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分子实验设计
中央民族大学生命与环境科学学院
分子生物学综合性设计实验报告
小麦钙依赖型蛋白激酶ZmCPK11(CDPK)基因的克隆、表达载体构建及蛋白表达
姓名:
姚建
学号:
0941021
年级:
09级
专业:
生物科学
指导教师:
徐小静
2012年5月13日
小麦钙依赖型蛋白激酶ZmCPK11(CDPK)基因的克隆、表达载体构建及蛋白表达
摘要:
目的:
学习并掌握完整的DNA重组技术,设计实验实现从DNA到蛋白质的转化。
方法:
本实验运用生物信息学的方法,利用Genbank查找基因序列,利用DNAman查找酶切位点,并设计引物,从小麦中提取RNA,RT-PCR扩增之后测序检验基因序列的正确性,并构建基因表达载体,将载体转入受体细胞大肠杆菌,表达出蛋白,用SDS-PAGE分离蛋白,并用亲和层析法纯化蛋白质最后用免疫印迹鉴定蛋白。
结果:
得到表达小麦钙依赖型蛋白激酶的大肠杆菌,并分离得到钙依赖型蛋白激酶。
结论:
实现了基因的克隆及从DNA到蛋白质的转化过程。
关键字:
小麦钙依赖型蛋白激酶;克隆;表达载体构建;蛋白表达纯化
前言
在植物细胞中,钙离子作为第二信使,通过钙依赖蛋白激酶(CDPKs)发挥功能是其传递信号的主要途径之一。
CDPKs广泛存在于植物体内,是目前植物体内研究最深入的蛋白激酶。
在植物体内,CDPKs广泛分布于根、茎、叶、花和种子中,在分生细胞、木质部细胞、叶肉细胞、花粉细胞、保卫细胞和胚细胞中。
CDPKs具有三个功能区,从N端到C端依次为催化区、连接区和调控区。
催化区由300多个氨基酸组成,具有典型的Ser/Thr蛋白激酶的亚结构域,催化区结构域的同源性较高,一般在80%以上。
连接区由20~30个氨基酸组成,是蛋白激酶活性自抑制的区域,也是最为保守的区域。
在无Ca2+存在时,CDPKs催化区可能与连接区结合,使其激酶活性被抑制。
调控区是钙结合区,也是CDPKs有别于其它类激酶的特有区域。
此结构域与典型的CaM序列的同源性大于40%。
由于CDPKs自身含有类似钙调素的序列,因此其活性仅依赖于钙而不依赖于钙调素。
有人甚至认为CDPKs基因是由Ca2+-CaM依赖的蛋白激酶基因与CaM基因融合而成,这样有利于它更快地对Ca2+浓度变化作出反应。
该区域是CDPKs中最不保守的结构域,大多数CDPKs有4个保守的EF手性结构,但有些CDPKs却只有3个EF手性结构。
CDPKs的催化区前端,即N末端带有一段长短不一的序列,称为可变结构域。
各类CDPKs在此结构域上很少有同源关系。
许多CDPKs与CaM有一个共性,即可与疏水的基质结合,如苯基-Sepharose;polypropylaspartamidegel;固定化的酚噻嗪等,根据此特点,我们可以利用亲和层析的方法分离纯化CDPK。
一、实验原理
1.利用GenBank查找基因序列,设计引物。
2.提取总RNA,RT-PCR扩增该基因
真核细胞绝大部分RNA为rRNA(主要为28S、18S、5.8S和5S四种)(占80~85%)、tRNA与小分子RNA(占10~15%)和mRNA(占1~5%)。
植物RNA的提取,主要包括以下4个步骤:
①用机械研磨等方法破碎植物组织细胞;
②加人蛋白质变性剂,使核蛋白与RNA分离,释放出RNA;
③抑制内源和外源RNase活性;
④将RNA、DNA、蛋白质及其他细胞物质分开。
现在已有多种较为成熟的分离总RNA的方法,其中3种最为常用,它们分别是苯酚法、胍盐法和氯化锂沉淀法。
苯酚法是用SDS变性蛋白并抑制RNase活性,经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后,用NaAc和乙醇沉淀RNA。
胍盐法是用异硫氰酸胍(或盐酸胍)和巯基乙醇变性蛋白并抑制RNase活性,经酚/氯仿抽提后.再沉淀RNA。
氯化锂沉淀法是Li+在一定pH下时使RNA沉淀。
实验采用胍盐法。
逆转录PCR(RT-PCR)包括逆转录(RT)和PCR两个基本过程,逆转录是以mRNA为模板合成互补的cDNA(complementDNA)的过程;PCR是以逆转录得来的cDNA作为模板而进行的PCR过程。
RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。
两步法RT-PCR比较常见,在使用一个样品检测或克隆多个基因的mRNA时比较有用。
在两步法RT-PCR中,每一步都在最佳条件下进行。
cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行PCR。
而一步法RT-PCR中,cDNA合成和扩增反应在同一管中进行,不需要打开管盖和转移,有助于减少污染。
还可以得到更高的灵敏度,最低可以达到0.1pg总RNA,因为整个cDNA样品都被扩增。
