针药结合干与大鼠局灶性脑缺血组织ATP酶活性及能量代谢的研究.docx
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针药结合干与大鼠局灶性脑缺血组织ATP酶活性及能量代谢的研究
针药结合干与大鼠局灶性脑缺血组织ATP酶活性及能量代谢的研究
严文广,谢雪姣,黄政德,司友琴
【摘要】目的探讨针药结合干与大鼠局灶性脑缺血组织ATP酶活性及能量代谢的研究。
方式将大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)持续脑缺血模型为研究对象,实验设假手术组、模型组、血塞通组、针刺组、针药组,观看术后4、24、72h的神经功能缺损评分,比较各组的脑梗死体积,用分光光度法检测钠钾离子泵(Na+,K+-ATPase)、钙离子泵(Ca2+-ATPase)、镁离子泵(Mg2+-ATPase)的活性,用高效液相色谱法检测三磷酸腺苷(ATP)、总腺苷酸(TAN)的含量。
结果①各医治组梗死灶体积明显小于模型组(P<0.01);针药组梗死灶体积明显小于血塞通组、针刺组(P<0.01)。
②除假手术组外,各组动物从4h至72h神经功能缺损评分均有所降低,其中针药组神经功能缺损评分较针刺组低(P<0.01)。
③假手术组、医治组Na+,K+-ATPase,Mg2+-ATPase,Ca2+-ATPase活性均较模型组高(P<0.05);针刺组与假手术组比较不同有统计学意义(P<0.05),针药组、血塞通组与假手术组比较不同无统计学意义(P>0.05)。
④模型组、血塞通组、针刺组ATP均较假手术组低(P<0.01),针药组ATP值比假手术组低,但不同无统计学意义(P>0.05),与模型组比较不同有统计学意义(P<0.05);针药组ATP较血塞通组、针刺组高(P<0.05)。
模型组、血塞通组TAN较假手术组和针药组低(P<0.05)。
结论血塞通组、针刺组、针药组均能改善急性脑缺血大鼠神经功能。
针药组优于针刺组和血塞通组。
【关键词】针刺;血塞通;脑卒中;大鼠;缺血模型;督脉;风府;人中
〔Abstract〕ObjectiveToinvestigatetheactionsoftherapycombinedacupunctureandmedicineforpathogenesisofcerebralischemicstrokeandtheeffectofthatonenergymetabolism.MethodsEightySDratswererandomlydividedinto5groups:
fakesurgerygroup,modelgroup,Xuesaitonggroup,acupuncturegroup,Xuesaitong+acupuncturegroup.Thescoreofthedeficientneuralfunctionandthebehaviorwereobservedat4th,24thand72thhourafteroperation;Thevolumeofcerebralinfractionwascompared;TheactivitiesofNa+,K+-ATPase,Ca2+-ATPaseandMg2+-ATPaseweredetectedwithspectrophotometry.ThelevelsofATP,ADPm,AMPandTANweredetectedwithhigh-performanceliquidchromatography.Results①Thevolumesofcerebralinfarctsinalltherapeuticgroupswerelowerthanthatinmodelgroup(P<0.01).ThatinXuesaitong+acupuncturegroupwaslowerthanthoseinXuesaitonggroupandtheacupuncturegroup(P<0.01).②Inallthegroupsexceptforfakesurgerygroup,theneuralfunctiongradesandthebehaviorgradeswerereducedfrom4thto72thhour.TheneuralfunctiongradesinXuesaitong+acupuncturegroupwaslowerthanthoseinacupuncturegroup(P<0.01).ThebehaviorgradesinXuesaitong+acupuncturegroupwaslowerthanthoseinXuesaitonggroupandtheacupuncturegroup(P<0.05).③TheactivitiesofNa+,K+-ATPase,Ca2+-ATPaseandMg2+-ATPaseinfakesurgerygroupandtherapeuticgroupswerehigherthanthoseinmodelgroup(P<0.05);Theactivitiesinacupuncturegroupweresignificantstatisticallycomparedwithfakesurgerygroup(P<0.05);TheactivitiesinXuesaitong+acupuncturegroupandXuesaitonggroupwerenotsignificantstatisticallywithfakesurgerygroup(P>0.05).④ThedifferenceofAMPandADPwasnotsignificantstatisticallyinallgroups(P>0.05);TheATPlevelsinmodelgroup,Xuesaitonggroupandacupuncturegroupwerelowerthanthoseinfakesurgerygroup(P<0.01),thedifferencebetweenthemwasnotstatisticallysignificant(P>0.05),butwasstatisticallysignificant(P<0.05);ATPinXuesaitong+acupuncturegroupwashigherthanthatinXuesaitonggroupandacupuncturegroup(P<0.05)andTANinmodelgroupandXuesaitonggroupwerelowerthanthoseinfakesurgerygroupandtheXuesaitong+acupuncturegroup(P<0.05).ConclusionAllXuesaitong,acupuncturinginpointRenzhong,Baihui,FengfuandDazhui,Xuesaitong+acupunctureareeffectivetoimprovethenervefunctionofacutelocalcerebralischemicrats.ThecurativeeffectofXuesaitong+acupunctureisbetterthanthatofXuesaitongoracupunctureonly.
