检验科真菌实验室sop文件.docx
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检验科真菌实验室sop文件
1.临床微生物实验室(细菌室和真菌室)工作制度
2.真菌实验室的质控
3.细菌、真菌室污染物处理原则
4.真菌实验室的消毒
5.真菌实验室的灭菌
6.检验科真菌室检验项目
7.浅表真菌的收集及检查
8.真菌培养、药敏及鉴定
9.标本的收集
10.标本的显微镜检
11.真菌培养
12.病原性酵母菌常用鉴定方法
13.蠕行螨的取材及检查
14.疥螨的取材及检查
15.头虱的取材及检查
16.体虱的取材及检查
17.阴虱的取材及检查
18.常用培养基的制备
真菌实验室的灭菌
1.玻璃器具的灭菌方法:
(1)检查、接种真菌用过的玻璃器具如试管、平皿、载玻片、盖玻片、
吸管等应高压蒸汽灭菌。
(2)灭菌后,清洗内容物。
(3)再用清洗液浸泡,或用肥皂水刷洗。
(4)最后用流动水将清洗液或肥皂水冲洗干净,烘干备用。
(5)制备无菌培养基也可采用高压蒸汽灭菌。
(6)制备无菌的培养基、玻片、盖片最好采用干热灭菌,放入烘箱
内,使温度逐渐上升至150-160度,保持2小时,关闭电源,使其缓慢冷却,如果采用高压蒸汽灭菌,应用多层报纸或棉垫包好、包严、以便取出后仍保持无菌。
(7)以灭菌的2周内有效,超过2周的应重新灭菌后方可使用
2.室内灭菌法:
(1)40%甲醛熏蒸法:
加热或在高锰酸钾中加入甲醛,是之放出甲醛
气体,空间密封24小时,50gKMnO4+100ml甲醛。
(2)乳酸熏蒸法:
2份乳酸加1份水置于干锅内混均后,将干锅放
在铁架台上,下面用酒精灯加热,空间密封24小时。
(3)紫外线照射:
应分片照射,每次照射1-2小时。
3.清洗液的配制法:
蒸馏水2000mg,重铬酸钾1000g,浓硫酸8000ml。
真菌实验室的消毒
1.临床标本投入黄色医用垃圾袋中,统一焚烧处理。
2.实验室每天用84或健之素消毒桌面。
3.菌污染桌面或台面,用5%石炭酸溶液覆盖3-5分钟,切不可用水直接冲洗。
4.实验室每月消毒一次,用40%甲醛熏蒸法,每10-15平方米用50gKMnO4+100ml甲醛
5.定期用5%石炭酸液擦洗地面。
6.每天室内紫外灯照射1-2小时。
实验室质控
1.每批培养基做好以后要做无菌试验和生长试验。
2.每批培养基用标准菌株作质控。
3.没有参加室间质控的项目应做室间比对。
4.室内冰箱、温箱、水箱的温度每天观察并做记录,及时调整温度。
5.实验室应参加北京市或卫生部的室间质控。
表浅真菌标本的收集及检测
一、皮肤真菌的检测
1.标本取材
(1)酒精灯火焰灭菌钝刀
(2)患者皮肤75%酒精擦拭消毒(外阴及龟头有溃疡面时需用生理盐水擦拭)
(3)却才应用钝刀从皮肤损害的边缘向外刮取皮屑
(4)将皮屑置于干净的载玻片上
2.标本的处理
(1)载玻片上加一滴10-20%KOH
(2)盖上盖玻片
(3)放置片刻或微加热,即在火焰上快速通过2-3次,不应使之三次沸
腾,以免结晶
(4)轻压盖玻片驱逐气泡并将标本压薄
(5)用棉签吸去周围溢液,置显微镜下镜检
3.标本的显微镜检
(1)先用低倍镜检查有无菌丝和孢子
(2)用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等
4.报告结果
(1)见到真菌结果即报阳性
(2)未见到真菌结果季报阴性
二、甲真菌的检测
1.标本取材
(1)酒精灯火焰灭菌钝刀
(2)患者甲75%酒精擦拭消毒
(3)却才应用钝刀甲的标本应从变色、萎缩或变脆的部位采取,尽可能