对于成功的一步法RT-PCR,一般使用基因特异性引物(GSP)起始cDNA的合成。
3.重组表达载体的构建
将PCR扩增产物以及原核表达载体pET-30a经HindⅢ、EcoRV双酶切后,以T4DNA连接酶连接,16℃,2h,转化受体菌DH5a,筛选重组子后,HindⅢ、EcoRV双酶切鉴定,筛选阳性克隆测序。
4.转入大肠杆菌DH5a菌株中
实验以大肠杆菌DH5a菌株为受体细胞,用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与重组质粒共保温,实现转化。
由于pET-30a质粒带有卡那霉素抗性基因,可通过卡那霉素抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pBS质粒,则在含卡那霉素的培养基上不能生长。
能在含卡那霉素培养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了重组质粒。
5.目的蛋白的诱导表达及分离纯化
大肠杆菌中重组蛋白的表达主要有两种模式——组成型及诱导型,主要由表达载体本身决定。
在大肠杆菌中表达的外源蛋白对大肠杆菌本身的生长来说,多为有害的,因此,目前常用的都是诱导表达型载体,如pET系列。
在大肠杆菌增殖阶段,外源蛋白不表达,然后改变培养条件,诱导外源蛋白表达。
诱导条件也有多种,比如加入IPTG或者乳糖,或通过温度变化诱导表达。
目前常用的多为IPTG诱导表达载体。
DH5a诱导表达的菌液,经煮沸处理后,取上清,SDS—PAGE分离目的蛋白。
利用CDPK与疏水的基质结合的特点,使用苯基-Sepharose亲和层析柱,进行纯化。
蛋白质免疫印迹可用于鉴定目的蛋白,主要由四个步骤组成,首先是蛋白质的凝胶电泳,然后将凝胶上的蛋白质转移到膜上固定,然后是抗原抗体免疫反应,最后是显色。
因为抗原抗体反应往往受蛋白质空间结构差别的影响较小,主要与蛋白质氨基酸序列有关,所以凝胶电泳常采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
可以转移固定蛋白质的膜有多种类型,主要有硝酸纤维滤膜(NC膜)、尼龙膜和聚偏氟乙烯滤膜(PVDF膜)。
硝酸纤维素膜是免疫印迹中应用最广的滤膜,尼龙膜与之相比优势在于它们可用不同抗体进行多次检测,但转移到尼龙膜上的蛋白质不仅没有合适的染色方法进行监测,而且抗体容易与滤膜非特异性结合,造成背景很高。
PVDF膜与蛋白质的结合能力远高于硝酸纤维素膜,它常用于蛋白质的序列测定。
将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上后进行抗原抗体免疫反应。
首先利用标准蛋白(常为脱脂奶粉或标准牛血清白蛋白)封闭膜上未结合蛋白质的位点,然后用已知的抗体作为一抗与膜上相关抗原反应,洗涤除去未结合的游离抗体后,再用带有显色标记的一抗的抗体(也就是二抗)再与一抗进行免疫反应,洗涤除去未反应的二抗后,就可以对膜进行显色鉴定。
二抗上的显色标记一般为同位素或者酶,常用的为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶,然后再加入相应酶的底物进行显色。
Western免疫印迹可检测到ng级蛋白质的存在。
二、实验用品
1、实验材料
小麦、原核表达载体pET-30a、T4DNALigase和ExTaqDNA聚合酶、以HindⅢ、EcoRV内切酶、大肠杆菌DH5a等
2.仪器设备
高压灭菌锅、恒温摇床、超净工作台、分光光度计、冷冻高速离心机、恒温水浴锅、50mL离心管、1.5mLEppendorf离心管、移液器及枪头、试管、培养皿、碎冰、超低温冰箱、水平电泳槽、电泳仪、紫外检测仪、凝胶成像系统、PCR仪、0.2mLPCR、管电炉(或10mg/mL溶菌酶)、垂直板电泳槽、脱色摇床、转移电泳槽、培养皿(直径15cm,10cm每组各一个)、滤纸、硝酸纤维素膜(NC膜)、乳胶手套、平头镊子等。
3.试剂及溶液(参见实验讲义)
三、实验步骤
(一)利用GenBank查找基因序列,设计引物。
1、NCBI查找ZmCPK11序列,结果如下:
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61acggcgccggctccgtcgtcggggcgtccggcgtccgtgcttccgtacaagacggcgaac
121gtgcgggaccactaccgcatcggcaagaaactggggcaggggcagttcggcaccacgtac
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1561gtacattcccatggcatctgaagtttttggatgcgttgtcgatctgctggcctattctga
