东师实验5脲酶的制备及其生物学性质的研究.docx
- 文档编号:14710342
- 上传时间:2023-06-26
- 格式:DOCX
- 页数:46
- 大小:33.97KB
东师实验5脲酶的制备及其生物学性质的研究.docx
《东师实验5脲酶的制备及其生物学性质的研究.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《东师实验5脲酶的制备及其生物学性质的研究.docx(46页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
东师实验5脲酶的制备及其生物学性质的研究
综合研究性实验五:
脲酶的制备及其生物学性质的研究
一.实验目的
1.学习大豆脲酶的提取方法;
2.掌握脲酶米氏常数Km的测定方法;
3.掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的方法;
4.测定脲酶的活力单位及此活力;
5.测定温度、PH、抑制剂对酶活性的影响。
二.脲酶提取液的制备
脲酶提取液的制备方法
方法
锥形瓶内加入大豆粉2g和30%的乙醇20mL
30min充分摇匀,放置于冰箱
次日离心15min(3000rpm),取上清液即为脲酶提取液
说明
大豆粉中含脲酶不均一,酶浓度需作预实验稀释或酌情加量,原则上要求尿素浓度最大的一管的光吸收值在0.5-0.7为宜。
另外,脲酶需新鲜配制,本实验脲酶提取液的制备最好在0-5℃下进行,在室温下放置不应超过12h,在冰箱内放置不应超过24h,否则会影响实验结果。
三.脲酶Km的测定
[一]实验原理
Km值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。
测定Km在研究酶的作用机制、观察酶与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑整理用等研究中均具有重要的意义。
当环境温度、pH值和酶的浓度等条件相对恒定时,酶促反应的初速度v随底物浓度[S]增大而增大,直至酶全部被底物所饱和达到最大速度V。
反应初速度与底物浓度之间的关系经推导可用下式来表示,即米氏方程式:
对于Km值的测定,我们通常采用Lineweaver-Burk作图法,即双倒数作图法。
具体做法为:
取米氏方程式倒数形式。
若以1/v对1/[S]作图,即可得下图中的曲线,通过计算横轴截距的负倒数,就可以很方便地求得Km值。
本实验从大豆中提取脲酶,脲酶催化尿素分解产生碳酸铵,碳酸铵在碱性溶液中与纳氏试剂作用,产生橙黄色的碘化双汞铵。
在一定范围内,呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。
通过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度(单位时间所产生的碳酸铵含量与光吸收值成正比)。
具体反应如下:
(1)酶促反应
(2)呈色反应
[二]实验试剂
1.0.05mol/L尿素溶液
2.0.1mol/LpH=7.0Tris-HCl缓冲液
3.10%ZnSO4溶液
4.0.5mol/LNaOH溶液
5.10%酒石酸钾钠溶液
6.钠氏试剂
将碘化钾75g,碘55g,蒸馏水50mL以及汞75g,置于500mL锥形瓶内,用力振荡约15min,待碘色消失时,溶液即发生高热。
将锥形瓶浸在冷水中继续摇荡,一直到溶液呈绿色时止。
将上清液倾入1000mL量筒内,并用蒸馏水洗涤残渣,将洗涤液也倾入量筒中,最后加蒸馏水至1000mL,此即为母液。
使用时取母液15mL加10%NaOH溶液70mL及蒸馏水13mL混合即成。
[三]操作步骤与实验结果
加入试剂量单位为mL
试管编号
0
1
2
3
4
0.05mol/L尿素
0.25
1.00
0.50
0.40
0.25
每管中尿素的mol数
蒸馏水
0.75
—
0.50
0.60
0.75
PH=7Tris-盐酸缓冲液
3.00
3.00
3.00
3.00
3.00
25℃恒温水浴,预温5min
脲酶提取液
—
0.10
0.10
0.10
0.10
煮沸的脲酶
0.10
—
—
—
—
25℃恒温水浴,准确作用10min
10%ZnSO4
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
0.5mol/LNaOH
0.20
0.20
0.20
0.20
0.20
充分混匀,过滤
另取5支试管,与上述离心管对应编号,如下操作
上清液
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
蒸馏水
4.00
4.00
4.00
4.00
4.00
10%酒石酸钾钠
