食品理化分析技术W37024微教材.docx
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食品理化分析技术W37024微教材
《农产品/食品理化分析技术》课程-微教材
微课编号
W3702
微课名称
维生素的测定方法
所属模块
农产品/食品中营养成分测定
子模块
维生素测定
关键词
维生素A;维生素D;维生素B1;维生素C;测定
是否通用
√通用农产品食品
是否重点建设
是√否
微课类型
讲授型
微课形式
录播教室实录式
教学设计模式
讲授法
教学目标
1.了解各类食品中维生素的特点。
2.掌握各类维生素的测定方法。
教学内容
知识点
技能点
1.维生素A的测定原理;
2.维生素D的测定原理;
3.维生素B1的测定原理;
4.维生素C的测定原理;
1.维生素A的测定技术;
2.维生素D的测定技术;
3.维生素B1的测定技术;
4.维生素C的测定技术;
三、脂溶性维生素的测定
1、VA的测定-三氯化锑比色法:
(1)原理。
在氯仿溶液中,VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物,在620nm波长处有最大吸收峰,其吸光度与VA的含量在一定的范围内成正比,故可比色测定。
(2)试剂。
①无水硫酸钠(不吸附VA);
②乙酸酐;
③无水乙醚(不含过氧化物);
④无水乙醇(不得含有醛类物质);
⑤三氯甲烷(不含分解物);
⑥20%~25%三氯化锑-三氯甲烷溶液;
⑦50%氢氧化钾溶液;
⑧VA标准溶液:
取脱醛乙醇溶解VA标品(纯度85%的视黄醇或纯度90%的视黄醇乙酸酯),使其浓度约为1mg/ml视黄醇。
临用前以紫外分光光度法标定其浓度;
⑨1%酚酞指示剂。
(3)操作方法。
①样品处理:
根据样品性质,可采用皂化法或研磨法。
a.皂化法:
适用于VA含量不高的样品,可减少脂溶性物质的干扰,皂化过程费时,易导致VA损失。
皂化:
称样0.5~5g样品于锥形瓶,加入10ml氢氧化钾及20~40ml乙醇,电热板上加热回流30min至皂化完全。
提取:
将皂化液移入分液漏斗,先用30ml水洗皂化瓶(如有渣子,用脱脂棉滤入分液漏斗),再用50ml乙醚分两次冲洗皂化瓶,洗液并入分液漏斗,振摇2min,静置分层后,水层放入第二个分液漏斗。
皂化瓶再用30ml乙醚分两次冲洗,洗液倾入第二个分液漏斗,振摇后静置分层,将水层放入第三分液漏斗,醚层并入第一分液漏斗。
如此重复操作,直至醚层不再使三氯化锑-三氯甲烷溶液呈蓝色(无VA)。
浓缩:
将醚液经过无水硫酸钠滤入锥形瓶,再用约25ml乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次,洗液并入锥形瓶内,用水浴蒸馏,回收乙醚。
待瓶中剩约5ml乙醚时取下,减压蒸干,立即加入一定量三氯甲烷(约5ml)使VA含量在适宜的浓度范围内(3~5μg/ml)。
b.研磨法:
适用于每克样品VA含量大于5~10μg样品的测定,如动物肝脏。
步骤简单、省时,结果准确。
研磨:
精确称样2~5g,放入盛有3~5倍样品质量的无水硫酸钠研钵中,研磨至样品中水分完全被吸收,并均质化。
提取:
将均质化的样品移入带盖的锥形瓶,准确加入50~100ml乙醚。
紧压盖子,用力振摇2min,静置澄清(大约需1~2h),或离心澄清(因乙醚易燃、易挥发,气温高时应在冷水浴中操作)。
浓缩:
取澄清乙醚液2~5ml放入比色管这抽气蒸干,立即加入1ml三氯甲烷溶解残渣。
②标准曲线的制备