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2、根据该序列,用DNAMAN进行酶切位点分析,查看该序列上没有的酶切位点,结果如下:
20BstD102I333EheI397SapI1216EcoRI
43Bsc91I335BbeI403DrdI1276BsmI
43BbvII355SapI429BssHII1319ClaI
54PvuII355Alw44I637Eco57I1343NruI
64NarI355ApaLI676AlwNI1343SpoI
65EheI372Ecl136II704Bsp1407I1357Eco31I
66Eco56I372EcoICRI744Eco57I1369XhoI
67BbeI374SstI745AlwNI1371SciI
68NaeI374SacI771AlwNI1402XcmI
186PflMI379Eco56I772ApaBI1409MscI
218SphI379SgrAI858BamHI1409BalI
269AatII381NaeI882BspHI1551StuI
328Mlu113I390Ecl136II985Eco57I1569NcoI
330SacII390EcoICRI1030EcoNI1599Eco57I
330SstII392SacI1054Eco31I1715DraIII
332NarI392SstI1180PvuII
3、结合将要使用的质粒的酶切位点以及以上酶切位点,选取合适的酶切位点进行引物设计,得到两个引物为:
P1:
5’-CCAATGCGAAGACGAAAC-3’Tm=57.7℃添加酶切位点EcoRⅤ
P2:
5’-GGTGCTGGCAAAGAGAAA-3’Tm=57.4℃添加酶切位点HindⅢ
4、根据两个Tm值,可得退火温度为57.5℃
(二)提取总RNA,RT-PCR扩增该基因
1、总RNA的制备
(1)用干净剪刀剪取1cm长新鲜小麦幼苗叶片2~3片,立即放入无菌的1.5mL离心管中,加液氮后迅速用干净镊子捣碎成粉末,期间注意避免被液氮冻脆的叶片由于解冻而发生潮解,从而引起RNA的降解。
加入RNA提取缓冲溶液500µL。
(2)依次加入50µL2mol/L乙酸钠(pH4.0),500µL水饱和酚,100µL氯仿/异戊醇(49:
1),充分混匀后置冰上10min。
(3)4℃下12000r/min离心15min,取上清液转入另一离心管中。
(4)加等体积异丙醇,-20℃沉淀0.5h。
(5)4℃下12000r/min离心15min,收集沉淀。
(6)加500µL75%乙醇洗涤沉淀,晾干沉淀,注意不能太干,否则不易溶解。
(7)沉淀的RNA溶于50µLDEPC处理的无菌水中。
(8)取10µL用1%普通琼脂糖凝胶进行电泳检测。
(9)在紫外灯下观察结果。
注意观察总RNA的18S、28S特征条带。
2、RT-PCR
(1)取高质量的总RNA进行逆转录。
反应在0.5mL灭菌离心管中进行,10μl逆转录体系包括:
灭菌去离子水3μL
总RNA4μL(总量1μg)
oligodT(16)(10μmol/L)0.5μL
5×逆转录缓冲液2μL
逆转录酶0.5μL
在加入后两种成分前,混合物先在65℃加热5min后,迅速放置冰上,使RNA充分变性并和引物充分结合。
加入逆转录酶后,枪头在反应混合液中反复吸吐几下,使得酶能够完全加入到反应体系中。
酶从冰箱取出后放置在冰上,使用完毕,应立即放回冰箱。
(2)在逆转录酶指定的温度下(一般为42℃左右)进行逆转录反应,反应时间一般为90min。
反应完毕后,70℃下10min,对酶进行灭活。
反应产物于–20℃冻存。
(3)以上述逆转录的cDNA作为模板进行PCR反应。
总体积为50uL,在0.2mL灭菌的PCR管中依次加入:
灭菌的重蒸水37.5µL
10×Taqbuffer5µL
2.5mmol/LdNTP2µL
actinP1(10μmol/L)2µL
actinP2(10μmol/L)2µL
cDNA1µL
Taq酶0.5µL
加入Taq酶后,枪头在反应混合液中反复吸吐几下,使得酶能够完全加入到反应体系中。
酶从冰箱取出后放置在冰上,使用完毕,应立即放回冰箱。
(4)将上述PCR管放入PCR仪中,设计程序:
94℃预变性3min,然后将下列三个步骤进行35个循环:
94℃变性1min,62.9℃退火1min,72℃延伸1min,最后于72℃下保温10min。
3、测序确认
(1)取10μLPCR产物,用浓度为0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
(2)经电泳鉴定大小正确后,可继续交送公司测序。
将测序的序列与NCBI上的序列进行比较,确定是否为玉米钙依赖型蛋白激酶ZmCPK11(CDPK)基因。
(三)重组表达载体的构建
1.取2个0.5mL无菌小离心管,用EcoRⅤ和HindⅢ两种限制性内切酶同时对质粒pET30a和PCR产物进行酶切,总体系均为50µL。