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
钠氏试剂
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
混合均匀,以对照管调零,在480nm处,读取各管的A480nm值
A480nm值
以酶促反应初速度的倒数为纵坐标(以1/A480nm代替),以保温混合液中脲酶提取液浓度,以mol数计的倒数为横坐标,按双倒数作图法,求得Km值
1/A480nm
1/[S]
Km
参考数值Km
*[S]=每管中尿素的mol数/4.1mL×10-3(4.1mL为酶促反应总体积)
说明:
(1)米氏方程系线性方程。
酶促反应初速度v与光吸收值A成正比,所以用1/A代表1/v作图求Km值,方法简便,且结果不受影响。
(2)本实验为酶的定量实验,因此,酶促反应所要求的底物及酶的浓度、酶作用的条件及时间要求严格掌握,所加试剂量必须准确。
(3)试管应洁净干燥,否则不仅会影响酶促反应,而且会使钠氏试剂呈色混浊。
(4)加钠氏试剂时应迅速准确,立即摇匀,马上比色,否则容易混浊。
实验中加入酒石酸钾钠,目的在于防止钠氏试剂混浊。
(5)加入ZnSO4可以吸附酶蛋白,起助滤作用。
另外,ZnSO4起终止反应的作用。
四.脲酶的活力测定
[一]整理标准曲线
加入试剂量的单位为mL
试管编号
0
1
2
3
4
5
0.01mol/L(NH4)2SO4
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
每管(NH4)2SO4的mol数
蒸馏水
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
—
PH=7Tris-HCl缓冲液
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
0.5mol/LNaOH
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
蒸馏水
7.0
7.0
7.0
7.0
7.0
7.0
10%酒石酸钾钠
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
钠氏试剂
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
混合均匀,以对照管调零,在480nm处,读取各管的A480nm值
A480nm值
以光吸收值A480nm为纵坐标,保温液中(NH4)2SO4含量(μmol数)为横坐标,绘制标准曲线
[二]脲酶活力测定
(一)测定方法
脲酶活力测定方法
0.05mol/L尿素0.4mL(底物过量),水0.1mL,pH=7Tris-盐酸缓冲液3.0mL,充分混合
25℃水浴5min预温
加入稀释3倍的脲酶提取液0.1mL
充分混匀,25℃水浴,准确反应10min
其余步骤与上表相同
(二)结果计算
实验结果A480nm,对照标准曲线,可以得到单位时间内碳酸铵的生成量。
我们规定,脲酶的一个活力单位(U)为:
在25℃,pH=7的条件下,每min释放1μmol碳酸铵。
1个Sumner单位:
20℃,5min内能产生1mg氨基氮所需的酶量。
1Sumner单位=14.3国际单位(U)
请将实验结果填入下表:
A480nm值
单位时间内碳酸铵的生成量
酶活力(U)
参考数值(U)
五.脲酶提取液蛋白含量的测定及脲酶比活力的计算
[一]实验原理
用于蛋白质测定的Folin-酚试剂法(Lowry法)是双缩脲方法的发展,第一步涉及到在碱性溶液中铜-蛋白质复合物的形成,然后这个复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin试剂),产生深蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)。
此测定法比双缩脲法要灵敏得多。
进行测定时,加Folin试剂要特别小心,因为Folin试剂仅在酸性pH条件下稳定,但上述还原反应是在pH10的情况下发生,故当Folin试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前,还原反应即能发生。
[二]实验试剂
1.标准蛋白质溶液
使用酪蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度配制成250μg/mL的溶液。
2.Folin-酚试剂的配制
Folin-酚试剂的配制
试剂甲
组成
(1)4%Na2CO3溶液
(2)0.2mol/LNaOH溶液
(3)1%CuSO4·5H2O溶液
(4)2%酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾、酒石酸钠)
