荧光定量PCR中探针法与染料法的区别.docx
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荧光定量PCR中探针法与染料法的区别
荧光定量PCR中探针法与染料法的区别:
一、荧光定量PCR中探针法与染料法的描述:
1.荧光定量PCR探针法:
探针法即除了引物外另外设置一个探针,在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团,这个时候,两个平衡不发光,但是当DNA通过引物合成的时候,探针被折断,释放出发光集团和淬灭集团,两个距离较远,发光集团产生荧光,被机器收集到信号,从而检测基因的量
2、荧光定量PCRSYBRGreen染料法:
染料能够与双链结合,当PCR扩增的时候,染料结合到DNA上,从而发光,单个的染料不发光,这样就能收集到信号,我们可以看出,染料法特异性不强,只要是双链的DNA都回结合发光。
二、荧光定量PCR中探针法与染料法的优缺点
1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性,只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号,能够用多重体系反应的方法,能够预测和提前进行反应条件的优化,缺点是要合成探针,成本高
2、染料法经济实惠,可以做溶解曲线,分析全部PCR产物的TM值,缺点就是特异性没有探针法好
【分享】定量pcr仪选则宝典:
各自精彩的选择
如何选择合适的定量PCR仪定量PCR仪主要由两部分组成,一个是PCR系统,一个是荧光检测系统。
选择定量PCR仪的关键——由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的,对于定量PCR系统来说,重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等,更重要的还在于样品孔之间的均一性,以避免微小的差别被指数级放大。
至于荧光检测系统,多色多通道检测是当今的主流趋势——仪器的激发通道越多,仪器适用的荧光素种类越多,仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光,仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品,通道越多,仪器适用范围越宽、性能就更强大。
荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。
激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源,前者可配多色滤光镜实现不同激发波长,而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长,不过因为是单色,需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。
监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管,前者可以一次对多点成像,后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品,需要通过逐个扫描实现多样品检测,对于大量样品来说需要较长的时间。
定量PCR仪需要考虑的另外一个因素是软件设计,这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用。
——随着定量PCR技术在临床诊断、疾病监控、药物监测、肿瘤研究等领域的越来越广泛的应用,市面上不同品牌和设计的定量PCR仪也不断推陈出新,生物通在这里着重介绍不同的3类定量PCR仪,各有各精彩。
1.传统的96孔板式定量PCR仪传统的96孔板式定量PCR仪以美国应用生物系统公司(ABI)为代表。
传统96孔板式定量PCR仪的优点是可容纳的样本量大而且无需特殊耗材,可以采用传统的96孔板甚至384孔板进行批量的定量反应,但是缺点也显而易见——温度均一性不佳——平板固定加热模块的PCR温度控制有边缘效应——样品槽上每个孔之间的温度存在差异——也就是所谓位置效应,因此标准曲线的反应条件应难以做到与样本完全一致,样本和样本之间的温度控制也可能存在差异,对于灵敏度极高的定量PCR来说,任何极微小的差异都会以指数级别的规模被放大,不能不说是一种缺憾。
