园林植物遗传实验指导.docx
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园林植物遗传实验指导
园林植物遗传实验指导
东北农业大学园艺学院
目录
实验一观赏植物生物学性状调查1
实验三花粉贮藏及花粉生活力的测定5
实验五植物根尖细胞染色体制片技术与观察8
实验六花粉母细胞减数分裂制片法11
实验七花粉管生殖细胞的有丝分裂12
实验八园林植物多倍体的诱导与鉴定14
实验九植物总DNA的提取17
实验十植物总RNA的提取20
实验十一PCR扩增技术22
实验十二植物RAPD分析技术24
实验13植物染色体标本制备及核型分析27
实验14植物染色体分带技术49
实验15植物诱导染色体结构变异54
实验16荧光原位杂交实验55
附录57
实验一观赏植物生物学性状调查
一、目的要求
掌握观赏植物生物学性状调查的目的、内容和方法,通过调查填写调查表,根据调查表比较同种观赏植物不同品种间观赏性状的差异,并学会利用花卉品种分类检索表为调查到的花卉进行品种鉴定。
二、材料用具
1、材料
各类观赏植物(草花、灌木、乔木、藤本)。
2、用具
钢卷尺、游标卡尺、皮尺、标杆、记号笔、铅笔、小卡片、细线、统计表等。
三、实验内容
观测不同植物品种的观赏与经济性状,包括株型、花、果实、抗性等特征,对其进行比较和评价。
数量性状一般按三级记载。
具体观测性状如下:
1、株型:
包括株高、枝下高、冠长、冠幅(株幅)、冠形、分枝角度、分枝数、枝叶的特征、植株生长情况等。
2、花的特征:
包括花期、花型、花朵大小、花色、花香、开花数量等。
3、结实情况:
包括果实的形状、大小、多少等。
4、抗性:
包括抗寒性、抗热性、抗旱性、抗病性、抗虫性、耐阴性等。
5、特殊的经济价值或观赏价值。
(一)木本花卉生物学性状调查
1、试验材料的选择
根据实验的时间地点选择正值花期的木本花卉,春季可选木兰、樱花、榆叶梅、梅花、碧桃等,夏秋季可选紫薇、石榴、黄花槐、夹竹桃、桂花、洋紫荆、大叶醉鱼草、木芙蓉等,要求该木本花卉有2个以上品种的成年植株,通过品种性状调查,比较品种间观赏性状的差异。
试验植株应选择个体差异小的,既具有相同树龄和相同繁殖栽培方式。
每个品种应有10个以上个体的重复。
每个供试植株进行编号,用细线把写有标号的卡片系在树体明显位置,同一品种的供试植株编为一组。
2、调查测量
按照由远及近、由外而内、由大到小的顺序进行测量。
首先远观树形及长势,然后测量树高、树径、冠幅,接着进行主枝主干、一二年生枝、叶片、花、果实与种子的观察测量。
对于乔木株高的测量需用带有尺寸的标杆,标杆从树冠内部向上伸至与树同高,标杆与地面间的距离用皮尺测量。
冠幅的测量采用两个标杆垂直指向树冠最外围东西南北四个方向的枝条末端,测量标杆间的距离。
叶片大小采用叶长乘叶宽的方式表示。
3、填写调查纪录表
根据表1的内容对木本花卉测量数据进行纪录,室外实验纪录应用铅笔,避免沾水而字迹模糊,回到室内后整理。
表1 木本花卉品种性状调查记载
编号
记 载 内 容
备注
植株情况
1
生态型
a.乔木; b.小乔木; c.灌木状
2
生长势
a.强壮; b.中等; c.衰弱
3
树高
m
干高
㎝
地径
㎝
胸径
㎝
4
冠形
树冠紧密度
5
树冠幅度
东西向m; 南北向 m
主干、主枝状况
6
树皮颜色
开裂方式
7
皮孔密度
皮孔形状
一、二年生枝条性状
8
一年生枝
平均长度
㎝
节间平均长
㎝
嫩枝色泽
皮孔密度
毛被物
9
二年生枝
平均长度
㎝
节间平均长
㎝
色泽
皮孔密度
叶的性状
10
叶片大小
叶 形
11
叶片质地
