第二讲 组织和细胞的培养方法.docx
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第二讲组织和细胞的培养方法
第二讲组织和细胞的培养方法
组织和细胞的培养方法,随培养的组织或细胞的种类以及培养目的而不同。
组织块培养,通常应用玻片悬滴法、旋转管法或卡氏瓶等培养法。
细胞培养,则常应用单层培养法和悬浮培养法。
用于细胞培养或组织块培养的动物胎儿、器官或组织,应在无菌条件下采集后尽快培养。
如需保存一定时间,例如1~2天,可将其切成0.5cm见方的小块后浸泡于营养液内,置4℃冰箱保存,同时加抗生素以抑制细菌生长。
如欲保存更长时间,则应将组织块剪成1-3mm见方的小块,并用Hanks液冲洗2-3遍后,加入5-10倍量的营养液(内含抗生素),置优质玻璃瓶中,盖以橡皮塞后保存于4℃冰箱内。
这样保存的组织块一般经1—2周细胞仍能生长。
但在培养前还需用洗液将其冲洗2-3遍。
如需运送远处,可将带有营养液的组织块瓶置0-4℃冰瓶内运输。
一.组织块培养:
组织块培养是20年代开始应用的最早的组织培养方法,现在已经很少用,只在某些慢病毒和难于在单层细胞内生长的病毒的分离培养上试用。
组织块培养有固定培养和悬浮培养两种方法。
扼要介绍如下。
(1)组织块固定培养法:
将组织剪为0.5-1mm直径小块,用Hanks液洗2-3遍,用吸管吸取6-10块,成直线分散放置于试管壁下1/3处,轻轻把培养管旋转约180度,使组织块粘附在玻璃壁上,加入lml生长液并不使其接触组织块,在头两天每天把培养管旋转2-4次,以湿润组织块,当镜检发现细胞由组织块周围呈放射状增殖后,就可使生长液浸泡组织块,继续培养和换液接种病毒。
(2)组织块悬浮培养法;组织块的制备方法同前。
按每毫升生长液加入10-15块组织的比例,在培养瓶或试管中培养。
早期制造的口蹄疫疫苗(Frenkle疫苗)就是口蹄疫病毒的牛舌上皮组织培养物。
应用猪胎小肠组织块的悬浮培养,也可进行猪传染性胃肠炎病毒的培养和传代。
二.器官培养
培养的器官组织能基本保持原来固有的特性,如气管粘膜能保持纤毛上皮运动。
医学上利用器官培养的人胚鼻和气管纤毛上皮,分离出了一些新的人类呼吸道病毒(如冠状病毒),而这些病毒应用一般的细胞培养是分离不出来的。
兽医病毒学也应注意利用器官培养,以发现那些迄今还未分离成功的病毒。
经器官培养分离的病毒,可逐渐过渡到单层细胞内生长增殖。
器官培养用的组织最好来自妊娠中后期的胚胎,这种组织不仅生长旺盛,而且能保持其固有特性。
采到的器官组织要尽快培养,在普通冰箱中至多保持1—2天(剪成2-3mm小块并加入含10%犊牛血清的营养液浸泡)。
现以胚胎气管和纤毛上皮组织以及肠管为例,介绍器官培养的方法如下。
(1)气管和鼻纤毛上皮:
采取中后期动物胎儿的上述组织,放入含l0%犊牛血清Hanks液的培养皿内,然后用锋利的刀、剪将粘膜及其下部的骨(或软骨)组织切剪为2-3mm的小立方块,在直径约6cm的平皿内均匀地放置4-6块。
摆放时要注意使骨面在下,纤毛面在上。
然后加入含10%犊牛血清的E—MEM或199综合营养液,加抗生素并将pH调整为7.2左右。
营养液的量要能覆盖组织块并稍高出一些,放5%CO2温箱,37-38℃培养。
培养2-3天后开始用倒置显微镜观察纤毛的活动能力,如果纤毛活泼摆动,即可换液,同时接种病毒(或病料)。