传统反应板面积大,温度控制的精确性、升降温速度也相对较慢,因而反应速度也较慢。
96孔板定量PCR仪的荧光检测分析系统,由于96孔板上样品孔的位置是固定的,每个样品孔距离光源和监测器的光程各不相同,有可能对结果产生影响。
检测在试管管底进行,试管底的透光性和厚薄均一性都可能对结果产生影响。
MJ和Bio-Red公司的定量PCR仪也属于这一类。
ABI的7500型荧光定量PCR仪激发光源为卤钨灯光源,5色滤光镜,可同时激发96个样品,超低温CCD具备同时多点多色检测的能力,能够有效地分辨FAM/SYBRGreenI,VIC/JOE,NED/TAMRA/Cy3,ROX/TexasRed,和Cy5等荧光染料。
多色荧光检测技术为多重定量、SNP分析、基因型分型和带阳性内对照的阴/阳性分析提供了基础。
多重定量即在同一反应管内同时对多个目标基因进行定量,可以大大提高精度并节约成本。
随机配置的定量PCR引物和探针设计软件PrimerExpress非常有用,“因为到目前为止还没有其他软件有能力设计定量PCR所需的TaqMan探针(生物通摘自ABI技术资料)”。
各型号都有实时动态(Real-Time)和终点读板(PlateRead)两种运行模式。
实时动态模式用于定量DNA或RNA拷贝数。
可以动态显示PCR扩增曲线的生成,定量的线性范围大于9个数量级,区分5000和10000个拷贝的DNA模板可信度达99.7%。
终点读板模式用于基因型鉴定、点突变检测和单核苷酸多态性(SNP)分析等。
当然,也可以作为普通PCR仪使用。
ABI定量PCR仪最大的优势在于ABI已经发布十二万种TaqmanGeneExpressionAssays人、大鼠、小鼠基因组基因表达分析试剂盒,覆盖人类全部4万个基因,二百万种TaqmanValidatedSNPGenotypingAssays人、大鼠、小鼠基因组SNP检测试剂盒,为运用7000、7300、7500、7900型开展课题研究创造了绝佳的条件。
ABI的定量PCR仪均支持两种定量化学:
TaqMan荧光探针和SYBRGreenI荧光染料。
其熔解曲线(DissociationCurve)功能用于判断PCR扩增反应是否特异,有无杂带生成。
7500型号比7300多一个滤光镜,新的光路设计使长波长红色荧光的检测灵敏度大大提高,带有快速运行模式。
增强的7900型在96孔模块的基础上更加可以更换384孔版模块,使得高通量处理数据的能力大大增强,应该更适合经常处理大量标本的实验室吧。
MJ的Option系列是在MJ原来的常规PCR仪基础上改造,采用LED光源PMT光电倍增管荧检测器。
96个单色LED光源对应96孔板,但是单色LED激发波长范围较窄。
Option是单道单个光电倍增管荧光检测器,升级的Option2是双PMT光电倍增管荧光检测器,PMT灵敏度高但一次只能扫描一个样品,所以Option系列是逐孔扫描而非同时检测96个样品。
双PMT可同时进行双色检测(FAM/SYBRGreenI;VIC/Joe/TAMRA)。
优势之一是带梯度功能。
Bio-Rad(伯乐)也算是个熟悉的品牌,iCycleriQ实时定量PCR系统也是96孔平板式固定加热的,荧光检测波长范围400-700nm,可4波长同时检测,仪器的设计灵活,定性和定量部分可独立工作,同样可完成梯度PCR。
5组滤光片位置使用户可以自由选择不同的检测波长。
专利技术intensifier荧光放大器保证了极高的检测灵敏度。
MJ被Bio-Rad收购后,Option和iCycleriQ目前还是各自走各自的销售渠道,至于将来Bio-Rad会如何决定二者的发展方向还需要拭目以待。
小中大2.创新概念的离心式实时定量pcr仪为了克服平板式定量pcr温度均一性差的缺点,聪明的研究人员又开发出创新概念的离心式实时定量pcr仪,以roche罗氏的lightcycle和corbett的rotor-gene为代表。
pcr扩增样品槽被巧妙地设计为离心转子的模样,借助空气加热和转子在腔内旋转,转子上每个孔都是“等位”的,几乎无差别,很好的解决了每个样品孔之间的温度均一性的关键问题——corbett的rotor-gene样品间温度差异小于±0.01℃,最大程度地保障了标准曲线和样品之间条件的一致性。
利用空气做加热介质的优点在于能实现与反应体系无缝接触,接触面积大且加热均匀。
虽然有竞争对手批评空气介质比热小,但事实上roche的lightcycle%202.0却是目前升温速度最快的定量pcr仪,可以达到20℃/秒!