灭菌重蒸水34µL
内切酶反应缓冲液(10×)5µL
质粒或目的DNA片段10µL(总量约2μg)
EcoRⅤ0.5µL
HindⅢ0.5µL
加入限制性内切酶后,枪头在反应混合液中反复吸吐几下,使得酶能够完全加入到反应体系中,并能与其它成分充分混匀。
酶从冰箱取出后放置在冰上,使用完毕,应立即放回冰箱。
2.将上述酶切产物全部上样,分别经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离,在紫外灯下用刀片切下含目的DNA条带的凝胶。
尽量去掉不含DNA的多余凝胶。
3.从凝胶中回收DNA,操作步骤按照试剂盒说明进行。
4.将回收的两种DNA片段进行连接。
在0.5mL无菌小离心管中依次加入下列溶液,总体积为20uL:
灭菌的重蒸水2.5µL
10×连接酶缓冲液2µL
pET30a酶切片段5µL
目的基因酶切片段10µL
T4DNA连接酶0.5µL
加入连接酶后,枪头在反应混合液中反复吸吐几下,使得酶能够完全加入到反应体系中,并能与其它成分充分混匀。
16℃连接过夜。
(四)转入大肠杆菌DH5a菌株中
1.大肠杆菌感受态细胞的制备
(1)取大肠杆菌DH5a菌株在LB平板上划线,37℃倒置培养12h。
(2)挑取单菌落接种于含5mLLB培养基的试管中,在37℃振荡培养12h,直至对数生长后期。
(3)取上述培养菌液0.5mL菌液接种于含50mLLB培养基的250mL三角瓶中,在37℃振荡(240r/min)培养约2至3小时,至OD600=0.4~0.6左右。
(4)取1mL培养液放入1.5ml离心管,冰上放置10min,使培养物冷却至0℃。
(5)在4℃下,4000r/min离心10min,去上清。
(6)用600µL冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液将菌体轻轻悬浮起来,再在冰上放置20min。
(7)在4℃下,4000r/min离心10min,去上清。
(8)用200µL冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液将菌体轻轻悬浮起来,感受态细胞可在冰浴中放置,24h之内直接用于转化。
也可加入占总体积15%的甘油,混匀后,将菌液分装到1.5mL的离心管中,每管100µL,放入-70℃冰箱中备用。
2.细胞的转化
(1)取100µL感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
(2)加入PTE重组质粒溶液10µL(总量不超过50ng),轻轻摇匀,冰上放置30min。
另取100µL感受态细胞悬液,加入同体积的灭菌水代替质粒DNA,作为对照组。
(3)42℃水浴中热激90s,热激后迅速置于冰上冷却3~5min。
(4)向管中加入400µLLB液体培养基(不含Amp),混匀后,37℃振荡培养45min~1h,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。
(5)将上述菌液摇匀后取100µL涂布于含卡那霉素的LB平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养14~16h。
对照组一取100µL菌液涂布于含相应抗生素的平板上;对照组二稀释100倍后涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。
(五)目的蛋白的诱导表达及分离纯化
(一)蛋白质的诱导表达
(1)将含有pET重组质粒的DH5a菌种(转化子)在LB固体培养基(含50μg/mLKan)上划线,37℃培养12~24h。
(2)用无菌牙签挑取单菌落接种到含5mLLB液体培养基(含50μg/mLKan)的试管中,37℃振荡培养过夜。
(3)按照1:
100比例分别接种到两瓶含50mL液体LB培养基(含50μg/mLKan)的三角瓶中,37℃培养3h。
(4)取一瓶菌液加入IPTG至终浓度1mM,诱导培养3h,另一瓶不加IPTG继续培养3h,作为对照。
(4)分别取诱导及对照菌液1.5mL于1.5mL小离心管中,5000r/min,10min离心收集菌体。
(5)用100μL1×样品缓冲液悬浮菌体,沸水煮5min,冷却。
(6)12000r/min离心10min,上清液用于电泳。
(二)SDS-PAGE
1.电泳槽的安装
目前国内大多数学生实验室用的是国产电泳槽。
首先要将两个洗净擦干的玻璃板夹在一个硅胶套上,其中一个玻璃板上面高于另外一个玻璃板2~3cm,上面高的玻璃板下面与胶条之间有一个狭缝。
然后将硅胶套连同双层玻璃板夹在两个有机玻璃制成的半电泳槽上,注意有狭缝的一边在下面
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