〔Keywords〕acupuncture;Xuesaitong;cerebralstroke;rats;cerebralischemicmodel;Meridi
中风病(Stroke)是人类三大死亡缘故之一,致残率高居第一名[1]。
我国中风病的年发病率为110~180/10万,每一年新发病例约130万人,死于中风者近100万人,患病人数高达500万人以上,约3/4的幸存者有不同程度的残疾,且最近几年来发病率有慢慢上升的趋势[2]。
缺血性脑卒中(cerebralischemicstroke,CIS)又称脑梗死,是好发于中老年人的一种常见病,其多发病率、高致残率给社会和家庭带来了繁重的负担。
笔者前期研究发觉中药血塞通对缺血性脑卒中有较好的医治成效[3],为进一步观看其与针刺督脉经穴(人中、百会、风府、大椎)合用的医治成效,探讨了不同的干与方式对急性局灶性脑缺血模型的调剂及可能的作用机制,现将实验方式及结果报导如下。
1材料与方式
1.1材料
1.1.1动物4~6月龄SD系大鼠80只,雌雄各半,体质量200~250g,由湖南中医药大学实验动物中心提供,合格证号:
20-004。
1.1.2药物及试剂血塞通注射液为黑龙江至宝岛药业产品(批号040505),红四氮唑(TTC)、ATP酶试剂盒、考马斯亮兰(G-250)、标准牛血清蛋白为武汉博士德生物试剂公司产品(批号别离为030116、040816、030913、040717)。
1.1.3仪器G6805-A型电针刺激仪(上海医疗仪器厂);721B型紫外分光光度计(上海仪器三厂);LC-6A高效液相色谱仪(日本岛津公司);MIAS医学图像分析治理系统(北航);AEU-210电子分析天平(湘仪天平仪器厂)。
1.2方式
1.2.1分组将大鼠随机分为假手术组、模型组、血塞通组、针刺组、血塞通+针刺组(下称针药组)共5组,每组16只,雌雄各半。
1.2.2造模插线制备:
插线选用入口高碳素钓鱼线,直径0.22~0.26mm,长度40~50mm,并在距前端15mm、20mm处作标记,以液态硅胶处置后置肝素盐水中浸泡备用。
模型制备:
参照Koizumi的方式[4],制备模型。
术后各组大鼠切口严格络合碘消毒,青霉素肌注(每次4万U/只)抗炎。
1.2.3给药方式各组均从造模后10min开始腹腔注射给药,2次/d,持续3d。
假手术组、模型组和针刺组,天天分2次腹腔注射相应体积生理盐水,血塞通组和针药组腹腔注射血塞通50mg/kg,剂量按人鼠体表面积折算,均相当于成人临床等效剂量,所有大鼠均单笼饲养,自由饮水摄食。
1.2.4针刺方式依照文献报导[5],选用医治缺血性脑卒中最常利用的督脉经穴(风府、人中、百会、大椎)4个穴位。
实验进程中,针刺组、针药组所有大鼠均于造模后10min开始电针医治,刺法参照《实验针灸学》[6]。
以1寸毫针,沿皮斜刺人中、百会、风府、大椎四穴,将针柄别离连接至电针仪的电极上,频率5~10次/s,电针刺激强度以肌肉轻微抽动或耳廓轻微抖动为度,一样3~5V,时刻持续30min,24h重复1次,共3次。
1.2.5神经功能缺损评分方式神经功能缺损评分[7]:
在造模前、造模后4、24、48、72h别离进行评分,评分标准为:
0分,无神经损伤病症;0.5分,竖毛,轻度运动低下;1分,前肢屈曲,运动障碍;2分,行动不和谐,屈曲姿势,旋转运动;3分,偏瘫,不能站立行走;4分,痉挛,嗜睡;5分,死亡。
本实验入选实验动物评分均为1~3分。
1.2.6脑梗死体积的检测各组实验动物均取6只,于造模后72h造成神经功能缺损后,当即断头取脑,用生理盐水洗净,放入冰箱冷藏5min后掏出,平放于鼠脑垫上,拿出两片刀片,将其中一片固定一端,另一刀片沿鼠脑垫垂直均匀切片,每片厚2mm,将其放入盛有2%红四氮唑溶液中,置于37℃恒温箱中水浴孵育30min后,置于4%中性多聚甲醛溶液中固定,梗死部份呈白色,正常部份呈红色。