Corbett的Rotor-gene也可以达到5℃/秒(样品实际升温速度达到2.5℃/秒),优于多数的平板式PCR仪。
借助旋转离心力还可以随时将可能凝在管壁和盖子上的液滴离心到管底而无需热盖;还可以将酶加在管盖上,升温后离心到管底与反应体系混合,实现“机械的热启动功能”。
由于升温速度快,对于常规需要2个多小时完成的定量PCR反应,Roche的LightCycler仅需20—30分钟即可完成,可以大大节约时间和提高工作效率。
这一点对于研究人员来说极为有用,因为你不再需要等2个多小时才能看实验结果了,或者换句话来说,2个多小时你可以做4—5轮定量实验了。
由于转子上的样品孔是旋转可移动的,因而离心式荧光检测系统可以固定激发光源和荧光检测器,随时检测旋转到跟前的样品管——由于每个样品管在检测时距离检测器和激发光源的距离都是“等价”一样的,使用的是同一个检测器和激发光源,有效减少不必要的系统误差。
固定的结构使得仪器运行更稳定,使用寿命更长;离心式定量PCR都是逐个检测样品的,所以大多采用了长寿的LED(发光二极管)冷光源,运行前无须预热,无须校正;系统检测重复性也更好。
离心式定量PCR仪的缺点主要是离心的转子小,能容纳的样本量有限,由于是离心式转子,常规的96孔板和条形管就不适用,有的还需要特殊的消耗品,增加使用成本。
当然离心式定量PCR仪不可能带梯度功能。
Roche的Lightcycler刚推出的时候确实让人眼前一亮!
现在Lightcycler2.0拥有令人心动的优点-----快速:
利用空气动力学原理,20-30分钟内完成30-40个循环。
控温准确:
变温速率最高可达20℃/秒,温差≤±0.3°C多波长检测:
可同时在530、640及710nm三个通道进行检测,实现同管检测两个项目或设立检测项目的外对照和内对照。
此外动态检测范围达10个数量级,而无须将样品稀释;具有熔点曲线分析功能可以鉴别基因型、检测点突变、检测非特异性扩增,具多种检测模式如Taqman探针、荧光染料SYBRGreenI检测、序列特异杂交探针等;探针及引物设计方便,杂交探针及引物设计的限制少,而且亦可方便地选用合适大小的扩增子(100-1000bp)。
但是Lightcycler需要使用特定的毛细管作为样品管,这在某种程度上提高了消耗成本,也不方便作为常规PCR仪使用。
Corbett的Rotor-Gene也是离心式的定量PCR仪。
在品牌的角度上Corbett当然不如Roche罗氏在国内那样家喻户晓,之所以特别提到这个产品,确实是因为Corbett的设计有独到之处。
比如Corbett的Rotot-Gene3000标准型是真正独立的4通道(可建立新通道),4个独立LED激发光源(470nm/530nm/585nm/625nm)保证最少的光谱交叉(0.99935)。
由于转子在反应过程之中一直以恒定的低速旋转,使得样品间的温度均一性极佳(±0.01℃/秒),同一热反应室提供完全相同的反应条件,同一光学通路提供完全相同的测量通道,每标本每循环检测32次,满足高精度和一致性要求。
Rotot-Gene3000提供了36x0.2ml和72x0.1ml两种转子,检测是通过薄壁管侧壁而非管底进行的,因而可以使用普通的0.2mlPCR管,并允许在试管盖上标记,这降低了使用成本。
Rotot-Gene3000的温控速度不如LightCycler,但优于多数的固定加热模块的机型,能达到5℃/秒(管内实际升温速度达到2.5℃/秒)。
Corbett还有一个光学变性专利——让待扩增样品预先进行一次熔解曲线程序,检测荧光染料信号大小的变化,找到代表全部双链DNA解链的峰值对应温度,在其后的反应中就无需总是将变性温度设为94度,也不需要延长孵育时间。
这个专利使得反应过程大大缩短。
Rotot-Gene主要的问题也是可容纳的样品数量少,只能靠反应速度快,同样的时间可以多运行几轮反应来弥补。
对于大量样品的实验室,Corbett同时还提供定量PCR反应自动加样系统,不单可以和自家的Rotor-Gene配套使用提高工作效率和均一性、安全性,也可以配套Roche和ABI的定量PCR仪。
这样就不用担心加样累坏了。
3.第三类的荧光定量pcr仪以cepher公司的smart%20cyclerii为代表,对于国内的用户来说比较新鲜,但这个一直受美国国防部和安全局、美国军队传染病医学研究中心、美国军队士兵和生物化学合作所资助的公司却相当有来头。
smart%20cyclerii获得过1998年美国研发r&d100金奖。
smart%20cyclerii的机型小巧,只有16个样品槽,它的独到之处在于这16个样品槽分别拥有独立的智能升降温模块,也就是说这16个样品槽相当于16台独立的定量pcr仪!