近端取材,且应包括全甲厚度,因为真菌仅限于甲板的下方,如甲板增厚应从其下方刮屑
(4)将刮屑置于干净的载玻片上
2.标本的处理
(1)载玻片上加一滴10-20%KOH
(2)盖上盖玻片
(3)放置片刻或微加热,即在火焰上快速通过2-3次,不应使之三次沸
腾,以免结晶
(4)轻压盖玻片驱逐气泡并将标本压薄
(5)用棉签吸去周围溢液,置显微镜下镜检
3.标本的显微镜检
(1)先用低倍镜检查有无菌丝和孢子
(2)用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等
4.报告结果
(1)见到真菌结果即报阳性
(2)未见到真菌结果季报阴性
三、头癣的检测
1.标本取材
(1)酒精灯火焰灭菌钝刀
(2)酒精灯火焰灭菌镊子
(3)患者甲75%酒精擦拭消毒
(4)却才应用钝刀头皮的标本应从头皮损害的边缘向外刮取皮屑
(5)用镊子拔取受损害的断发或毛发
(6)将头皮刮屑或断发、毛发置于干净的载玻片上
2.标本的处理
(1)载玻片上加一滴10-20%KOH
(2)盖上盖玻片
(3)放置片刻或微加热,即在火焰上快速通过2-3次,不应使之三次沸
腾,以免结晶
(4)轻压盖玻片驱逐气泡并将标本压薄
(5)用棉签吸去周围溢液,置显微镜下镜检
3.标本的显微镜检
(1)先用低倍镜检查有无菌丝和孢子
(2)用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等
4.报告结果
见到真菌结果即报阳性
真菌涂片操作流程
1.标本取材
皮肤、毛发、甲:
酒精灯火焰灭菌钝刀,却才应用钝刀从皮肤损害的边缘向外刮取皮屑或用剪刀剪去疱顶。
甲的标本应从变色、萎缩或变脆的部位采取,尽可能近端取材,且应包括全甲厚度,因为真菌仅限于甲板的下方,如甲板增厚应从其下方刮屑。
毛发可用消毒后的镊子拔取标本或选取断发。
2.标本处理
标本置于载玻片上加一滴10-20%KOH,盖上盖玻片,放置片刻或微加热,即在火焰上快速通过2-3次,不应使之三次沸腾,以免结晶。
然后轻压盖玻片驱逐气泡并将标本压薄。
用棉签吸去周围溢液,置显微镜下镜检
3.显微镜镜检
先用低倍镜检查有无菌丝和孢子,然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小、和排列等
4.报告结果
查见报告阳性
真菌检查操作流程
1、直接涂片镜检:
标本取材——直接涂片——结果报告
2、真菌培养、鉴定及药敏:
标本取材——直接涂片——标本接种——丝状真菌转种鉴别培养基如马铃薯培养基、皮肤癣菌培养基—菌种鉴定;酵母菌接种显色培养基初步鉴定——药敏试验——结果报告
一、直接涂片镜检
1,标本取材
2,标本处理
标本置于载玻片上加一滴10-20%KOH,盖上盖玻片,放置片刻或微加热,即在火焰上快速通过2-3次,不应使之三次沸腾,以免结晶。
然后轻压盖玻片驱逐气泡并将标本压薄。
用棉签吸去周围溢液,置显微镜下镜检
3显微镜镜检
先用低倍镜检查有无菌丝和孢子,然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小、和排列等
二、真菌培养、鉴定及药敏
1.标本取材
粘膜:
应用无菌拭子取材。
眼:
灭菌小匙刮取溃疡部位。
尿液:
非插管病人取中段尿,标本应进行离心沉淀部分进行培养。
下呼吸道标本:
清晨新鲜的痰,采集后2小时之内处理,如不能及时处
理应在4度冰箱内保存。
脑脊液:
3-5ml量是较为理想,标本离心。
上清部分用于血清学试验,沉
淀部分由于培养也可镜检。
其他体液标本:
胸水、腹水和关节腔积液应收集于含有少量肝素抗凝(1:
1000)的无菌容器中,标本离心沉淀部分培养。