也可在器官培养的同时,立即同步接种病毒。
为了延长器官培养的持续时间,以利于病毒的增殖,可于换液接种病毒后放33℃培养(不适用于同步接毒的培养物),每天(或隔天)收获部分液体,冷冻保存,以检查其中有无病毒(或病毒的滴度)。
在整个培养期间,均应注意观察器官组织的活动能力,并与空白对照培养相比较,包括营养液的颜色变化。
(2)肠管培养:
以猪肠管培养为例。
取胎猪空肠一段,在含青、链霉素(每毫升含200ug)的Hanks液中漂洗2-3遍。
纵切成长条,再剪成宽约2mm、长3-4mm小块,用Hanks液漂洗数次,直至洗液清亮为止。
分装入培养瓶,以每毫升营养液内放4—6块组织为宜。
营养液为内含2%犊牛血清的RPMll640或199人工综合营养液。
如培养期短,也可不加血清。
调整pH至7.0,观察1天。
如无污染,且在缓缓翻转培养瓶,看到粘贴于培养瓶壁上的组织块边缘的绒毛存活并继续保持正常的形态结构,即可接种病毒。
三.细胞培养
自1949年Enders等报道脊髓灰质炎病毒在非神经细胞内培养成功并形成细胞病变以来,随着细胞污染和分散剂的进一步解决,已有数百种动物病毒在细胞培养上获得成功。
现代组织培养技术已能使动物的绝大多种细胞在体外培养增殖,并培育出多株二倍体细胞株、可以长期传代的异倍体细胞系、融合细胞以及外源基因导入细胞等多种用途的细胞。
细胞培养与实验动物和鸡胚相比,不仅经济、方便、省时、省力,而且能提供大量生物性状稳定的细胞群体,降低了外界因素的影响,使实验结果更加准确可靠。
因此,细胞培养是病毒学实验研究必不可少的重要工具和手段。
在临床病毒学上常用的细胞类型可分为原代细胞、二倍体细胞株和传代细胞系三大类,其中以原代细胞对病毒最敏感。
从细胞的来源则可分为人源、各种动物源、禽源和昆虫源等。
虽然各种病毒均对其来源动物的细胞最敏感,但也有很多细胞(如鸡胚成纤维细胞等)和传代细胞株、细胞系(如BHK细胞系等),对其来源动物种类以外的多种病毒也能感染。
经过细胞培养传代的毒株,其细胞适应性(细胞感染范围)常更为广泛。
从细胞培养方式的不同,可分为静止培养、转管(瓶)培养和悬浮培养等,其中以静止的单层细胞培养最为常用。
悬浮培养及转瓶培养适于大规模培养细胞,是生产疫苗、干扰素、激素、单克隆抗体和基因工程多肽等生物制品的重要手段。
此外还有着眼于扩大细胞培养面积的微载体培养法等。
(1)单层细胞培养:
现将细胞培养过程中,关于细胞密度、营养液pH、换液和培养温度等几个带共性的问题介绍如下。
细胞密度:
一般讲,密度大些的细胞生长快,但过大对细胞生长不利,而且细胞很快老化。
原代肾细胞的密度以每毫升营养液中含4105-6105个为宜。
鸡胚成纤维细胞约(5105)/ml。
传代细胞系最少,约(2105-3105)/ml。
营养液pH:
细胞生长最适的pH范围为7.0-7.4。
细胞通常可耐受pH6.6-7.8较大范围的变化,但在偏酸、偏碱环境下的持续时间不宜超过24小时,否则细胞将很快老化和脱落。
生长液pH较偏碱更适于细胞贴壁,但培养时的pH仍应保持在7.2-7.4之间。
因为细胞代谢产生的酸性物质很快使pH下降,而影响细胞继续生长。
维持液可稍碱些,调到pH7.4左右。
使用CO2温箱能提供稳定的5%C02,可以有效地自动调节细胞代谢引起的酸碱度变化。
另外在培养液中加人氢离子缓冲剂(如HEPES)能增强培养液的缓冲能力。
换液:
原代细胞生长较慢,在培养48一?
