1、食品理化分析技术W37024微教材农产品/食品理化分析技术课程-微教材微课编号W3702微课名称维生素的测定方法所属模块农产品/食品中营养成分测定子模块维生素测定关键词维生素A；维生素D；维生素B1；维生素C；测定是否通用通用 农产品 食品是否重点建设是 否微课类型讲授型微课形式录播教室实录式教学设计模式讲授法教学目标1了解各类食品中维生素的特点。 2掌握各类维生素的测定方法。教学内容知识点技能点1. 维生素A的测定原理；2. 维生素D的测定原理；3. 维生素B1的测定原理；4. 维生素C的测定原理；1. 维生素A的测定技术；2. 维生素D的测定技术；3. 维生素B1的测定技术；4. 维生素C
2、的测定技术；三、脂溶性维生素的测定1、VA的测定三氯化锑比色法：（1）原理。 在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物，在 620 nm 波长处有最大吸收峰，其吸光度与VA的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。（2）试剂。 无水硫酸钠（不吸附VA）； 乙酸酐； 无水乙醚（不含过氧化物）； 无水乙醇（不得含有醛类物质）； 三氯甲烷（不含分解物）； 2025三氯化锑三氯甲烷溶液； 50氢氧化钾溶液； VA标准溶液：取脱醛乙醇溶解VA标品（纯度85的视黄醇或纯度90的视黄醇乙酸酯），使其浓度约为1mg/ml视黄醇。临用前以紫外分光光度法标定其浓度； 1酚酞指示剂。（3）操作方法。 样品
3、处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。a. 皂化法：适用于VA含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，皂化过程费时，易导致VA损失。皂化：称样0.55g样品于锥形瓶，加入10ml氢氧化钾及2040ml乙醇，电热板上加热回流30min至皂化完全。提取：将皂化液移入分液漏斗，先用30ml水洗皂化瓶（如有渣子，用脱脂棉滤入分液漏斗），再用50ml乙醚分两次冲洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗，振摇2min，静置分层后，水层放入第二个分液漏斗。皂化瓶再用30ml乙醚分两次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗，振摇后静置分层，将水层放入第三分液漏斗，醚层并入第一分液漏斗。如此重复操作，直至醚层不再使三氯化锑三氯甲烷
4、溶液呈蓝色（无VA）。浓缩：将醚液经过无水硫酸钠滤入锥形瓶，再用约25ml乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入锥形瓶内，用水浴蒸馏，回收乙醚。待瓶中剩约5ml乙醚时取下，减压蒸干，立即加入一定量三氯甲烷（约5ml）使VA含量在适宜的浓度范围内（35g/ml）。b. 研磨法：适用于每克样品VA含量大于510g样品的测定，如动物肝脏。步骤简单、省时，结果准确。研磨：精确称样25g，放入盛有35倍样品质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。提取：将均质化的样品移入带盖的锥形瓶，准确加入50100ml乙醚。紧压盖子，用力振摇2min，静置澄清（大约需12h），或离心澄清（因乙醚
5、易燃、易挥发，气温高时应在冷水浴中操作）。浓缩：取澄清乙醚液25ml放入比色管这抽气蒸干，立即加入1ml三氯甲烷溶解残渣。 标准曲线的制备准确取VA标液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml于6个10ml容量瓶中，用三氯甲烷配制标准系列。再取6个比色管顺次移入标准系列各1ml，各管加入1滴乙酸酐，制成标准比色系列。于620nm波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将标准比色管序列按顺序移入光路前，迅速加入9ml三氯化锑三氯甲烷溶液，于6s内测定吸光度，以吸光度为纵坐标，VA含量为横坐标，绘制标准曲线。 样品测定取两个比色管，分别加入1ml三氯甲烷（样品空白液）和1ml样品液，各加1滴乙酸