持续腹透的病人引流液应用不含肝素的无菌容器收集。
脓:
无菌注射器抽取,脓液中有颗粒应注意收集。
骨髓:
3-5ml抽取标本放入含有少量肝素抗凝(1:
1000)的无菌容器中。
组织:
应放入灭菌生理盐水中,应尽可能自损害中心或边缘取材,有可能应全部切除小的皮肤损害、皮下或粘膜损害。
2.标本接种
试管接种:
酒精灯火焰加热接种环或接种针灭菌,试管在火焰上快速通
过2-3次,打开试管塞,挑取少量标本,于沙氏的斜面中三点接种,试管口再次在火焰上快速通过2-3次,用胶塞封口。
平板接种:
酒精灯火焰加热接种环或针,挑取少量标本接种于平板。
3.标本转种
根据标本鉴定需要某些菌种需要转种其他培养基,如皮肤癣菌培养基、马
铃薯—葡萄糖培养基。
4.菌种鉴定
根据不同菌种的生长特点(如生长速度、颜色、菌落大小等),镜检观察
染色后(如乳酸酚棉蓝或苯胺蓝)菌丝及孢子的特点。
5.鉴定不清的菌种可采用PCR技术鉴定
6.真菌药敏试验
酵母样真菌及丝状真菌药敏试验方法按照美国临床试验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)指南进行操作和判读结果。
方法有:
稀释法和KB法
E试验法按照说明操作,按照美国临床试验室标准化研究所(CLSI/NCCLS)指南判读结果。
7.结果报告
报告种名
常用真菌培养基
一、沙氏培养基
1.成分:
葡萄糖40g,蛋白胨10g,琼脂10g,蒸馏水1000ml,PH6.5-7.0。
2.制法:
(1)葡萄糖及蛋白胨放入1000ml的三角烧瓶内。
(2)把琼脂肪放在300ml的蒸馏水中溶解,用纱布滤过并补足1000ml蒸馏水倒入三角烧瓶内,封好。
(3)8磅15分钟或10磅10分钟灭菌。
(4)无菌操作分装如玻璃试管制成斜面。
(5)4度冰箱中保存,使用半小时前取出,自制培养基保存不得超过一
月。
3.用途:
真菌培养的常规培养基
二、沙氏液基
1.成分:
葡萄糖40g,蛋白胨10g,蒸馏水1000ml。
2.制法:
(1)葡萄糖及蛋白胨、蒸馏水放入1000ml的三角烧瓶内,封好。
(2)8磅15分钟或10磅10分钟灭菌。
(3)无菌操作分装在培养管或特殊容器中。
(4)4度冰箱中保存,使用半小时前取出,自制培养基保存不得超过一
月。
3.用途:
分离白色念珠菌。
可以提供完整菌落,为制备菌落素提供材料。
三、沙氏保存培养基
1.成分:
蛋白胨10g,琼脂10g,蒸馏水1000ml。
2.制法:
(1)葡萄糖及蛋白胨放入1000ml的三角烧瓶内。
(2)把琼脂肪放在300ml的蒸馏水中溶解
(3)用纱布滤过并补足1000ml蒸馏水倒入三角烧瓶内,封好。
(4)8磅15分钟或10磅10分钟灭菌。
(5)无菌操作分装如玻璃试管制成斜面。
(6)4度冰箱中保存,使用半小时前取出,自制培养基保存不得超过一
月。
3.用途:
菌种再次培养基上生长缓慢,可保存菌种用。
四、皮肤癣菌培养基
1.成分:
蒸馏水1000ml,植物蛋白胨10g,葡萄糖10g,琼脂20g,酚红溶液40ml,0.8N盐酸6ml,放线菌酮0.5g,庆大霉素0.1g,金霉素0.1g。
2.制法:
(1)植物蛋白胨、葡萄糖、琼脂加入1000ml水中,溶解
(2)加40ml酚红溶液(酚红0.5g,溶于0.1NNaOH中加水至100ml)
(3)加入6ml0.8N盐酸并振荡
(4)放线菌酮0.5g溶于2ml丙酮中倒入热的培养基振荡。
(5)庆大霉素0.1g溶于2ml水中,最后加入基液。
(6)高压灭菌后,冷却到47度。
金霉素0.1g溶于25ml水中,加入培养
基。
(7)分装倒制平皿。
五、马铃薯—葡萄糖培养基