叶片触觉
12
叶脉
侧脉、网脉明显度
13
叶缘
锯齿形状
14
叶缘波曲度
叶面凹曲度
15
叶尖
叶基部
16
新叶叶色
成年叶叶色
17
叶柄平均长
叶柄色泽
花的性状
18
花序是否具伸长总轴
花序类型
19
每花序着花量
最多朵
最少朵
平均朵
20
整株着花密度
21
香气
22
每百朵鲜花重
g
23
花序总梗长度
~㎝
柔毛
a.有; b.无
24
花梗长
㎜
色泽
25
花萼
色泽
26
花瓣开裂
裂瓣深度
花瓣形状
花冠形状
27
花冠直径
花色
28
雄蕊
子房
果实种子性状
29
是否结实
果实形状
30
果实颜色
果实大小
31
成熟期
鲜果千粒重
32
种子形状
种子千粒重
(二)草本花卉生物学性状调查
1、试验材料选择
根据实验时间选择正开花的草本观赏植物植株,同一个种的不同品种,要求所选植物为同一批种苗的不同品种,相同培育方法,每个品种应该有10株以上重复。
春季实验可选用报春、雏菊、金盏菊、瓜叶菊、水仙、石蒜、郁金香、风信子等,夏秋季可选用大丽菊、百合、萱草、蜀葵、金鱼草、天竺葵、美女樱等。
每个植物个体编号,每个品种记为一组。
2、调查测量
草本花卉的性状调查重点在花与叶尤其是花,在草花的品种分类上经常用到花期、花色、花型、花大小、花瓣数、雄蕊数量以及株型、叶形、分枝等作为分类标准。
不同的花卉具有不同的分类标准,在进行花卉生物学形状调查统计之前应就所选择的实验花卉的品种分类标准编制相应的调查表,表2为基本格式。
调查测量根据相应花卉表格的内容进行,叶的性状部分如果出现异型叶应分别测量(比如毛茛科、报春花科、菊科的部分花卉存在基生叶与茎生叶的区别)。
3、填写调查纪录表
根据表2的内容(或针对实验花卉另外编制的调查表)对木本花卉测量数据进行纪录,室外实验纪录应用铅笔,避免沾水而字迹模糊,回到室内后整理。
对调查表中主要的性状差异进行分析。
四、作业
选择几种花卉种类进行调查统计,对统计结果进行分析,利用品种分类检索表为调查到的花卉进行品种鉴定。
或者对已知品种名称的花卉通过调查的性状编制品种分类检索表。
表2草本花卉生物学特性调查表
编号
记 载 内 容
备注
植株情况
1
生态型
a匍匐; b.直立; c.莲座状;d.倾卧;e.缠绕
2
生长势
a.强壮;b.中等;c.衰弱
3
株高
cm
冠幅
cm
4
冠形
树冠紧密度
5
分枝
叶的性状
6
叶片大小
叶形
7
叶片质地
叶片触觉
8
叶脉
侧、网脉明显度
9
叶缘
叶色
10
叶缘波曲度
叶面凹曲度
11
叶尖
叶基部
花的性状
12
花序类型
13
每花序着花量
最多朵
最少朵
平均朵
14
整株着花密度
15
花香及程度
16
花序总梗长度
~cm
柔毛
a.有; b.无
17
花梗长
mm
色泽
18
花萼
色泽
19
花瓣开裂
裂瓣深度
花瓣形状
花瓣数量
20
花冠直径
花冠形状
21
花期
花色
22
雄蕊
子房
实验三花粉贮藏及花粉生活力的测定
为了避免杂交工作时失误,使用外地寄来的花粉、贮藏的花粉、新采的花粉,授粉前必须测定花粉的生活力,这样有利于对杂交结果的分析。
因此我们必须掌握花粉贮藏及花粉生活力测定的原理和技术
一、实验目的
掌握花粉贮藏及花粉生命力鉴定的方法和原理。
二、实验材料
唐菖蒲等植物的花粉。
三、仪器及药品
载玻片、盖玻片、解剖针、镊子、毛笔、干燥器、小指形管、标签、记号笔、显微镜、天平、烧杯、培养皿、滴管、玻璃棒、量筒、电炉、石棉网、冰箱;
凡士林、无水氯化钙、蔗糖、琼脂、蒸馏水、硼酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、碘、碘化钾、氯化二苯基四氮唑(TTC)。