说明
在使用前,将
(1)与
(2)等体积混合配成Na2CO3-NaOH溶液,将(3)和(4)等体积混合配成CuSO4-酒石酸钾钠溶液。
然后将这两种溶液按50:
1的比例混合,即为Folin-酚试剂甲。
该试剂只能用一天,过期失效。
试剂乙
制备方法
2000mL的磨口回流装置内加入100gNa2WO4·2H2O、25gNa2MoO4·2H2O、700mL蒸馏水、50mL85%磷酸、100mL浓HCl,充分混合后,以小火回流10h
加入150gLi2SO4、50mL蒸馏水、数滴液体Br
开口继续沸腾15min,以便驱除过量的Br
冷却后定容到1000mL,过滤,滤液微呈绿色,置于棕色试剂瓶中冰箱保存
说明
使用时用标准NaOH溶液滴定,以酚酞为指示剂,而后适当稀释(约1倍),使最后浓度为1mol/L酸,此为Folin-酚试剂乙应用液。
贮于冰箱中长期保存。
[三]标准曲线的绘制
加入试剂单位为mL
试管编号
0
1
2
3
4
5
6
标准酪蛋白溶液(250μg/mL)
—
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
每管中酪蛋白含量(μg)
蒸馏水(补足1.0mL)
1.0
0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
—
试剂甲
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
混匀,25℃放置10min
试剂乙(Folin试剂)
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
立即振摇均匀,在25℃保温30min00nm处比色
A500nm值
以蛋白质浓度(μg数)为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线作为定量依据
[四]脲酶提取液蛋白含量测定与比活力计算
取1mL稀释30倍的脲酶提取液溶液(约含20-250μg蛋白质),如上表操作,同时以1mL水代替样品作为样品对照。
结果查标准曲线,可得蛋白质含量。
比活力是指每单位质量样品中的酶活力,即每mg质中所含的U数或每kg质中含的kat数。
脲酶的比活力=提取液活力单位(U/mL)/提取液蛋白含量(mg/mL)
请将实验结果填入下表:
A500nm值
蛋白质含量
脲酶的比活力
参考数值:
脲酶的比活力
五.pH值、抑制剂对脲酶活力的影响
[一]微量等温蒸馏定氮法
(一)实验原理
用饱和碳酸钾(强碱)溶液将样品中的氨逐出,在恒温条件下弥散至康维(Conway)皿密闭空间中,被硼酸指示剂混合液吸收。
硼酸的酸度改变引起其中指示剂的颜色变化,以标准盐酸溶液中和所吸收的氨,使指示剂恢复至原来的颜色,由消耗盐酸之量,可以计算出样品中的含氮量。
NH4++OH-→NH3↑+H2O
NH3+H3BO3→NH4++H2BO3-
H2BO3-+H+→H3BO3
硼酸指示剂混合液变色范围是:
pH=4.26为粉红色,pH=4.90为绿色。
(二)实验试剂
1.饱和K2CO3溶液:
取112gK2CO3,加100mL水溶解
2.标准盐酸溶液0.00100mol/L,0.00200mol/L,0.00300mol/L用前标定
3.凡士林
4.硼酸指示剂混合液
称取1g硼酸用水溶解,稀释至98mL,再加入2mL混合指示剂(将33mg溴甲酚绿及66mg甲基红一起溶于乙醇),稀释至100mL。
,用稀氢氧化钠溶液调至紫红色。
(三)操作方法
康维皿是由玻璃、瓷或石蜡制成的浅皿,如右图所示,分内外两室,外室比内室高,边缘必须齐平,盖上玻璃片后与外室边缘不得有缝隙或缺刻。
在康维皿的内室加入0.1mL硼酸指示剂混合液,康维皿边缘点上一圈凡士林,外室一角加入0.5mL饱和碳酸钾溶液,另一角加入0.2mL待测液。
在未盖严玻璃片前不能使饱和碳酸钾溶液与样品混合,盖玻璃片时略压紧,必须使凡士林充满康维皿与玻璃盖间的空隙。
为了防止保温时玻璃盖滑开,可以将3-4个康维皿用绳捆成一叠,再拿到30℃恒温箱保温。
最后用微量滴定管以标准盐酸滴定,滴定时可用细玻璃棒搅拌内室溶液,指示剂由绿变成微红,而不消失,则为滴定终点。
[二]pH值对脲酶活力的影响
(一)实验试剂
1.0.1mol/L的尿素溶液
2.0.02mol/L的尿素溶液
3.0.1mol/LpH=9的Tris-HCl缓冲液
4.0.1mol/LpH=7的Tris-HCl缓冲液
5.0.1mol/LpH=5的醋酸盐缓冲液
6.0.4mol/LpH=7的Tris-Hcl缓冲液
7.0.4mol/LpH=7的磷酸盐缓冲液
8.1mol/LHCl
(二)操作方法
加入试剂量单位为mL
试管编号
1
2
3
尿素溶液(0.1mol/L)
0.5