2小时左右换液,能促进细胞增殖,尽快长成单层。
以后则视实验需要和pH变化随时换液。
传代细胞生长旺盛快速,在长成单层后,应及时换液和使用。
如果培养只是为了传代保存细胞,则应于换液后24—48小时,即细胞处于生命旺盛时进行下一次培养传代。
换液,通常是将旧液全部换为新液,但细胞生长缓慢而且形态不正常时,可只换人一部分新液,保留1/4-1/2的旧液。
培养温度:
细胞的培养温度应与细胞来源动物的体温一致或略低1—2℃。
细胞通常能耐受较低温度,但增殖缓慢,多数细胞在30-32℃时,仍可维持其基本代谢和形态。
细胞对高温敏感,温度提高2-3℃即产生不良影响,首先发现形态改变,随后则发生脱落和死亡。
盛夏季节炎热潮湿,更要注意无菌操作,防止细胞遭受细菌、尤其是霉菌污染。
单层细胞培养是研究病毒生物学特性以及病毒与细胞相互作用过程的合适模型。
应用单层细胞培养病毒,常可获得大量高效价的病毒液,用以制造特异性病毒抗原或病毒疫苗。
同时,由于单层细胞培养法的设备条件和操作方法比较简单,因此,单层细胞培养已是当前病毒学中应用最广泛的一种细胞培养方法。
下面重点介绍几种单层细胞的培养方法。
1)原代细胞培养:
应用动物组织器官或胚胎,经过剪碎、消化分散成单个细胞后进行的培养,即为原代细胞培养。
将长成单层的原代细胞培养物,再进行消化分散成单个细胞后继续·培养,以及随后的连续传代培养,则称继代细胞培养。
这种培养细胞可保持原来的二倍体形态,对病毒比较敏感,尤其是原代细胞培养。
各种组织原代细胞的培养方法大体相同,举有代表性的胚胎和组织及白细胞培养方法说明如下:
A.鸡胚原代细胞:
在无菌条件下采取9-10日龄鸡胚,置灭菌平皿中,除去头(或仅除去喙和眼)、爪和内脏,并剪成块,用Hanks液等充分冲洗后移人大号链霉素瓶或其他广口瓶中,用眼科弯形剪将其剪成lmm大小的碎块,加入Hanks液或其他洗液,充分冲洗,并静置几分钟,待组织块下沉,吸弃上层液体,再加洗液,如此反复冲洗2-3遍后,吸弃上清液。
于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶,并调整pH至7.6-7.8,振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟,每10分钟轻轻摇动一次。
取出后小心吸弃上层胰酶溶液,用洗液轻洗2次后,即在洗液内以大口吸管吹打数次或十数次,此时即见大量细胞游离,液体变浑,经用双层亚麻布或72孔不锈钢纱网过滤,收集于离心瓶(管)中,以600r/min的速度离心沉淀5-10分钟,吸弃上清液,按每个鸡胚5ml的量,加入营养液,并用吸管充分吹打,直至形成均匀的细胞悬液,准备细胞计数。
细胞计数时,取上述细胞悬液0.5ml,加入0.1%结晶紫—枸橼酸(0.1mol儿)溶液2ml,置室温或37℃温箱中5-10分钟,充分振荡后,用毛细吸管或吸血管吸取,滴人血细胞计数板内,按白细胞计数法计数四角4大方格内的细胞总数(N)。
注意仅计数胞核与胞浆完整的细胞,成堆的细胞按一个细胞计算。
将4大方格内的细胞总数按下列公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数(n):
n=N/410000K
式中,K为稀释倍数。
根据细胞计数结果,再用营养液将细胞悬液进一步稀释为每毫升含5105个细胞的浓度,即可装瓶培养。
每个小试管或青霉素瓶装lml,每个25ml容量的小瓶装4ml,每个100ml容量的长方形培养瓶装10ml。