四、实验原理
花粉在低温(0~2℃)、干燥、黑暗等条件下代谢强度降低,花粉贮藏的原理就是要创造这样低代谢的环境条件,从而延长花粉的寿命。
花粉的形态、花粉中酶的活性以及积累淀粉的多少(淀粉质花粉)通常与其生活力密切相关,因此可以利用花粉的形态观察、过氧化物酶、脱氢酶的活性高低、淀粉的含量以及在人工培养基上花粉管萌发的情况作为鉴定花粉生活力高低的标准。
鉴定花粉生活力的方法很多,概括起来主要有如下几种:
1、直接测定法将待测花粉直接授粉,然后统计结实情况。
此法最准确,但需时较长,且实验结果易受气候条件的影响。
也可在授粉后隔一定时间切下柱头,在显微镜下压片检查花粉的萌发情况,根据萌发率的高低来鉴定花粉的生活力。
2、形态观察法直接在显微镜下观察花粉的形态,根据品种花粉的典型性(如具有正常的大小、形状、色泽等)判断花粉的生活力,即形态正常的花粉有生活力,而一些小的、皱缩的、畸形的花粉不具有生活力。
此法简便易行但准确性差,一般只用于测定新鲜花粉的生活力。
3、染色观察法1)碘-碘化钾染色法:
以碘-碘化钾溶液(0.3g碘+1.3g碘化钾溶于100ml蒸馏水)染色后于显微镜下观察,花粉被染成蓝色者表示具有生活力,花粉呈黄褐色者不具有生活力。
2)TTC染色法:
TTC染色是一种鉴定去氢酶活性的组织化学反应,凡具有生活力的花粉在其呼吸过程中都有氧化还原作用,当TTC渗入有活力的花粉时,其去氢酶在催化去氢过程中与TTC结合,使无色的TTC变成TTF而呈现红色。
4、培养基发芽法在培养基上进行花粉的人工萌发,鉴定待测花粉萌发率的高低。
此法
若采用适宜的培养基能较精确地测定出花粉的生活力,但不同植物的花粉萌发条件存在较大的差异,所以很多时候测定的结果也只是相对可靠。
五、实验步骤:
1、花粉的贮藏:
(1)将采集的花粉进行干燥(凉干或放入盛有无水氯化钙的干燥器中干燥),一般以花粉不相互黏结为度。
(2)将干燥的花粉装在指形管中(不要太多,一般以五分之一体积或更少为宜),瓶口塞以纱布,瓶外贴以标签,注明花粉种类、采收日期。
(3)将指形管放入无水氯化钙控制一定湿度的干燥器中,干燥器置于0~2℃的冰箱内。
2、花粉生活力的测定:
(1)染色观察法——TTC染色法
① 配制TTC染色液:
称取0.5gTTC溶于100ml磷酸盐缓冲液(100ml蒸馏水中溶解0.832gNa2HPO4·2H2O和0.273gKH2PO4,pH7.2)中,装入棕色瓶备用。
② 制片:
取少量花粉于载玻片上,滴入1~2滴0.5%TTC染色液,用镊子搅拌均匀,盖上盖玻片,于35~40℃条件下净置15~20min。
③ 观察统计:
在显微镜下观察三个不同的视野,凡被染成红色或玫瑰红的都是有生活力的花粉,黄色或不着色者为没有生活力的花粉。
(2)培养基发芽法——固体培养基
① 配制培养基:
称取1g琼脂,5g蔗糖,量取94ml蒸馏水,装入烧杯,加热使琼脂融化呈透明状(注意补充水分,以保持培养基的浓度),即配成5%浓度的培养基。
同法配制10%、15%、20%浓度的培养基。
② 制片:
用滴管吸取少量培养基,趁热滴在载玻片的凹槽内,放置片刻,使其凝固。
③播种花粉:
将少量花粉均匀地撒播在培养基上,注意不可过多,否则难以观察。
④ 培养与观察:
将制备好的片子放在垫有湿润滤纸的培养皿内,于20~22℃的温箱中培养;待花粉萌发后于显微镜下观察并统计发芽率。
观察时每片随机取三个视野,统计花粉总数及发芽数,计算平均萌发率(花粉总数不少于100粒)。
六、作业及思考题:
1、按下表统计实验结果。
表1染色法测定结果记载表