0.5
0.5
pH=5的醋酸盐缓冲液(0.1mol/L)
1.0
—
—
pH=7的Tris-Hcl缓冲液(0.1mol/L)
—
1.0
—
pH=9的Tris-Hcl缓冲液(0.1mol/L)
—
—
1.0
25℃,保温5min
脲酶溶液
0.5
0.5
0.5
混匀,25℃,保温10min
立即加入盐酸(1mol/L)
1.0
1.0
1.0
混匀,将试管置于冰浴内,停止酶反应
从每支试管取0.2mL反应液用康维法定氮,每个样品平行作2次
实验结果
比较3只试管反应液所消耗的盐酸量,说明pH对酶活力的影响:
[三]抑制剂对脲酶活力的影响
(一)实验试剂
1.0.1mol/L的尿素溶液
2.0.02mol/L的尿素溶液
3.0.1mol/LpH=9的Tris-HCl缓冲液
4.0.1mol/LpH=7的Tris-HCl缓冲液
5.0.1mol/LpH=5的醋酸盐缓冲液
6.0.4mol/LpH=7的Tris-Hcl缓冲液
7.0.4mol/LpH=7的磷酸盐缓冲液
8.1mol/LHCl
(二)操作方法
加入试剂量的单位为mL
试管编号
1
2
3
4
5
6
7
8
尿素溶液(0.02mol/L)
0.25
—
0.25
—
0.25
—
0.25
—
尿素溶液(0.1mol/L)
—
0.25
—
0.25
—
0.25
—
0.25
pH=7磷酸盐缓冲液(0.4mol/L)
—
—
0.5
0.5
—
—
—
—
pH=7Tris-Hcl缓冲液(0.4mol/L)
0.5
0.5
—
—
—
—
—
—
pH=7磷酸盐缓冲液(0.1mol/L)
—
—
—
—
—
—
0.5
0.5
pH=7Tris-Hcl缓冲液(0.1mol/L)
—
—
—
—
0.5
0.5
—
—
25℃,保温5min
脲酶溶液
0.25
0.25
0.25
0.25
混匀,25℃,保温5min
将试管置于冰浴内,停止酶反应
立即从每支试管取0.1mL反应液,用康维法定氮,每个样品平行作2次
实验结果
根据尿素溶液的浓度及4支试管反应液所消耗的盐酸量,说明磷酸盐抑制剂对酶活力的影响,并推测磷酸盐离子对脲酶的抑制可能属于哪种类型。
六.酶的特性
[一]温度对唾液淀粉酶活性的影响
(一)实验原理
酶的催化作用受温度的影响。
在最适温度下,酶的反应速度最高。
大多数动物酶的最适温度为37-40℃,植物酶的最适温度为50-60℃。
酶对温度的稳定性与其存在形式有关。
有些酶的干燥制剂,虽加热到100℃,其活性并无明显改变,但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性。
低温能降低或抑制酶的活性,但不能使酶失活。
淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。
糊精按其分子的大小,遇点可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。
最简单的糊精遇碘不呈颜色,麦芽糖遇碘也不呈色。
在不同的温度下,淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。
(二)实验试剂
1.0.2%淀粉的0.3%NaCl溶液150mL
2.稀释200倍的唾液50mL
3.KI-I2溶液50mL
(三)操作步骤与结果讨论
加入试剂的单位为mL
试管号
1
2
3
淀粉溶液
1.5
1.5
1.5
稀释唾液
1.0
1.0
—
煮沸过的稀释唾液
—
—
1.0
操作
37℃水浴10min
冰水中10min
37℃水浴10min
—
—
37℃水浴10min
—
KI-I2溶液
实验结果
现象解释
[二]温度对唾液淀粉酶活性的影响
(一)实验原理
酶的活力受环境、pH的影响极为显著。
不同酶的最适pH值不同。
本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响,唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。
(二)实验试剂
1.0.5%淀粉的0.3%NaCl溶液250mL
2.稀释200倍的唾液100mL
3.KI-I2溶液50mL
4.0.1mol/L柠檬酸溶液400mL
5.0.0mol/L磷酸二氢钠溶液600mL
(三)操作步骤与结果讨论
取4个标有号码的50mL锥形瓶。
用吸管按下表添加0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和0.1mol/L柠檬酸溶液以制备pH5.0-8.0的4种缓冲液。
加入试剂的单位为mL
锥形瓶号码
0.2mol/L磷酸二氢钠
0.1mol/L柠檬酸
pH
1
5.15
4.85
5.0
2
6.05
3.95
5.8
3