置36-37度温箱内培养。
鸡胚细胞在1-2小时内贴壁,几小时至十几小时后开始生长,24~48小时长成单层。
此时即可更换维持液,并接种病毒。
鸡胚细胞常用的营养液为:
生长液:
0.5%乳白蛋白水解物97ml
犊牛血清2-5ml
抗生素溶液lml
以碳酸氢钠溶液调整pH至7.2-7.4。
维持液:
0.5%乳白蛋白水解物98ml
醋酸钠溶液(240mg/m1)lml
抗生素溶液1ml
根据需要或细胞生长情况,加或不加1%-2%犊牛血清,并以碳酸氢钠溶液调整pH至7.6左右。
鸡胚细胞当然也可用人工综合营养液培养。
各种组织的原代细胞培养,除常应用上述热消化方法外,也可用冷消化法,两者效果相同。
方法很简单,即在普通冰箱中静止放置14-18小时,代替上述的37℃水浴消化。
其他程序相同。
若想将原代细胞培养物继续传代时,应于换液后1-2天挑选细胞形态好密度又大的培养瓶,倾弃营养液,经Hanks液洗2-3遍后,加入胰酶消化液少许(能以细胞单层面铺上一薄层为度)消化数分钟(其间不时摇动消化液),当看到细胞单层变白和出现空洞时,用手掌拍打瓶壁,此时细胞即很快全部脱落。
先加人少量营养液,用吸管吹打分散细胞后,再按培养瓶原来液量的2倍加入新营养液,混匀并分装成两瓶后继续培养,即为继代培养细胞。
原代细胞一般比较容易在继代培养中生长,但继续向后多次培养传代时,细胞往往生长不良,并逐渐衰老死亡。
B.仓鼠肾原代细胞:
取10-14日龄的幼仓鼠,剪断颈动脉放血至死。
用自来水适当冲洗,以除灰尘,置清洁搪瓷盘中,背向上,移人无菌室或无菌罩内,先后用碘酊和70%酒精充分消毒,用剪刀沿背中线剪开,并向四肢延展。
更换镊子及剪刀,将皮肤撕向两侧,露出背部。
再换剪刀,于肋骨后剪一长约lcm的切口,将镊子插入切口夹住肾脏,剪断附连物后,将肾移人灭菌平皿内。
按同样方法取出另一侧肾。
另一个更简单且较少污染的方法,是在将幼仓鼠颈动脉放血致死后,即在颈胸交界处全周地剪开皮肤,朝尾部方向撕下整个鼠皮。
随即置清洁搪瓷盘内,并送无菌室(罩)内采肾如前述。
随后在平皿内剪除附着在肾脏上的脂肪,并剥去肾包膜,用剪刀将肾平剪成两半,剪除肾盂部分,用Hanks液冲洗,移人广口玻璃瓶中剪碎,洗涤后加入0.25%胰酶消化。
消化可在37℃水浴中进行热消化。
也可将其置于4℃冰箱内作冷消化,一般在静置条件下冷感作14-18小时。
消化后的操作和计数方法同前。
通常作成每毫升5105的细胞悬液。
培养方法亦如前述。
仓鼠肾原代细胞的生长液可用加有10%犊牛血清的0.5%乳白蛋白水解液,维持液的血清用量减半或减至2%-3%。
人们目前乐于应用人工综合营养液。
C.皮肤原代细胞:
各种动物的皮肤均可培养,但以胎儿皮肤为宜。
一般由腹部或后肢内上侧剪取皮肤,按上述方法进行冲洗、消化和培养。
以0.25%胰酶于4℃冷消化18-20小时的效果较好。
营养液为含30%犊牛血清的0.5%乳白蛋白水解物;或0.5%乳白蛋白水解物与E—MEM的等量混合液,内含30%犊牛血清,pH7.2。
维持液的血清含量减至20%。
由于皮肤细胞的分散比较困难,胰酶消化后往往仍有较大的颗粒状组织块,培养时经常悬浮于营养液内,不易贴壁,难于形成单层。
现介绍一个简单而比较有效的方法。
作者等试用于驴胎皮肤细胞的培养,较易形成单层:
采取皮后将其切(剪)成lmm见方的小块,以大量洗液冲洗,吸干洗液后加入少量营养液。