6、酐。其余步骤同标准曲线的制备。分别测定样品空白液和样品溶液的吸光度，从标准曲线中查得相应的VA含量。（4）结果计算。计算公式如下： 式中，XVA含量，mg/100g；C由标准曲线上查得样品溶液中VA含量，g/ml；C0由标准曲线上查得样品空白液中VA含量，g/m； W样品质量，g； V样品提取后加入三氯甲烷定容的体积，ml； 100/1000样品中VA由g/g折算成mg/100g的折算系数。【知识拓展】三氯化锑比色法的适用范围及特点：a. 本法适用于维生素含量较高的各种样品(高于 510g/g )，对低含量样品，因受其他脂溶性物质的干扰，不易比色测定；b. 该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳
7、定性差。比色测定必须在6s内完成，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。三氯化锑比色法测定VA含量时需要说明的问题及注意事项如下：a. 维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃避光；b. 三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗；c. 如果样品中含有胡萝卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干扰测定，可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮己烷混合液为洗脱液进行柱层析。d. 所用氯仿中不应含有水分，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色沉淀。故在每1ml氯仿中应加入乙酸酐1滴，以保证脱水。2、VD的测定三氯化锑比色
8、法（1）原理。 在氯仿溶液中，VD与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，此化合物在 620 nm 波长处有最大吸收峰，其吸光度与VD的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。（2）试剂。 25三氯化锑三氯甲烷溶液； 三氯化锑三氯甲烷乙酰氯溶液：在试剂中加入为其体积3的乙酰氯，摇匀； 无水乙醚（不含过氧化物）； 无水乙醇（不得含有醛类物质）； 石油醚（沸程3060）：重蒸； VD标液：取0.25g 维生素D2，用三氯甲烷定容至100ml，此液浓度为2.5mg/ml，临用时用三氯甲烷配制成0.0252.5g/ml的标准使用液； 聚乙二醇（PEG）600； 白色硅藻土：Celite 545（柱层析载体
9、）； 氨水；无水硫酸钠；中性氧化铝； 0.5mol/L氢氧化钾。（3）操作方法。操作流程如下：（4）结果计算：同VA的测定。【知识拓展】采用三氯化锑比色法测定VD的含量时，如果样品中有VA共存，样品皂化提取后可用以下方法进行分离纯化： a. 分离柱的制备：取一支内径为2.2 cm，具有活塞和砂芯板的玻璃层析柱。 第一层：加入12g无水硫酸钠，铺平整；第二层：称取15g Celite 545置于250ml碘量瓶中，加入80ml石油醚，振摇2min，再加入10ml聚乙二醇600，剧烈振摇10min，使其黏合均匀，然后倾入层析柱内；第三层：加5g中性氧化铝；第四层：加入24g无水硫酸钠。 轻轻地转动
10、层析柱，使第二层的高度保持在12cm左右。b. 纯化：先用3050ml石油醚淋洗分离柱，然后将样品提取液倒入柱内，再用石油醚淋洗。弃去初收集的10ml淋洗液，再用200ml容量瓶收集淋洗液至刻度。淋洗速度保持23ml/min； 将淋洗液移入500ml分液漏斗，每次加100150ml水，洗涤3次，弃去水层（去除残留的聚乙二醇，以免与三氯化锑形成混浊物，影响比色）；将上述石油醚层通过无水硫酸钠脱水后，置于浓缩器中减压浓缩至干，或在水浴上用水泵减压抽干，立即加入5ml三氯甲烷溶解备用。3、VE的测定比色法 （1）原理。维生素E能将高价铁离子还原为铁离子，低价铁离子与联氮苯发生颜色反应，可以进行比色测