花粉来源
各视野中花粉数量及生活力
平均生活力
花粉总数
花粉总数
花粉总数
红色
黄色
生活力
红色
黄色
生活力
红色
黄色
生活力
表2培养基法测定结果记载表
花粉来源
培养基浓度
各视野中花粉粒数量及发芽率
第一组
第二组
第三组
平均生活力(%)
发芽数/总数
发芽率
发芽数/总
发芽率
发芽数/总数
发芽率
2、绘一幅花粉粒发芽形态图。
3、比较不同方法、不同浓度(培养基法)测得花粉生活力的高低,分析其原因。
实验五植物根尖细胞染色体制片技术与观察
一、目的要求
学习和掌握植物细胞有丝分裂制片技术;观察植物细胞有丝分裂过程中染色体的形态特征及染色体的动态行为变化。
根尖染色体压片法,是观察植物染色体最常用的方法,也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。
二、实验原理
有丝分裂是植物体细胞进行的一种主要分裂方式。
有丝分裂的目的是增加细胞的数量而使植物有机体不断生长。
在有丝分裂过程中,细胞核内的遗传物质能准确地进行复制,然后能有规律地均匀地分配到两个子细胞中去。
植物有丝分裂主要在根尖,节间,茎的生长点,芽及其它分生组织里进行。
将生长旺盛的植物分生组织经取材,固定,解离,染色,压片等处理即可以观察到细胞内的有丝分裂图象。
如若需要进行染色体计数,则需进行前处理,即取材之后采用物理的或化学的方法,阻止细胞分裂过程中纺锤体的形成,使细胞分裂停止在中期。
这时,染色体不排到赤道板上,而是散在整个细胞质中。
这十分便于对染色体的形态,数目进行观察。
三、试剂和器材
1、材料
大蒜(2n=16);洋葱(2n=16)等根尖为实验材料。
2、试剂
无水酒精,70%酒精,冰醋酸,对二氯苯或秋水仙素,醋酸钠,碱性品红,石炭酸,甲醛,山梨醇,中性树胶或油派胶(Euparal),二甲苯。
(1)卡诺固定液的配制:
用3份无水酒精,加入1份冰醋酸(现配现用)。
(2)染色液的配制:
配方Ⅰ.石炭酸品红(Carbol.fuchsin),先配母液A和B。
母液A:
称取3g碱性品红,溶解于100mL的70%酒精中(此液可长期保存)。
母液B:
取母液A10mL,加入90mL的5%石炭酸水溶液(2周内使用)。
石炭酸品红染色液:
取母液B45mL,加入6mL冰醋酸和6mL37%的甲醛。
此染色液含有较多的甲醛,在植物原生质体培养过程中,观察核分裂比较适宜,后来在此基础上,加以改良的配方Ⅱ,称改良石炭酸品红,可以普遍应用于植物染色体的压片技术。
配方Ⅱ:
改良石炭酸品红。
取配方Ⅰ石炭酸品红染色液2-10ml,加入90-98ml45%的醋酸和1.8g山梨醇(sorbitol)。
此染色液初配好时颜色较浅,放置二周后,染色能力显著增强,在室温下不产生沉淀而较稳定。
(3)解离液配制:
1MHCl或者盐酸酒精解离液(1份浓盐酸加95%酒精1份)
3、器材
恒温培养箱,显微镜,水浴锅,载玻片,盖玻片,单面刀片,镊子,培养皿,量筒,吸水纸,小烧杯或青霉素瓶。
四、操作方法
1、生根:
先将种子浸泡若干小时,然后转入垫有湿润滤纸的培养皿中,或将大蒜或洋葱的鳞基,置于盛水的小烧杯上,置于25℃温箱中。
植物根尖是植物的分生组织,取材容易,操作方便。
植物根尖细胞分裂旺盛,因此,它是细胞有丝分裂相制备与观察的理想选取部位。
大蒜,洋葱易于在水培,沙培,土培条件下生根。
注意在暗处培养。
2取材:
待根长至l.5~2.0cm时,上午9~11点,在细胞分裂旺盛期切取根尖(顶端0.5~1.0cm)。
不同的植物在不同的环境条件,其细胞分裂高峰的时间不同。
大蒜和洋葱的细胞分裂高峰期通常是在上午9~11点,下午15~17点左右。