1.成分:
马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15g,蒸馏水1000ml。
2.制法:
(1)把马铃薯洗净、去皮、切碎、称取200g。
(2)放入800ml蒸馏水中煮开20分钟,用脱水棉或多层纱布过滤,滤
液加至1000ml。
(3)将葡萄糖、琼脂加到土豆液中,封好。
(4)8磅15分钟或10磅10分钟灭菌。
(5)分装,保存备用
3.用途:
培养镰刀菌观察紫色色素。
供皮肤真菌色素研究用
六、马铃薯—麦芽糖培养基
1.成分:
马铃薯200g,麦芽糖20g,琼脂15g,蒸馏水1000ml。
2.制法:
(1)把马铃薯洗净、去皮、切碎、称取200g。
(2)放入800ml蒸馏水中煮开20分钟,用脱水棉或多层纱布过滤,滤液加
至1000ml。
(3)将麦芽糖、琼脂加到土豆液中,封好。
(4)8磅15分钟或10磅10分钟灭菌。
(5)分装,保存备用
3.用途:
培养镰刀菌观察紫色色素。
供皮肤真菌色素研究用
七、皮肤癣菌鉴定培养基
1.成分:
葡萄糖10g,蛋白胨10g,琼脂20g,酚红0.2g、氯霉素0.125g,蒸馏水1000ml,PH5.5±0.2
2.制法:
(1)葡萄糖及蛋白胨放入1000ml的三角烧瓶内。
(2)把琼脂肪放在300ml的蒸馏水中溶解,用纱布滤过并补足1000ml
蒸馏水倒入三角烧瓶内,封好。
(3)8磅15分钟或10磅10分钟灭菌。
无菌操作分装如玻璃试管制成斜
面。
(4)4度冰箱中保存,使用半小时前取出,自制培养基保存不得超过一
月。
(5)抗菌素可灭菌前加。
八、氯化钠培养基
1.成分:
葡萄糖20g,蛋白胨10g,琼脂15-20g,氯化钠3-5g,蒸馏水1000ml。
2.制法:
(1)葡萄糖及蛋白胨放入1000ml的三角烧瓶内。
(2)把琼脂肪放在300ml的蒸馏水中溶解,用纱布滤过并补足1000ml
蒸馏水倒入三角烧瓶内,即加入氯化钠,封好。
(3)8磅15分钟或10磅10分钟灭菌。
(4)无菌操作分装如玻璃试管制成斜面。
4度冰箱中保存,使用半小时
前取出,自制培养基保存不得超过一月。
3.用途:
用来转接变异菌种,使其恢复颗粒状。
可以产生大分子孢子。
九、米粉培养基
1.成分:
米粉100g,琼脂20g,吐温8010ml,蒸馏水1000ml。
2.制法:
(1)米粉加水稀释混均,加热60度一小时,过滤补足1000ml
(2)再加入琼脂、吐温80,高压灭菌、分装制成斜面
(3)4度冰箱中保存,使用半小时前取出,
(4)自制培养基保存不得超过一月。
3.用途:
观测白色念珠菌的厚殖孢子
十、玉米培养基
1.成分:
玉米粉60g,琼脂15g,吐温8010ml,蒸馏水1000ml。
2.制法:
(1)玉米粉加水稀释混均,加热60度一小时,过滤补足1000ml再加入
琼脂、吐温80
(2)高压灭菌、分装制成斜面
(3)4度冰箱中保存,使用半小时前取出,自制培养基保存不得超过一
月。
3.用途:
鉴定念珠菌,白色念珠菌可产生厚壁孢子
4.注意:
后加吐温80
十一、尿素培养基
1.成分:
蛋白胨1g,葡萄糖1g,NaCl5g,KH2PO42g,尿素20g,酚红0.012g,琼脂15g,蒸馏水1000ml
2.制法:
(1)全部材料中前六种溶于100ml蒸馏水中
(2)用蔡氏滤器抽滤灭菌。
将琼脂溶于900ml蒸馏水封好
(3)8磅15分钟或10磅10分钟灭菌。
分装,保存备用,
3.用途:
隐球菌产生尿素酶,可使培养基变红。
石膏样毛癣菌也会产生变红。
十二、皮肤癣菌培养基
1,成分:
蒸馏水1000ml,植物蛋白胨10g,葡萄糖10g,琼脂20g,酚红溶液40ml,0.8N盐酸6ml,放线菌酮0.5g,庆大霉素0.1g,金霉素0.1g。
2,制法:
植物蛋白胨、葡萄糖、琼脂加入1000ml水中,溶解琼脂。
加40ml酚红溶液(酚红0.5g,溶于0.1NNaOH中加水至100ml)。
加入6ml0.8N盐酸并振荡。
放线菌酮0.5g溶于2ml丙酮中倒入热的培养基振荡。
庆大霉素0.1g溶于2ml水中,最后加入基液。
高压灭菌后,冷却到47度。
金霉素0.1g溶于25ml水中,加入培养基。
分装倒制平皿。
疥螨的取材及检查
一、标本取材
1.火焰消毒手术刀
2.消毒的矿物油滴于皮肤患处
3.再用刀片轻刮局部,将刮取物镜检
4.选择新发丘疹或水疱,仔细查找隧道末端白色虫点,用较细的消毒注射
针头,针口斜面向上,距虫点1毫米处进针,沿隧道直插至虫点底部并绕过虫点,转动针头,以求达到疥螨落入针口槽内,缓慢挑破角层。
将其放在10%氢化钾或生理盐水载玻片上,用低倍显微镜查找虫体或虫卵,或用刮片法寻找虫体或虫卵。
5.取皮肤较柔软嫩薄之处,常见于指间、腕屈侧、肘窝、腋窝前后、腹股
沟、外生殖器、乳房下等处;在儿童则全身皮肤均可被侵犯。
二、镜检
低倍镜镜检
三、报告结果
1.见到疥螨结果报阳性
2.未见到卵呈椭园形,色淡黄,壳很薄,疥螨结果报阴性
蠕形螨的取材及检查
一、标本取材
1.挤压涂片法:
(1)痤疮压迫器等在酒精灯火焰灭菌
(2)患者皮肤75%酒精擦拭消毒
(3)刮取毛孔粗大部位的皮肤,选取鼻沟、颊部及颧部。
(4)将刮出的皮脂分泌物置于载玻片上
(5)加1滴甘油或花生油、石蜡油等,涂开后加盖玻片镜检;
2.透明胶纸粘贴法:
(1)让患者用透明胶纸于晚上睡前,粘贴于面部的额、鼻、鼻沟、颧及
颏部等处
(2)次日早晨取下贴于载玻片上镜检。
粘贴一夜可检出阳性者总数的
90.4%,此法简便易行,无痛苦
二、镜检
低倍镜镜检
三、报告结果
1.见到蠕形螨结果报阳性
2.未见到蠕形螨结果报阴性
体虱病实验室检查
一、标本采集:
1.用火焰灭菌法消毒剪刀
2.放入75%酒精冷却
3.用剪刀剪下有体虱和虫卵的毛发。
4.寄生于人体的贴身内衣,尤其裤裆、衣缝、被褥缝及褶皱等处
二、标本固定:
1.选下列固定液固定:
70%酒精或5%-10%福尔马林溶液
2.将固定后的标本放在玻片上,滴一滴10%氢氧化钾溶液,放在酒精灯上略
加热,显微镜观察。
三、结果:
1.未见体虱为阴性
2.查见,色微黄,油亮,约针尖大小,有3对足者,为阳性
头虱病实验室检查
一、标本采集:
1.用火焰灭菌法消毒剪刀
2.放入75%酒精冷却
3.用剪刀剪下有头虱和虫卵的毛发。
4.寄生多为小孩、偶有成人头部
二、标本固定:
1.选下列固定液固定:
70%酒精或5%-10%福尔马林溶液
2.将固定后的标本放在玻片上,滴一滴10%氢氧化钾溶液,放在酒精灯上略
加热,显微镜观察。
三、结果:
1.未见头虱为阴性
2.查见头虱,为阳性。
毛发根之间头皮上可见成虫,发干上常能看到针尖
大小的白色虱卵
阴虱病实验室检查
一、标本采集:
1.用火焰灭菌法消毒剪刀
2.用剪刀剪下有阴虱和虫卵的阴毛。
3.寄生于阴毛、偶见于腋毛和眉毛
二、标本固定:
1.选下列固定液固定:
70%酒精或5%-10%福尔马林溶液
2.将固定后的标本放在玻片上,滴一滴10%氢氧化钾溶液,放在酒精灯上略
加热,显微镜观察。
三、结果:
1.未见阴虱为阴性
2.查见阴虱呈蟹形,有3对足,前足较小,中后足巨大,有粗大爪能抓住
阴毛。
虫卵为铁锈色或淡红色,为阳性
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