准确取VA标液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml于6个10ml容量瓶中,用三氯甲烷配制标准系列。
再取6个比色管顺次移入标准系列各1ml,各管加入1滴乙酸酐,制成标准比色系列。
于620nm波长处,以三氯甲烷调节吸光度至零点,将标准比色管序列按顺序移入光路前,迅速加入9ml三氯化锑-三氯甲烷溶液,于6s内测定吸光度,以吸光度为纵坐标,VA含量为横坐标,绘制标准曲线。
③样品测定
取两个比色管,分别加入1ml三氯甲烷(样品空白液)和1ml样品液,各加1滴乙酸酐。
其余步骤同标准曲线的制备。
分别测定样品空白液和样品溶液的吸光度,从标准曲线中查得相应的VA含量。
(4)结果计算。
计算公式如下:
式中,X-VA含量,mg/100g;
C-由标准曲线上查得样品溶液中VA含量,μg/ml;
C0-由标准曲线上查得样品空白液中VA含量,μg/m;
W-样品质量,g;
V-样品提取后加入三氯甲烷定容的体积,ml;
100/1000-样品中VA由μg/g折算成mg/100g的折算系数①。
【知识拓展】
三氯化锑比色法的适用范围及特点:
a.本法适用于维生素A含量较高的各种样品(高于5~10μg/g),对低含量样品,因受其他脂溶性物质的干扰,不易比色测定;
b.该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差。
比色测定必须在6s内完成,否则蓝色会迅速消退,将造成极大误差。
三氯化锑比色法测定VA含量时需要说明的问题及注意事项如下:
a.维生素A见光易分解,整个实验应在暗处进行,防止阳光照射,或采用棕色玻璃避光;
b.三氯化锑腐蚀性强,不能沾在手上,三氯化锑遇水生成
白色沉淀.因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗;
c.如果样品中含有β-胡萝卜素(如奶粉、禽蛋等食品)干扰测定,可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶解,以氧化铝为吸附剂,丙酮-己烷混合液为洗脱液进行柱层析。
d.所用氯仿中不应含有水分,因三氯化锑遇水会出现沉淀,干扰比色沉淀。
故在每1ml氯仿中应加入乙酸酐1滴,以保证脱水。
2、VD的测定-三氯化锑比色法
(1)原理。
在氯仿溶液中,VD与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物,此化合物在620nm波长处有最大吸收峰,其吸光度与VD的含量在一定的范围内成正比,故可比色测定。
(2)试剂。
①25%三氯化锑-三氯甲烷溶液;
②三氯化锑-三氯甲烷-乙酰氯溶液:
在试剂①中加入为其体积3%的乙酰氯,摇匀;
③无水乙醚(不含过氧化物);
④无水乙醇(不得含有醛类物质);
⑤石油醚(沸程30~60℃):
重蒸;
⑥VD标液:
取0.25g维生素D2,用三氯甲烷定容至100ml,此液浓度为2.5mg/ml,临用时用三氯甲烷配制成0.025~2.5μg/ml的标准使用液;
⑦聚乙二醇(PEG)600;
⑧白色硅藻土:
Celite545(柱层析载体);
⑨氨水;无水硫酸钠;中性氧化铝;
⑩0.5mol/L氢氧化钾。
(3)操作方法。
操作流程如下:
(4)结果计算:
同VA的测定。
【知识拓展】
采用三氯化锑比色法测定VD的含量时,如果样品中有VA共存,样品皂化提取后可用以下方法进行分离纯化:
a.分离柱的制备:
取一支内径为2.2cm,具有活塞和砂芯板的玻璃层析柱。
第一层:
加入1~2g无水硫酸钠,铺平整;
第二层:
称取15gCelite545置于250ml碘量瓶中,加入80ml石油醚,振摇2min,再加入10ml聚乙二醇600,剧烈振摇10min,使其黏合均匀,然后倾入层析柱内;
第三层:
加5g中性氧化铝;
第四层:
加入2~4g无水硫酸钠。
轻轻地转动层析柱,使第二层的高度保持在12cm左右。
b.纯化:
先用30~50ml石油醚淋洗分离柱,然后将样品提取液倒入柱内,再用石油醚淋洗。
弃去初收集的10ml淋洗液,再用200ml容量瓶收集淋洗液至刻度。
淋洗速度保持2~
3ml/min;
将淋洗液移入500ml分液漏斗,每次加100~150ml水,洗涤3次,弃去水层(去除残留的聚乙二醇,以免与三氯化锑形成混浊物,影响比色);
将上述石油醚层通过无水硫酸钠脱水后,置于浓缩器中减压浓缩至干,或在水浴上用水泵减压抽干,立即加入5ml三氯甲烷溶解备用。
3、VE的测定-比色法
(1)原理。
维生素E能将高价铁离子还原为铁离子,低价铁离子与联氮苯发生颜色反应,可以进行比色测定。
(2)试剂。
①无水乙醚(不含过氧化物);
②无水乙醇(不得含有醛类物质);
③2%的氢氧化钾;
④2mol/L氢氧化钾甲醇溶液;
⑤0.5%α,α′-联吡啶无水乙醇溶液;
⑥0.2%三氯化铁无水乙醇溶液,临用前现配;
⑦吸附剂FloridinXS:
在50g吸附剂中加入100ml盐酸,置沸水浴上1h,放置冷却至室温,倾出酸液。
再加入100ml盐酸,搅拌均匀,30min后弃去酸液,用水洗至中性,然后用乙醇和苯相继洗涤,室温下晾干备用;
⑧VE标准溶液:
取VE标品(α-生育酚醋酸酯纯品),用无水乙醇溶解定容,使其浓度大约为1mg/mL,临用前以紫外
分光光度法分别标定其准确浓度后,再用无水乙醇稀释成浓度为5μg/ml的标准使用液;
⑨甲醇;
(3)操作方法。
操作流程如下:
(4)结果计算。
同VA的测定。
【知识拓展】
采用比色法测定VE的含量时,样品的皂化、纯化操作步骤具体如下:
a.皂化:
取1g脂肪提取液于脂肪瓶中,加入2ml2mol/L氢氧化钾甲醇溶液。
连接回流冷凝管,在氮气流中于72~74℃温度下皂化数分钟。
皂化液用8ml甲醇稀释,并移入分液漏斗,加10ml水。
用乙醚萃取3次,每次30~50ml。
合并乙醚液,用200ml水分3次洗涤,再用2%的氢氧化钾洗涤一次,最后用水洗至中性。
将乙醚提取液经过无水硫酸钠柱子或漏斗脱水,在CO2气流中,减压蒸发至干,再用5ml苯溶解。
b.纯化:
取处理好的吸附剂装满12×30cm的分离柱,用苯润湿。
将上述样液倾入柱中,用苯淋洗至洗出液为25ml。
若柱层上出现微蓝绿色带,系类胡萝卜素;出现暗蓝色带,系VA。
如果没有胡萝卜素存在,可直接用25ml苯溶解残渣。
四、水溶性维生素的测定
【知识拓展】
水溶性维生素B1、B2和C,广泛存在于动植物组织中,饮食来源充足。
但是由于它们本身的水溶性质,除满足人体生理、生化作用外,任何多余量都会从小便中排出。
因此,为避免耗尽,需要经常地由饮食来提供。
水溶性维生素的特点如下:
a.水溶性维生素都易溶于水,而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂;
b.在酸性介质中很稳定,既使加热也不容易被破坏;但在碱性介质中不稳定,易于分解,特别是在碱性条件下加热,大部或全部可被破坏;
c.易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响;
d.维生素B2对光,特别是紫外线敏感,易被光线破坏;
e.维生素C对氧、铜离子敏感,易被氧化。