3前处理:
将根尖放入饱和对二氯苯溶液中浸泡3~4h
细胞分裂中期由于纺锤体的牵引,在制片时染色体经常互相缠绕、重叠,不利于对有丝分裂中的染色体的观察和计数,用理化因素进行预处理,可以改变细胞质粘度,抑制或破坏纺锤丝的形成,促使染色体缩短和分散等。
前处理的方法一般采用低温处理和化学药剂处理。
(1)低温处理:
将根尖放入盛有蒸馏水的烧杯或其它容器内,放在1~4℃的冰箱或其它低温条件下处理24h。
不同的植物对低温的敏感程度不同,效果也不同。
对低温较为敏感的植物是小麦。
(2)化学药剂处理:
常用的药剂有饱和对二氯苯溶液;0.02%~0.1%的秋水仙素水溶液;0.002~0.004mo1/L8—羟基喹啉等。
对二氯苯和8—羟基喹啉对不同的植物效果也不相同。
植物染色体数目多,个体小的适合于使用对二氯苯;而染色体中等长度的更适合于8—羟基喹啉,同时能使缢痕区更为清晰。
秋水仙素溶液对纺锤体的抑制效果最好,一般在室温条件下处理2~4h可达到理想的效果。
如果处理时间过长,染色体会变得更短,不利于对染色体结构进行研究。
4固定:
在青霉素瓶中放入卡诺固定液5ml,放入预处理的根尖10-20条,用塞盖紧,室温下固定12-24小时。
经过固定的材料若不及时使用,可直接转入70%酒精中,保存时间最好不超过二个月。
(也可以经过90%酒精换到85%酒精中各半小时,再换入一次70%酒精,0-4℃冰箱中保存。
)
固定是指用化学药剂将细胞迅速杀死的过程。
固定的目的是为了把细胞生活状态的真实情况保存下来,避免在对细胞操作中使生活状态发生改变。
植物常用的固定剂是Carnoy固定剂,用3份95%的乙醇和1份冰乙酸配制成的。
这二种药品都具有迅速穿透细胞致细胞死亡的特点,但是乙醇是脱水剂,可使细胞脱水变形;冰乙酸又是一种膨胀剂,可使细胞膨胀改变生活状态,把这二种药品按照3:
l配制使用,既可达到迅速杀死细胞又可保持细胞真实生活状态的目的。
固定的时间可根据被固定的材料大小而定,根尖组织固定4~24h可达到固定效果。
固定时间过长,可去掉细胞中的一些脂肪油滴等,便于染色体观察。
但是由于固定时间过长,材料易变脆,变硬,给实验操作带来一定困难。
5解离:
先将固定后的根尖用蒸馏水换洗3-4次,1MHCl放在60℃恒温水浴解离8-10min或者盐酸酒精解离液(1份浓盐酸加95%酒精1份)解离10min。
解离的目的是将分生组织细胞之间的果胶质和纤维素等物质破坏掉,便于在制片过程中细胞容易散开。
常用的解离方法有二种:
(1)酸解:
将lmol/LHCl放在60℃恒温水浴锅中预热,当HCl温度达到60℃时,将根尖放入HCl溶液中。
解离时要注意观察,如果解离时间过长,分生组织会与伸长区脱离,这时分生区已经被解离过软,很难操作,而且染色效果不好。
(2)酶解:
酶解时根尖的伸长区要去掉,只留下分生区。
酶的浓度以果胶酶和纤维素酶分别为2%~3%为宜,等量混合后使用。
酶解温度与解离时间成反比,但是温度不得超过45℃,否则酶会失去作用。
6水洗与低渗
解离后的材料要用清水或蒸溜水冲洗4~5次;酶解的材料洗后还要在水中浸泡10~15min。
水洗的另一个作用是后低渗,对于压片有好处。
水洗时一定要洗净,否则会影响染色效果。
7染色与压片
(1)剔除根冠,在生长锥处切下小块组织,用镊子或解剖针将其碾碎,尽量铺开,除去大块渣滓。
(2)加一滴改良苯酚品红染色5—8分钟,可在酒精灯上加热几秒钟后继续染一段时间。
(3)用镊子取盖玻片与染色液面呈450角徐徐放下,排净气泡,并在盖玻片上铺少量吸水纸。