11、定。 （2）试剂。 无水乙醚（不含过氧化物）； 无水乙醇（不得含有醛类物质）； 2的氢氧化钾； 2mol/L氢氧化钾甲醇溶液； 0.5 ，联吡啶无水乙醇溶液； 0.2三氯化铁无水乙醇溶液，临用前现配； 吸附剂FloridinXS：在50g吸附剂中加入100ml盐酸，置沸水浴上1h，放置冷却至室温，倾出酸液。再加入100ml盐酸，搅拌均匀，30min后弃去酸液，用水洗至中性，然后用乙醇和苯相继洗涤，室温下晾干备用； VE标准溶液：取VE标品（生育酚醋酸酯纯品），用无水乙醇溶解定容，使其浓度大约为1mg/mL，临用前以紫外分光光度法分别标定其准确浓度后，再用无水乙醇稀释成浓度为5g/ml的标准使用
12、液； 甲醇；（3）操作方法。操作流程如下：（4）结果计算。同VA的测定。【知识拓展】采用比色法测定VE的含量时，样品的皂化、纯化操作步骤具体如下： a. 皂化：取1g脂肪提取液于脂肪瓶中，加入2ml 2mol/L氢氧化钾甲醇溶液。连接回流冷凝管，在氮气流中于7274温度下皂化数分钟。皂化液用8ml甲醇稀释，并移入分液漏斗，加10ml水。用乙醚萃取3次，每次3050ml。合并乙醚液，用200ml水分3次洗涤，再用2的氢氧化钾洗涤一次，最后用水洗至中性。将乙醚提取液经过无水硫酸钠柱子或漏斗脱水，在CO2气流中，减压蒸发至干，再用5ml苯溶解。 b. 纯化：取处理好的吸附剂装满1230cm的分离柱，
13、用苯润湿。将上述样液倾入柱中，用苯淋洗至洗出液为25ml。若柱层上出现微蓝绿色带，系类胡萝卜素；出现暗蓝色带，系VA。如果没有胡萝卜素存在，可直接用25ml苯溶解残渣。四、水溶性维生素的测定【知识拓展】水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都会从小便中排出。因此，为避免耗尽，需要经常地由饮食来提供。水溶性维生素的特点如下：a. 水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂；b. 在酸性介质中很稳定，既使加热也不容易被破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别是在碱性条件下加热，大部或
14、全部可被破坏； c. 易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响； d. 维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏； e. 维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。根据水溶性维生素的性质特点，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。1、VC（抗坏血酸）的测定测定VC常用的方法有靛酚滴定法、苯肼比色法、荧光法及高效液相色谱法、极谱法等。其中靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸。该法简便、灵敏，但特异性较差，对深色样液滴定终点不易判断。苯肼比色法测定的是抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。该法操作复杂，特异性较差。荧光法测定的是抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。该法操作较复杂，但准确度较高，重现性好。高
15、效液相色谱法准确度高，重现性好，灵敏、简便、快速。（1）2,6二氯靛酚滴定法。 原理： 还原型抗坏血酸可以还原染料2,6二氯靛酚。该染料在酸性溶液中呈粉红色(在中性或碱性溶液中呈蓝色)，被还原后颜色消失。 还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗杯血酸含量成正比。 试剂a. 2%草酸溶液；1%草酸溶液；b. 抗坏血酸标准溶液：准确称取20mg 分析纯抗坏血酸溶于1%草酸溶液中，移入100mL 容量瓶，用1%草酸溶液稀释至刻度，摇匀，于冰箱中保存。使用时用1%草酸溶液稀释10倍。此标准使用液相当0.02mg/mL 维生
16、素C；c. 2,6二氯靛酚溶液：称取2,6二氯靛酚50mg，溶解并稀释至250mL，此液应贮于棕色瓶中并冷藏；d. 0.1mol/L 碘酸钾溶液：精确称取干燥的碘酸钾0.3567g，用水溶解并定容于100mL 容量瓶，混匀；e. 0.001mol/L 碘酸钾溶液：吸取0.1mol/L 碘酸钾溶液1mL，用水稀释至100mL（此溶液相当于抗坏血酸0.088mg/mL）；f. 1%淀粉溶液；g. 6%碘化钾溶液。 操作方法。操作流程如下： 结果计算。计算公式如下： 式中，X样品中抗坏血酸含量，mg/100g；V滴定样液时消耗染料的体积，ml；V0滴定空白时消耗染料的体积，ml；T1ml染料溶液相当