应用弯头大口吸管吸取营养液和组织块,注入培养瓶中,使每个100ml容量的培养瓶含有1-1.5ml的营养液和30-40个组织块,并用吸管头将组织块适当地分散排列。
因为培养瓶内的营养液很少,组织块基本上暴露于空气中,仅使玻璃瓶的培养面保持于湿润状态而已。
如果培养瓶内的营养液太多,组织块漂浮于其中,则应将多余营养液吸走。
稍稍扭松瓶塞,置CO2温箱中,于37℃静置培养1-2小时,随即取出,塞紧瓶塞,以保持瓶内具有一定量的C02。
置37℃普通温箱内培养1-3天,此时多数组织块已经贴壁,即可沿瓶颈缓缓加入lml营养液。
此后每2-3天加一次营养液,每次加人1-3ml,直到加至10ml。
如果细胞生长旺盛,常可一次加足至10ml。
待其长成单层,即可换液,并接种病毒。
换液时用力振荡,可使原来的组织块脱落,而仅留下生长旺盛的单层细胞。
D.骨髓原代细胞:
无菌采取动物(胎儿)长骨,折断后刮取骨髓,置营养液内用大口吸管充分吹打,收集混浊液体,移人另一灭菌瓶中,稍予沉淀(约l-2分钟)。
此时瓶底有较大块状物的沉淀,液面则有油脂漂浮。
另换吸管或连有针头的无菌注射器,小心吸取中层混浊液体,分装培养。
24小时后观察,细胞已经贴壁,再待1天后换液。
置低倍镜下观察,可见许多纤维样或长梭形细胞,并有大量圆形和短梭形细胞分布其中。
这是骨髓中造血干细胞和结缔组织细胞等多种细胞的典型混合图像。
此时接种病毒,病毒选择性地在敏感细胞内生长,而不敏感细胞则常继续增殖。
培养豚鼠、仓鼠等小型实验动物的骨髓细胞时,可先剪去长骨两端,随后用注射器吸取营养液,压人长骨腔,冲洗出腔内的骨髓细胞,吹打混合培养。
骨髓原代细胞的营养液可以选用①全犊牛血清;②犊牛血清与0.5%乳白蛋白水解物的等量混合液;⑧犊牛血清与199或E—MEM的等量混合液。
pH为7.2左右。
E.马属动物原代白细胞:
是在体外玻璃瓶内贴壁培养的白细胞,其实只是血液中的巨噬细胞,即大单核细胞。
多形核细胞虽可贴壁,但于3-6天内自行脱落。
淋巴细胞不贴壁,一般只作悬浮培养。
由于马属动物的血沉很快,因此容易由静置的抗凝血液的血浆部分取得白细胞,不必采用特殊的白细胞分离技术。
先在采血瓶内按采血量加入肝素溶液,并置冰箱内适当预冷(以减少白细胞对采血瓶的贴壁)。
由动物颈静脉采血,摇匀后尽快置4℃冰箱内,静置30-40分钟,待红细胞完全沉淀后,用吸管小心吸取上层血浆,置离心瓶(管)中,加入Hanks液或Earle液,振荡混合后,以1000r/min的速度离心沉淀10分钟,倾弃上清液,力口少量洗液,悬起沉淀细胞,充分混匀,再加洗液至满瓶,以800r/min的速度离心沉淀10分钟。
倾弃上清液,加入牛血清,以吸管充分吹打,混匀后进行细胞计数,最后稀释为每毫升含细胞1107-2107个。
装瓶培养,1-2小时后细胞贴壁,24小时后可见细胞出芽,此时或再待12—24小时后换液,同时接种病毒。
应用牛血清培养马属动物白细胞,存在一个所谓的“对号”问题,也就是某批牛血清适于某匹或某几匹马、骡、驴的白细胞的培养,但用于另一匹或另几匹马、骡、驴的白细胞即不能获得良好的培养结果。
因此必须事先试验各批牛血清与各该动物白细胞的适合性。
根据作者的经验,以2-3头牛的混合血清较好。
培养马和骡的白细胞,最好应用犊牛血清,驴白细胞的培养要求稍低,可以应用成年牛血清。
也可分别应用含血清50%或20%的199人工综合营养液、E-MEM营养液作为生长液和维持液。