根据水溶性维生素的性质特点,测定水溶性维生素时,一般都在酸性溶液中进行前处理。
1、VC(抗坏血酸)的测定
测定VC常用的方法有靛酚滴定法、苯肼比色法、荧光法及高效液相色谱法、极谱法等。
其中靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸。
该法简便、灵敏,但特异性较差,对深色样液滴定终点不易判断。
苯肼比色法测定的是抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。
该法操作复杂,特异性较差。
荧光法测定的是抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。
该法操作较复杂,但准确度较高,重现性好。
高效液相色谱法准确度高,重现性好,灵敏、简便、快速。
(1)2,6—二氯靛酚滴定法。
①原理:
还原型抗坏血酸可以还原染料2,6-二氯靛酚。
该染料在酸性溶液中呈粉红色(在中性或碱性溶液中呈蓝色),被还原后颜色消失。
还原型抗坏血酸还原染料后,本身被氧化成脱氢抗坏血酸。
在没有杂质干扰时,一定量的样品提取液还原标准染料液的量,与样品中抗杯血酸含量成正比。
②试剂
a.2%草酸溶液;1%草酸溶液;
b.抗坏血酸标准溶液:
准确称取20mg分析纯抗坏血酸溶
于1%草酸溶液中,移入100mL容量瓶,用1%草酸溶液稀释至刻度,摇匀,于冰箱中保存。
使用时用1%草酸溶液稀释10倍。
此标准使用液相当0.02mg/mL维生素C;
c.2,6-二氯靛酚溶液:
称取2,6-二氯靛酚50mg,溶解并稀释至250mL,此液应贮于棕色瓶中并冷藏;
d.0.1mol/L碘酸钾溶液:
精确称取干燥的碘酸钾0.3567g,用水溶解并定容于100mL容量瓶,混匀;
e.0.001mol/L碘酸钾溶液:
吸取0.1mol/L碘酸钾溶液1mL,用水稀释至100mL(此溶液相当于抗坏血酸0.088mg/mL);
f.1%淀粉溶液;
g.6%碘化钾溶液。
③操作方法。
操作流程如下:
④结果计算。
计算公式如下:
式中,X-样品中抗坏血酸含量,mg/100g;
V-滴定样液时消耗染料的体积,ml;
V0-滴定空白时消耗染料的体积,ml;
T-1ml染料溶液相当于抗坏血酸标准容易的量,mg/ml;
W-滴定时所取滤液中含有样品的质量,g。
【知识拓展】
2,6-二氯靛酚滴定法测定抗坏血酸时需要说明的问题及注意事项如下:
a.样品处理过程若打碎的浆泡沫过多,在稀释时可加辛醇数滴,使去掉泡沫;
b.滴定开始时,染料要迅速加入,直至红色不立即消失,而后逐滴加入,并不断摇动锥形瓶直至终点,整个滴定过程不宜超过2min;
c.样品中可能有其它杂质也能还原染料,但速度较抗坏血酸慢,所以滴定以30秒粉红色不退为终点;
d.若滤液颜色很深,终点不易辨别,可用白陶土脱色后再滴定,但应选择脱色力强而对抗坏血酸无损失的白陶土。
有的资料介绍用试样滤液来滴定染料溶液至红色为终点(此种方法标定染料时也应用标准抗坏血酸溶液滴定染料液);
e.分析新鲜果蔬时,用1%草酸不能使酶失去活力,不能稳定抗坏血酸,故用2%草酸。
(2)2,4—二硝基苯肼比色法。
①原理:
总抗坏血酸包括还原型、脱氢型抗坏血酸和二酮古乐糖酸,样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸,再与2,4–二硝基苯肼作用生成红色脎,其呈色强度与总抗坏血酸含量呈正比,可进行比色定量。
②试剂:
a.4.5mol/L硫酸:
量取250ml浓硫酸小心加入700ml水中,冷却后用水稀释至1000ml;