独立控温的好处首先是,你可以在同一定量pcr仪上分别进行不同条件的定量pcr反应,更为灵活自定义的梯度优化反应也好,或者是完全不同的几组反应——甚至,你可能只进行个别样品的检测,只占用其中几个样品槽——过一会儿其它的同事也要用——他不需要等待你的反应结束,而可以随时利用空置的样品槽开始其它定量反应!
对于各有各忙的多成员的实验室,要是个别样品就占据96孔样品槽,其它人每轮要再等2个多小时,有时还要等几轮,那可够郁闷的。
smart%20cycler%20ii的使用频率可以被最大化,大家都不用等待!
这个世界上唯一允许不同条件pcr同时进行的定量pcr仪拥有独一无二的优点,是其它任何平板式或者离心式定量pcr都不具备的。
此外,每个温控模块只控制一个样品槽,升降温速度当然更快——高达10℃/秒,控温精度自然就更高——这里根本不用考虑不同样品槽之间的温度均一性的问题,只有每个模块控温精确度的问题。
对于普通的96孔板固定加热模块,本身有控温精度和准确度的差异,再加上样品槽不同位置之间的温度差异,而SmartCyclerII就完全减少了一个误差因素。
优异的特性使得只要20分钟就可以完成常规的定量PCR反应,大大提高研究人员的工作效率。
每个模块独立控制的激发光源和检测器直接与反应管壁接触,保证荧光激发和检测不受外界干扰,固定的结构使得仪器运行更稳定,使用寿命更长。
整合有4通道光学检测系统,分别可以检测FAM/SYBRGreenI,Tet/Cy3,TexasRed和Cy5,可在同一样本中进行多靶点分析,同时检测4种荧光信号,可使用多种检测方法,包括Taqman探针、分子信标、Amplifluor引物和Scorpion引物和荧光内插染料等等。
宽达9个数量级的线性范围。
不过SmartCyclerII需要使用独家的扁平反应管,增加了反应成本,上样也不如传统的方法方便,而且16个样品槽也不大适合批量反应的要求——不过SmartCyclerII的软件设计允许一台电脑同时操作6台SmartCyclerII,部分弥补了缺憾。
所以SmartCyclerII会更适合多成员、样本量不大、要求快速出结果的实验室。
不是每个实验室都总是要同时检测几十上百个样品吧?
在选购定量PCR前之前我们需要先了解自己的需要——是同时检测大量样本?
还是小规模的研究?
是固定的标准化检测方法还是有机会尝试不同的方法?
随着技术的加速发展不断有新的荧光素、标记方法和试剂盒面市,还要考虑仪器性能在将来的可拓展性等等。
生物通撰写本文的目的并非指出哪一类的仪器更适合我们的需要——毕竟不同应用领域、不同的实验室有着不同的需求,所以了解不同类型的定量PCR仪的特点有助于选择更适合自己需要的仪器,“不求最好,但求适合”。
实时荧光Taqman探针设计的几个要点
实验室很多同学都要做RealtimePCR实验,实验室的师兄师姐都会有很多宝贵意见,不过也有实验室前没有做过的,查找了下资料和大家分享下关于实时荧光Taqman探针设计、实时荧光PCR探针的选择、引物的设计及评价。
荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物,探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。
目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标MolecularBeacon。
广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针,该探针只与模板特异性地结合,其结合位点在两条引物之间。
探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter,R),如FAM、VIC等,3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q),如TAMRA等。
当探针完整的时候,5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭,仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’荧光基团的吸收波长,因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。
随着PCR的进行,Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针,其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的,游离的单链探针不受影响)就会将切割探针,释放5′端报告基团游离于反应体系中,远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽,5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。
也就是说每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。
(请注意,该图显示的不是普通的Taqman探针法,而是TaqmanMGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。
常用的荧光基团有FAM,TET,VIC,HEX等等。
当探针完整的时候,由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量,本身会发射波长不同的荧光而导致本底高,因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqManMGB探针。
MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-FluorescentQuencher),本身不产生荧光,可以大大降低本底信号的强度。
同时探针上还连接有MGB(MinorGrooveBinder)修饰基团,可以将探针的Tm值提高10°C左右。
因此为了获得同样的Tm值,MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短,既降低了合成成本,也使得探针设计的成功率大为提高——因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下,短的探针比长的更容易设计。
实验证明,TaqManMGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。
Taqman探针法已经得到广泛使用,不过有人认为这种技术利用了Taq酶5`—3`外切酶活性,一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标,没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标,不同批号试剂之间会给定量带来差异。