掏出平置于载玻片上,以刻度尺标记,电镜摄像,病理图像分析软件计算出脑梗死体积,占同侧大脑半球百分比例。
1.2.7Na+,K+-ATPase,Ca2+-ATPase,Mg2+-ATPase活性测定
各组实验动物10只,断头取脑后,用生理盐水洗净,冰上分离取海马,吸干水分,取约2/3海马组织,迅速置电子天平上称量,记录后用冻存管保留于-80℃超低温冰箱,用作ATP酶检测。
迅速掏出冻存管,将标本放入匀浆管,按10mg/100μL加入匀浆液,置高速匀浆机充分匀浆后取上清备用。
取标准牛血清蛋白配成480μL标准对照品;Bradford法[8]配制蛋白质浓度检测液:
50mg考马斯亮兰(G-250)溶于25mL95%乙醇中,加入50mL85%(V/V),双蒸水稀释到500mL。
依照ATP酶试剂盒说明书配制试剂和0.5mmol/L标准磷应用液(应为浅黄色,假设无色那么试剂失效,假设为蓝色那么为磷污染,定磷剂现用现配),依照标准操作步骤完成(1)酶促反映:
将上清液别离加入不同试剂,混匀,37℃水浴准确反映10min;再将试剂混匀,3000~4000r/min离心10min取上清200μL定磷。
(2)定磷:
取上清液与试剂混匀,37℃水浴准确反映30min,冷却至室温,在660nm处,蒸馏水调零比色,在595nm处采纳Lowry法检测蛋白质浓度。
计算公式
组织中ATPase活性umolPi/(mgprot·h)=×标准管浓度(0.5umol/mL)×反映体系中样本稀释倍(2.5)×
计算出Na+,K+-ATPase,Ca2+-ATPase,Mg2+-ATPase值,其中OD值用紫外分光光度计测定。
1.2.8ATP,TAN含量的测定各组实验动物断头取脑后,取海马的另1/3,在冻结状态下破碎,称取10mg脑组织于离心管中,加入经预冷的0.42mol/L高氯酸500μL混匀,旋涡振荡置冰箱中,中断振荡3次,提取15min,于-10℃以3800r/min离心10min,取200μL上清液加85μLKOH(1mol/L),旋涡振荡1min,再于-10℃以4000r/min离心10min,取20μL上清液上样,进行高效液相色谱分析。
色谱条件为:
色谱柱系DiamsonilC18(200mm×4.6mm,i.d.5μm,迪马公司),流动相:
100mmol/LK2HPO4/KH2PO4(pH6.0,内含5mmol/L四丁基硫酸铵):
甲醇(86∶14),应用前通过0.45μm的过滤膜过滤,超声脱气,流速:
1.0mL/min,进样量为20μL,柱温为27℃,检测波长:
254nm。
1.3统计学分析
数据以均数±标准差(x±s)表示,采纳SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。
神经功能缺损评分采纳重复测量设计的两因素方差分析,脑梗死体积、Na+,K+-ATPase,Mg2+-ATPase,Ca2+-ATPase,ATP,TAN多组间比较采纳单因素方差分析,两两比较采纳SNK-q法,组间比较采纳析因设计的方差分析。
2结果
2.1各组神经功能缺损评分比较
与模型组同时刻点比较:
各组4、24h神经功能缺损评分不同无统计学意义(P>0.05);48、72h时血塞通组、针刺组、针药组均有降低,不同均有统计学意义(P<0.01)。
各组组内比较:
48h与4h比较,血塞通组、针药组不同有统计学意义(P<0.05);72h与4h、24h比较,血塞通组、针刺组不同有统计学意义(P<0.05),针药组不同有显著统计学意义(P<0.01);72h与48h比较,针刺组、针药组不同有统计学意义(P<0.05)。
在72h时,针药组与针刺组不同有统计学意义(P<0.05)。
见表1。
2.2各组脑梗死体积比较