7.72
2.28
6.8
4
9.72
0.28
8.0
之后按如下操作:
试管号
1
2
3
4
锥形瓶中的缓冲液
3
3
3
3
0.5%淀粉溶液
2
2
2
2
稀释200倍唾液
2
2
2
2
向各试管中加入稀释唾液的时间间隔为1min
将各试管中物质混匀,依次置于37℃的恒温水浴中保温
待向第4管加唾液2min后,每隔1min由第3管取出1滴混合液,置于白瓷板上,加1滴KI-I2溶液,检查淀粉的水解程度。
待混合液变为棕黄色时,向所有试管依次添加1-2滴KI-I2溶液。
添加KI-I2溶液的时间间隔,从第1管起,均为1min。
实验现象
现象解释
[三]唾液淀粉酶的活化与抑制
(一)实验原理
酶的活性受活化剂和抑制剂的影响。
氯离子为唾液淀粉酶的活化剂,铜离子为其抑制剂。
(二)实验试剂
1.0.1%淀粉溶液150mL
2.稀释200倍的唾液150mL
3.KI-I2溶液100mL
4.1%NaCl溶液50mL
5.1%CuSO4溶液50mL
6.1%Na2SO4溶液50mL
(三)操作步骤与结果讨论
加入试剂的单位为mL
试管号
1
2
3
4
0.1%淀粉溶液
1.5
1.5
1.5
1.5
稀释200倍的唾液
0.5
0.5
0.5
0.5
1%CuSO4溶液
0.5
—
—
—
1%NaCl溶液
—
0.5
—
—
1%Na2SO4溶液
—
—
0.5
—
蒸馏水
—
—
—
0.5
37℃恒温水浴,保温10min
KI-I2溶液(滴)
2-3
2-3
2-3
2-3
实验现象
现象解释
[四]唾液淀粉酶的专一性
(一)实验原理
酶具有高度的专一性。
本实验以唾液淀粉酶为例,来说明酶的专一性。
淀粉和蔗糖都没有还原性。
唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖,但不能使蔗糖水解。
本实验用Benedict试剂检查糖的还原性。
(二)实验试剂
1.2%蔗糖溶液150mL
2.1%淀粉的0.3%NaCl溶液150mL
3.稀释200倍的唾液150mL
(三)操作步骤与结果讨论
加入试剂的单位为mL
试管号
1
2
3
4
5
6
1%淀粉溶液
4
—
4
—
4
—
2%蔗糖溶液
—
4
—
4
—
4
稀释唾液
—
—
1
1
—
—
煮过的稀释唾液
—
—
—
—
1
1
蒸馏水
1
1
—
—
—
—
37℃恒温水浴,保温15min
Benedict试剂
1
1
1
1
1
1
沸水浴,2-3min
实验现象
现象解释
参考:
毕业论文(设计)工作记录及成绩评定册
题目:
学生姓名:
学号:
专业:
班级:
指导教师:
职称:
助理指导教师:
职称:
年月日
实验中心制
使用说明
一、此册中各项内容为对学生毕业论文(设计)的工作和成绩评定记录,请各环节记录人用黑色或蓝色钢笔(签字笔)认真填写(建议填写前先写出相应草稿,以避免填错),并妥善保存。
二、此册于学院组织对各专业题目审查完成后,各教研室汇编选题指南,经学生自由选题后,由实验中心组织发给学生。
三、学生如实填好本册封面上的各项内容和选题审批表的相应内容,经指导教师和学院领导小组批准后,交指导教师;指导老师填好《毕业论文(设计)任务书》的各项内容,经教研室审核后交学生签名确认其毕业论文(设计)工作任务。
四、学生在指导老师的指导下填好《毕业论文(设计)开题报告》各项内容,由指导教师和教研室审核通过后,确定其开题,并将此册交指导老师保存。
五、指导老师原则上每周至少保证一次对学生的指导,如实按时填好《毕业论文(设计)指导教师工作记录》,并请学生签字确认。
六、中期检查时,指导老师将此册交学生填写前期工作小结,指导教师对其任务完成情况进行评价,学院中期检查领导小组对师生中期工作进行核查,并对未完成者提出整改意见,后将此册交指导老师保存。
七、毕业论文(设计)定稿后,根据学院工作安排,学生把论文(打印件)交指导老师评阅。
指导老师应认真按《毕业论文(设计)指导教师成绩评审表》对学生的论文进行评审并写出评语,然后把论文和此册一同交教研室。
八、教研室将学生的论文和此册分别交两位评阅人评阅后交回教研室保存。
九、学院答辩委员会审核学生答辩资格,确定答辩学生名单,把具有答辩资格学生的论文连同此册交各答辩小组。
十、学生答辩后由答辩小组记录人填好《毕业论文(设计)答辩记录表》中各项内容,然后把学生的论文和此册一同交所在答辩小组,答辩小组对其答辩进行评审并填写评语后交教研室。
十一、学院答辩委员会进行成绩总评定,填好《毕业论文(设计)成绩评定表》中各项内容,然后把论文(印刷版和电子版(另传))和此册等资料装入专用档案袋中,教教研室后由实验中心统一保存。
1.毕业论文(
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 实验 脲酶 制备 及其 生物学 性质 研究