另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60°C,这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐,难于做质控检测。
RealtimePCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择和引物的设计及评价
一、实时荧光Taqman探针设计
总原则:
探针选择要保守,引物选择要保守,因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。
即real-timePCR的扩增片段是50bp----150bp。
当找不到150bp的保守片段时,必须确保探针的片段是保守的。
在设计探针和引物时,要同时考虑在两条链上设计引物与探针。
但要注意的是:
在那条链上设计探针时,就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。
这样,可保证在将来扩增时,即便没有完全扩增,也有荧光信号报告出来。
两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基,但也可以重叠。
若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远,而离下游引物的距离却较近时;2突变位点要求在探针的5’端也能检测到荧光信号,但却是在3’端),可在互补的序列中设计引物与探针。
另real-timePCR中的探针和引物的Tm值,均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。
二、探针的设计
探针设计的基本原则:
1.保守:
探针要绝对的保守,有时分型就单独依靠探针来决定。
理论上有一个碱基不配对,就可能检测不出来。
若找不到完全保守的片段,也只能选取有一个碱基不同的片段。
且这个不同的碱基最好在探针的中间,对探针与目的片段的杂交影响不大,不相同的碱基最好不要在两端,因为两端不利于探针的杂交。
且最好为A或T,而不能为G或A,因为A、T为双键,而G、A为三键。
2.探针长度:
Taqman探针的长度最好在25-32bp之间,且Tm值在68-72℃之间,最好为70℃,确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃,这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。
因此探针最好是富含GC的保守片段,保证其的Tm值较高。
现在有TaqmanMGB探针,在TAMER之后再标记一个MGB,可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短,也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。
3.探针的名称:
应标记探针在基因组的位置及长度。
4.探针Tm值计算:
用oligo或primerpreiemer软件即可计算Tm值。
确保探针中GC含量在30-80%。
应避免探针中多个重复的碱基出现,尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。
5.探针的评价:
用DNAstar软件中的Primerselect软件,点击“log”菜单中的“createprimercatalog”,在“name”中输入探针的名称、位置,按Tab键进入“sequence”,粘贴或输入要分析的探针序列。
选中整个序列后,在“report”菜单下“primerselfdimer”,分析探针的二聚体。
弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dimer,并对此探针用dG值进行评价(通常给出最差的dG值,理论上是dG值越大越好)。
在“report”菜单下“primerhairpins”,分析探针的发夹结构。
弹出的窗口中就告诉此探针有多少个hairpins,并对此探针的hairpins进行评价。
多重荧光PCR时,要对多条探针进行“pairdimer”进行分析。
6.探针的5’端不能为G,因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时,G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号,从而导致假阴性的出现。
7.Taqman探针与引物之间的位置:
Taqman探针应靠近上游引物,即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。
两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基,但也可以重叠,要保证Taqman探针的5’端离上游引物的5’端至少有4bp。
荧光定量PCR详细流程和问题解析[转自丁香园论坛]
前一段时间在XX中搜索,发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过,考虑到自己作荧光定量PCR工作已经了五年了,做的实验以及解决的问题远比五年前多了,因此利用过年的时间,写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想,无论对错,都是希望对相关的人员有些参考价值。
荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了,我就不细说了,主要是写一些有人问过的事,希望写的内容是大家都关心的。
普通PCR与荧光定量PCR技术区别?
简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段,用于克隆、测序等实验,后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量,而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量,是一种测定特异的PCR片段含量的方式。
如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。
前些年有人讲过普通PCR后,通过电泳也可以进行定量,其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。
近两年没有人再讲这类的话了。
SybrGreen、Taqman、Molecularbeacon、LUX这些方法如何选择?
从实验成本来讲,SybrGreen是最好的,基本上就是普通PCR加上一点SybrGreenI荧光染料即可,其信号
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