即①②③④各一个
C.第三轮复制得到8个DNA分子,其中有2个是等长的,也就是有2个X基因
D.第四轮复制得到16个DNA分子,其中有4个X基因
答案 D
解析 第一轮复制得到2个DNA分子,即①和②各一个,A正确;第二轮复制得到4个DNA分子,①复制得到①和③,②复制得到②和④,故得到①②③④各一个,B正确;第三轮复制得到8个DNA分子,①复制得到①和③,③复制得到③和⑤,②复制得到②和④,④复制得到④和⑤,故得到①②各一个,③和④各两个,⑤两个且等长,即2个X基因,C正确;第四轮复制得到16个DNA分子,①复制得到①和③,②复制得到②和④,两个③复制得到两个③和两个⑤,两个④复制得到两个④和两个⑤,两个⑤复制得到四个⑤,故第四轮复制得到的16个DNA分子中有8个X基因,D错误。
10.(2019·银川第一中学模拟)用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增,设计了引物Ⅰ、Ⅱ,其连接部位如图所示,X为某限制酶识别序列。
扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的( )
答案 D
解析 利用PCR技术将DNA分子中的A1片段扩增时,当引物与母链通过碱基互补配对结合后,子链延伸总是从5′端到3′端。
11.(2019·广东江门模拟)如图为利用PCR技术检测受检人是否携带HIV(属于逆转录病毒)的示意图。
请回答下列问题:
(1)HIV的遗传物质的单体是 。
HIV携带者体内的T细胞的核DNA能指导合成HIV的蛋白质,原因是 。
(2)设计图中所示的引物时,应满足的要求:
①引物自身不能存在碱基互补配对序列,原因是避免引物自身通过折叠形成双链区;②引物之间不能存在 ,原因是避免两引物结合成双链;③引物只能和HIV逆转录形成的 碱基互补配对。
(3)在PCR反应体系中,除具备缓冲液、模板DNA分子和引物外,还应有 (选填编号)。
①TaqDNA聚合酶 ②逆转录酶 ③4种脱氧核苷酸 ④4种碱基 ⑤氨基酸
答案
(1)核糖核苷酸 HIV的RNA逆转录出的DNA能整合到T细胞的核DNA中,且能被正常转录、翻译
(2)②碱基互补配对序列 ③DNA序列 (3)①③
解析
(1)HIV的遗传物质是RNA,组成RNA的单体是核糖核苷酸。
由于HIV的RNA逆转录出的DNA能整合到HIV携带者体内T细胞的核DNA上,且能被正常转录、翻译,所以HIV携带者体内T细胞的核DNA能指导合成HIV的蛋白质。
(2)设计图中所示的引物时,应满足的要求:
①引物自身不能存在碱基互补配对序列,原因是避免引物自身通过折叠形成双链区;②引物之间不能存在碱基互补配对序列,原因是避免两引物结合成双链;③引物只能和HIV逆转录形成的DNA序列碱基互补配对。
(3)在PCR反应体系中,除具备缓冲液、模板DNA分子和引物外,还应有TaqDNA聚合酶、4种脱氧核苷酸等。
12.PCR是多聚酶链式反应的缩写,利用PCR技术可对目的基因进行扩增。
请回答下列有关问题:
(1)PCR的原理是 。
(2)PCR技术使DNA解链是通过 实现的。
(3)DNA解链后冷却的目的是让 与 相结合。
(4)当温度加热至70~75℃时, 酶把单个脱氧核苷酸通过形成 键连接到引物上。
如此逐渐延伸形成互补链,进而使目的基因加倍。
(5)通过重复循环
(2)(3)(4)过程,经过n次循环需要 个引物。
答案
(1)DNA复制
(2)高温加热 (3)引物 互补DNA链 (4)热稳定DNA聚合 磷酸二酯
(5)2n+1-2
解析
(1)PCR的原理是DNA复制。
(2)PCR技术通过高温加热使DNA解链,DNA的这种解链现象在一定的条件下是可逆的,即降低温度后能复性。
(3)DNA解链后冷却的目的是让引物与互补DNA链相结合,形成局部双链。
(4)当温度加热至70~75℃时,热稳定DNA聚合酶把单个脱氧核苷酸通过形成磷酸二酯键连接到引物上。
(5)通过重复循环
(2)(3)(4)过程,经过n次循环形成的子代DNA分子有2n+1条单链,只有原来的2条链不需要引物,所以经过n次循环需要2n+1-2个引物。
13.(2018·甘肃河西五市模拟)RT-PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术,具体过程如图所示:
(1)过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、 、 和引物A等。
(2)过程Ⅱ首先要将反应体系的温度升高到95℃,其目的是 ,该反应体系中所用的TaqDNA聚合酶至少应能耐受 ℃高温。
(3)过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增,理论上至少需要 个引物B。
(4)RT-PCR过程中主要借助对 的控制,影响酶的活性,从而使得化学反应有序高效地进行。
(5)利用RT-PCR技术获取的目的基因 (填“能”或“不能”)在物种之间交流;该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测,可提高检测的灵敏度,原因是 。
答案
(1)RNA提取物 逆转录酶
(2)让逆转录酶变性失活、使mRNA-cDNA杂合双链解开 95
(3)2n-1
(4)温度
(5)能 增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度),便于检测
解析
(1)过程Ⅰ是由mRNA形成cDNA的过程,表示逆转录,需要加入缓冲液、原料、RNA提取物、逆转录酶和引物A等。
(2)过程Ⅱ首先要将反应体系的温度升高到95℃,其目的是让逆转录酶变性失活、使mRNA-cDNA杂合双链解开,该反应体系中所用的TaqDNA聚合酶至少应能耐受95℃高温。
(3)过程Ⅱ拟对单链cDNA进行n次循环的扩增,理论上至少需要2n-1个引物B。
(4)RT-PCR过程中主要借助对温度的控制,影响酶的活性,从而使得化学反应有序高效地进行。
(5)利用RT-PCR技术获取的目的基因能在物种之间交流;该技术还可用于对某些微量RNA病毒的检测,可提高检测的灵敏度,原因是增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度),便于检测。
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