b.85%硫酸;
c.2%2,4–二硝基苯肼:
取2,4–二硝基苯肼2g于100ml
4.5mol/L硫酸中,过滤(不用时存于冰箱内,每次使用前必须过滤);
d.2%草酸溶液;
e.1%草酸溶液;
f.1%硫脲溶液:
溶解1g硫脲于100ml1%草酸溶液中;
g.2%硫脲溶液:
溶解2g硫脲于100ml1%草酸溶液中;
h.1mol/L盐酸:
取100ml盐酸,加入水中,并稀释至1200ml;
i.抗坏血酸标准溶液:
称取100mg纯抗坏血酸溶解于100ml2%草酸溶液中,此溶液每毫升相当于1mg抗坏血酸;
j.活性炭:
将100g活性炭加到750ml1mol/L盐酸中,回流1h~2h,过滤,用水洗数次,至滤液中无铁离子(Fe3+)为止,然后置于110℃烘箱中烘干。
③操作方法:
操作流程如下。
④结果计算:
计算公式如下:
式中,X-样品中总抗坏血酸含量,mg/100g;
C-由标准曲线查得“样品氧化液”中总抗坏血酸的浓度,μg/mL;
V-试样用1%草酸溶液定容的体积,ml;
F-样品氧化处理过程中的稀释倍数;
W-试样质量,g。
【知识拓展】
采用2,4—二硝基苯肼比色法测定总抗坏血酸含量时,其标准曲线绘制的具体操作步骤如下:
a.加2g活性炭于50ml标准溶液中,振动1min后过滤;
b.吸取10ml滤液放入500ml容量瓶中加5.0g硫脲,用1%草酸溶液稀释至刻度。
抗坏血酸浓度20μg/mL;
c.吸取5,10,20,25,40,50,60ml稀释液,分别放人7个100ml容量瓶中,用10%硫脲溶液稀释至刻度,使最后稀释液中抗坏血酸的深度分别为1,2,4,5,8,10,12μg/mL;
d.分别吸取4ml各不同浓度的上述抗坏血酸标准使用液于7个试管中,吸取4ml水于试剂空白管,各加入1ml2%2,4–二硝基苯肼溶液,混匀,将全部试管放入37℃±5℃恒温箱或恒温水浴中,保温3h后将8个试管取出,全部放入冰水冷却后,向每一试管中加入5ml85%硫酸,滴加时间至少需要1min,边加边摇,。
将试管自冰水取出,在室温放置30min后,以试剂空白管调零,比色测定;
e.以吸光度值为纵坐标,以抗坏血酸浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线。
【知识拓展】
2,4-二硝基苯肼比色法测定抗坏血酸时需要说明的问题及注意事项如下:
a.本法为国家标准方法,适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定;
b.活性炭对抗坏血酸的氧化作用,是基于其表面吸附的氧进行界面反应,加入量过低,氧化不充分,测定结果偏低;加入量过高,对抗坏血酸有吸附作用,使测定结果也偏低;
c.硫脲的作用在于防止抗坏血酸的继续被氧化和有助于脎的形成。
2、VB1的测定
测定VB1常用的测定方法有比色法、荧光法和高效液相色谱法。
比色法:
灵敏度低、准确度差,适用于VB1含量高的样品;
荧光法和高效液相色谱法:
灵敏度较高、准确度好,适用于微量测定,是目前测定的主要方法。
荧光法使用原理及方法如下:
①原理:
硫胺素在碱性高铁氰化钾溶液中,能被氧化成蓝色荧光化合物-硫色素。
若不存在其他荧光物质干扰,荧光强度与硫色素含量成正比,即与溶液中硫胺素含量成正比。
如样品中所含杂质较多,应经离子交换剂处理,使硫胺素与杂质分离,然后测定纯化液中硫胺素的含量。
②仪器、试剂及具体操作方法:
详见GB/T5009.84—2003。
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