(4)左手拇指,食指固定盖玻片防止其水平移动,右手以铅笔的橡皮头垂直敲击多次或用解剖针柄轻敲,用力要均匀,或用拇指用力按压盖片。
可使细胞舒展,染色体散开。
如材料形成均匀一薄备状即可进行镜检。
一个解离良好的材料,只要用镊子尖轻轻的敲打盖玻片,分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层。
8镜检
压好的片子要先放在低倍镜下观察,寻找不同分裂时期的典型细胞分裂相,然后,再转换成高倍镜观察。
注意观察细胞核内染色质与染色体结构的特点。
选择典型的细胞分裂相绘图。
五、作业:
1观察染色体数目,绘制你所看到的图象,并说明属于有丝分裂哪一时期。
实验六花粉母细胞减数分裂制片法
一、实验目的
了解植物花粉形成中的减数分裂过程,观察此过程中染色体的动态变化,学习并掌握制备减数分裂玻片标本的方法和技术。
二、实验材料
唐菖蒲、瓜叶菊等园林植物材料
三、用具和试剂
解剖针、镊子、单刃刀片、盖片、载片、显微镜。
卡诺固定液、70%酒精、醋酸地衣红、加拿大树胶、滤纸。
四、实验原理
高等植物性细胞形成过程中,都是先由有性组织(如花药和胚珠)中的某些细胞分化为孢母细胞(2n),进一步由这些细胞进行连续二次的分裂,即减数第一次分裂和第二次分裂,最终各自产生四个小孢子和卵细胞与三个退化的极体(n)。
在减数分裂过程中,可以辨认染色体的形态和数量上的变化,从而为遣传学研究中远缘杂种的分析,常规的组型分析,以及三个基本规律的验证提供直接或间接的依据。
五、实验步骤
1.取材:
选取发育到适当时期的花蕾是观察花粉母细胞减数分裂的关键性步骤。
减数分裂
的植株形态和花蕾大小,依植物种类和品种而不同,须经过实践记录,以备参考,通常应从最小的花蕾起试行观察。
水仙减数分裂一般在球茎未萌动前。
2.固定:
剖开球茎,用镊子取出小花序,用卡诺固定2-24小时,然后保存在70%酒精中,放在冰箱内保存备用。
3.染色压片:
取固定好的花蕾置于载片上,吸去多余的保存液,用解剖针将花药横切,滴上一滴醋酸地衣红溶液,用针头轻压花药,挤出花粉母细胞,去除空壳,立刻置于低倍镜下观察,如有清楚的分裂图像,可加上盖片,在盖片上覆一层吸水纸。
用拇指轻压盖片,使成堆的花粉母细胞散开,勿使盖片错动。
注意观察减数分裂不同时期典型的花粉母细胞及其动态变化。
4.脱盖片
5.封片
六、作业
1.绘制你所看到的图象,并说明是减数分裂的哪一时期?
2.试说明减数分裂与有丝分裂有何不同,其遗传意义何在?
实验七花粉管生殖细胞的有丝分裂
一、实验目的
学习观察植物花粉管生殖细胞的有丝分裂的技术。
二、实验原理
单倍体的花粉粒萌发后进行两次有丝分裂,第一次形成粉管细胞和生殖细胞,生殖细胞在花粉管生长时进行有丝分裂,形成两个雄配子。
这次有丝分裂由于在减数分裂之后,染色体数目比根尖有丝分裂少一半,可以更清楚地观察到,因而对一些植物染色体数目的观察便更为方便。
三、材料
唐菖蒲、瓜叶菊等花序。
四、仪器和药品
硼酸(H3BO3);硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O),硫酸镁(MgSO4·7H2O),
硝酸钾(KNO3),丙酸、蔗糖(化学纯)、乳酸、地衣红、培养皿。
五、试剂配制
1.乳酸-丙酸-地衣红
母液:
50ml乳酸加50ml丙酸加2克地衣红,过夜后过滤。
工作液:
用蒸馏水及母液配制成40%及60%两种浓度。
2.花粉培养液
母液:
H2BO
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- 园林植物 遗传 实验 指导