有人建议生长液中的血清含量不要超过20%,据云血液巨噬细胞在这种营养液内的发育较慢,但可以长期活存达几周之久(于5%CO2环境中)。
血液中淋巴细胞的培养,可按上述同样方法制备白细胞培养悬液,并用营养液将其进一步稀释成每毫升约含2000万细胞的浓度。
倾人灭菌平皿或培养瓶内,液面厚度不超过2-3mm,37℃静置培养一小时。
随后吸出上层液,注入另一灭菌平皿或培养瓶内,如上37℃静置培养一小时。
由于单核巨噬细胞、多形核白细胞等均已吸附于玻璃表面,吸取的上层液中主要就是淋巴细胞。
用营养液将其稀释成每毫升106-107个细胞,即可分装培养。
营养液为PRMll640,内加20%犊牛血清。
置5%CO2环境中培养,约可活存2周(此时活细胞约占细胞总数的50%-55%)。
如在营养液内加入植物血凝素(1-30g/m1),可使淋巴细胞激活,并分化为母细胞,显微镜下可见出芽和增殖现象。
F.猪、牛等动物原代白细胞:
猪、牛及其他血沉缓慢的动物的白细胞,不能应用静置抗凝血的方法。
因此,必须采取相应的措施,才能取得白细胞。
采取肝素抗凝血如前,立即加入等量的犊牛血清或1/5量的6%葡聚糖PBS溶液,4℃冰箱静置1小时,吸取上层血浆,如上收集白细胞、洗涤和培养。
由于葡聚糖的分子量不同,而各种动物血液成分的比重也不尽相同,因此必须通过预备试验,调整葡聚糖溶液的浓度或其加入量,务使红细胞在静置时较快下沉,上层血浆中含有较多的白细胞。
上述的葡聚糖浓度及其加入量是指分子量为184000的葡聚糖。
作者等采用蒸馏水裂解红细胞的方法,成功地分离和培养了猪和狗的血液巨噬细胞。
具体方法是采血于盛有玻璃珠的脱纤瓶内,充分振摇脱纤。
随后将脱纤血吸人或倾人另一离心沉淀瓶(管)内,以l500r/min的速度离心沉淀15分钟,吸出上层血清,保存备用。
于沉淀血细胞中加入1.2倍容量的三馏水或去离子水,充分振荡混合,再以1200r/min的速度离心沉淀12分钟,小心倾出黑红色溶血液,瓶底留下6-7ml底液(指50ml离心瓶)。
再加蒸馏水10ml,振荡混合后立即加入洗液至满瓶,再以1000r/min的速度离心沉淀10分钟。
届时取出,可见瓶底有白色或红白色沉淀细胞。
如红细胞太多,可倾弃上清液,并加洗液至满瓶,再以900r/min的速度离心沉淀10分钟,即可获得白色的细胞沉淀。
加入少量营养液,充分振荡混合,经细胞计数后再行稀释为每毫升含1000-2000万个细胞的细胞悬液。
猪、牛、狗及其他动物的白细胞也可用犊牛全血清培养,或者应用犊牛血清和199人工综合营养液(或PRMll640)的等量混合液。
维持液中的血清含量减至20%。
血液中白细胞的分离方法颇多,例如葡聚糖—泛影葡胺分层法、明胶沉淀法和玻璃纤维(玻璃珠)吸附—洗脱法等等。
这些方法或则操作比较复杂,易于污染,或则只适用于小量血液样品中白细胞的分离,病毒实验室较少应用。
2)二倍体细胞株培养:
二倍体细胞株的增殖代数与其来源动物有一定关系,如人胚肺细胞株可传50代或更多的代数,而马和牛的胚胎细胞株的传代次数较少。
医学上很重视二倍体细胞,如由人胚胎建立的成纤维细胞株,广泛用于人类病毒病的诊断、药物筛选和疫苗制造。
特别是人用疫苗生产,医学上大多使用二倍体细胞。
但美国最近批准使用Vero传代细胞系生产人用狂犬病疫苗。
来源于动物组织的二倍体细胞株也不少,但目前应用不广泛。
兽医实验室包括生物制品厂一般多应用原代细胞和传代细胞系,但疫苗生产最好不用传代细胞系。
一些实验室常根据需要自行培育继代细胞株。