模型组大鼠经TTC染色后,均发觉左侧MCA供血区显现梗死边界清楚、范围较恒定的惨白梗死灶,梗死灶占同侧大脑比例为(34.06±7.33)%;血塞通组、针刺组和针药组梗死灶边界模糊不清,边界限不规那么,梗死灶占同侧大脑比例别离为(19.17±4.74)%、(17.33±5.48)%和(11.24±4.16)%,均明显小于模型组(P<0.01);针药组脑梗死体积与血塞通组、针刺组显著缩小,不同有统计学意义(P<0.01)。
模型组、血塞通组、针刺组、针药组经析因设计的方差分析,发觉血塞通组与针刺组之间存在交互作用(P<0.01)。
见表2。
2.3各组Na+,K+-ATPase,Mg2+-ATPase,Ca2+-ATPase结果
假手术组、血塞通组、针刺组、针药组Na+,K+-ATPase,Mg2+-ATPase,Ca2+-ATPase活性均较模型组高(P<0.05);血塞通组、针药组Na+,K+-ATPase,Mg2+-ATPase,Ca2+-ATPase与假手术组比较均有不同程度下降,但不同无统计学意义(P>0.05);针刺组Na+,K+-ATPase,Mg2+-ATPase,Ca2+-ATPase与假手术组比较不同有统计学意义(P<0.05)。
见表3。
2.4各组ATP,TAN含量测定结果
模型组、血塞通组、针刺组ATP均较假手术组低(P<0.01);针药组与模型组、血塞通组、针刺组比较,不同有统计学意义(P<0.05);针药组,TAN较血塞通组、针刺组高(P<0.05);模型组、血塞通组TAN较假手术组低;说明血塞通和针刺医治有协同效用。
见表4。
3讨论
急性缺血性脑卒中是临床常见病,预后差,病情复杂,又缺乏特异有效的方式。
ATP酶活性下降和能量供给障碍是急性脑缺血的重要机理之一,可引发和加重脑水肿及脑梗死。
脑组织中高能化合物ATP为维持脑功能和细胞内外离子恒定所必需,其含量转变是反映脑组织能量生成及利用的重要指标。
在缺血缺氧时,脑细胞内ATP慢慢耗竭,依托ATP运转的离子泵(ATPase)活性因能量障碍而受到抑制,同时因为钠、钾泵(Na+,K+-ATPase)、钙泵(Ca2+-ATPase)等活性降低,致使胞内Na+、Ca2+等超载,引发迟发性细胞损伤。
针刺疗法作为初期医治和初期康复的踊跃有效的手腕,有研究说明[9-11],不管出血性中风,仍是缺血性脑卒中,在急性期针刺,其疗效优于在恢复期针刺。
针刺医治能够增加脑血流量,改善脑氧代谢,缩小梗死体积,抑制脑细胞凋亡,对缺血的脑组织起到必然的爱惜作用[12]。
具有扶正固本,疏通经络,调理气血,活血化瘀,扩张血管,改善微循环的作用。
而血塞通注射液是三七提纯制成的,要紧成份三七总皂苷(PamxNotoginsenosides,PNS)。
它具有成份明确,纯度高,剂量准确,疗效稳固,利用方便的特点,是一种很有前途的新型神经爱惜剂。
实验结果显示,血塞通组、针刺组、针药组各项指标均优于模型组,不同有统计学意义(P<0.05或P<0.01);而针药组神经功能缺损改善优于针刺组(P<0.01),也优于血塞通组,但不同无统计学意义(P>0.05),可能与样本含量不够有关;针药组脑梗死体积小,均与针刺组和血塞通组不同有统计学意义(P<0.05);针药组ATP、TAN含量均较其余各医治组和模型组升高(P<0.05)。
与司全明[13]报导相一致。
说明血塞通和针刺督脉经穴均能改善急性脑缺血损伤,且二者之间有协同效用,其疗效显著优于单纯血塞通或针刺医治。
其可能的作用机制是血塞通有消肿、止痛的功效,能诱导神经干细胞特异性分化成非成熟神经元,能够明显提高成熟神经元比例[14]。
二者协同作用,标本兼治,在疾病发生、演变、转归中发挥了多靶点、多效应的有效医治,从整体上改善损伤后神经修复再生,对缺血后脑组织起爱惜作用。
因此有提高治愈率,减少病死率和病残率的显著疗效。
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