作者实验室就曾建立过马属动物的传代细胞株。
传代细胞株使用的营养液与其原代细胞培养基本相同,不再赘述。
现就如何建立二倍体细胞株作扼要介绍。
建立细胞株不是一件轻而易举的事,特别是从3代到7、8代是最不稳定时期,细胞很容易丧失贴壁、增殖能力而衰落死亡。
在建株培养传代过程中,主要应注意以下几点:
原代细胞培养的组织尽可能取自动物胚胎或新生动物,并立即培养;实验设计出最适于该种细胞的生长液和维持液配方,其营养成分应适度丰盛,尤其在生长困难的前期;传代时选用合适的细胞分散剂,尤应注意消化的时间不要过长;传代时接种的细胞数要比一般高0.5-1倍,宁多勿少,视情况可一瓶传一瓶,或两瓶传一瓶,而且一定要利用原瓶(原瓶比新瓶更适于细胞生长);要根据组织来源和动物种类,选择适合的培养温度;培养过程中要根据继代细胞的形态、增殖程度和营养液的pH等,适时地进行换液和传代,应在细胞生长最旺盛、形态最好的时候传代,不要错过时机,此点尤为重要。
为了提高细胞的适应性和成活率,可在原代培养中故意加人一些组织块(可取自消化后残剩的小组织块)与单个细胞同瓶培养。
这些组织块大部分能像单个细胞一样贴壁,并在其周围呈放射状地长出细胞。
下次传代时,仍将残留的组织块消化下来后继续培养,直至消失。
另外,在培养过程中如发现细胞生长不太好,但又到了换液的程度时,可置换部分新液,而残留1/4—1/2的旧液,以利于细胞的适应性和增殖。
经过5-7代培养,生长良好的继代细胞,应大量冻存于液氮中备用。
在继代过程中,每间隔8-l0代,应对细胞的染色体组型进行检查,看其是否仍保持二倍体状态。
如果发现染色体组型已经改变,表明细胞在传代过程中已发生突变,成为可以无限期增殖传代的细胞系。
3)传代细胞系培养;
传代细胞系种类繁多,其中多数来自人和动物的肿瘤组织,部分来自发生突变的正常细胞,它们丧失和改变了原细胞固有的特性,变成了能长期在体外培养传代的异倍体癌变细胞。
传代细胞系的优越性不仅在于可以无限的传代,而且不少细胞系对病毒也很敏感,尤其是某些传代细胞系能在悬浮培养条件下增殖,适合病毒抗原的大量生产。
传代细胞系不仅容易培养,而且生长旺盛,繁殖快速,对营养条件不苛求。
但很多传代细胞系在长期传代过程中遭到支原体和病毒的污染,特别是支原体更为常见,从而影响实验的科学性和准确性,这是在使用传代细胞系时必须注意的问题。
兽医病毒学实验室常用的传代细胞系种类很多,如作者实验室经常保存有Vero(非洲绿猴肾细胞)、BHK—21(乳仓鼠肾细胞)、MDCK(犬肾细胞)、IBRS2(猪肾细胞)、F81和MA—104(猫肾细胞)、FL(人羊膜细胞)及HeLa(人子宫颈癌细胞)等细胞系。
不用时保存于液氮罐中,用时取出培养复苏。
农业部兽医药品监察所和国家卫生部生物药品检验所均保存有多种传代细胞系和二倍体细胞株,对外实行有偿供应。
传代细胞系的培养方法基本相同。
各种人工综合营养液和乳白蛋白水解物均可用作营养液的基础。
A,猪肾传代细胞:
在现有的一些猪肾细胞株中,既有经过严格鉴定并低温保存的二倍体细胞株,也有已经发生恶性变,丧失原来正常的二倍体组型而成为所谓异倍体的传代细胞系。
但是它们的营养液和传代方法基本相同。
取已长成单层的猪肾细胞,倾弃原来的营养液,最好再用Hanks液等冲洗一次。
加入0.02%EDTA溶液或0
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- 第二讲 组织和细胞的培养方法 第二 组织 细胞 培养 方法