17、于抗坏血酸标准容易的量，mg/ml；W滴定时所取滤液中含有样品的质量，g。 【知识拓展】2,6二氯靛酚滴定法测定抗坏血酸时需要说明的问题及注意事项如下：a. 样品处理过程若打碎的浆泡沫过多，在稀释时可加辛醇数滴，使去掉泡沫；b. 滴定开始时，染料要迅速加入，直至红色不立即消失，而后逐滴加入，并不断摇动锥形瓶直至终点，整个滴定过程不宜超过2min；c. 样品中可能有其它杂质也能还原染料，但速度较抗坏血酸慢，所以滴定以30 秒粉红色不退为终点；d. 若滤液颜色很深，终点不易辨别，可用白陶土脱色后再滴定，但应选择脱色力强而对抗坏血酸无损失的白陶土。有的资料介绍用试样滤液来滴定染料溶液至红色为终点（此
18、种方法标定染料时也应用标准抗坏血酸溶液滴定染料液）；e. 分析新鲜果蔬时，用1%草酸不能使酶失去活力，不能稳定抗坏血酸，故用2%草酸。（2）2,4二硝基苯肼比色法。 原理：总抗坏血酸包括还原型、脱氢型抗坏血酸和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2,4二硝基苯肼作用生成红色脎，其呈色强度与总抗坏血酸含量呈正比，可进行比色定量。 试剂：a. 4.5mol/L硫酸：量取250ml浓硫酸小心加入700ml水中，冷却后用水稀释至1000ml；b. 85%硫酸；c. 2% 2，4二硝基苯肼：取2,4二硝基苯肼2g于100ml4.5mol/L硫酸中，过滤（不用时存于冰箱内，每
19、次使用前必须过滤）；d. 2%草酸溶液；e. 1%草酸溶液；f. 1%硫脲溶液：溶解1g硫脲于100ml1%草酸溶液中；g. 2%硫脲溶液：溶解2g 硫脲于100ml1%草酸溶液中；h. 1mol/L盐酸：取100ml盐酸，加入水中，并稀释至1200ml；i. 抗坏血酸标准溶液：称取100mg纯抗坏血酸溶解于100ml 2%草酸溶液中，此溶液每毫升相当于1mg抗坏血酸；j. 活性炭：将100g活性炭加到750ml 1mol/L 盐酸中，回流1h2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子（Fe3+）为止，然后置于110烘箱中烘干。 操作方法：操作流程如下。 结果计算：计算公式如下： 式中， X样品
20、中总抗坏血酸含量，mg/100g；C由标准曲线查得“样品氧化液”中总抗坏血酸的浓度，g/mL；V试样用1草酸溶液定容的体积，ml；F样品氧化处理过程中的稀释倍数；W试样质量，g。【知识拓展】采用2,4二硝基苯肼比色法测定总抗坏血酸含量时，其标准曲线绘制的具体操作步骤如下：a. 加2g 活性炭于50ml标准溶液中，振动1min 后过滤；b. 吸取10ml滤液放入500ml容量瓶中加5.0g 硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓度20g/mL；c. 吸取5，10，20，25，40，50，60ml稀释液，分别放人7个100ml容量瓶中，用10%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的深度分
21、别为1，2，4，5，8，10，12g/mL； d. 分别吸取4ml各不同浓度的上述抗坏血酸标准使用液于7 个试管中，吸取4ml水于试剂空白管，各加入1ml 2%2,4二硝基苯肼溶液，混匀，将全部试管放入375恒温箱或恒温水浴中，保温3h后将8个试管取出，全部放入冰水冷却后，向每一试管中加入5ml 85%硫酸，滴加时间至少需要1min，边加边摇，。将试管自冰水取出，在室温放置30min 后，以试剂空白管调零，比色测定；e. 以吸光度值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（g/mL）为横坐标绘制标准曲线。【知识拓展】2,4二硝基苯肼比色法测定抗坏血酸时需要说明的问题及注意事项如下：a. 本法为国家标准方法，适
22、用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定；b. 活性炭对抗坏血酸的氧化作用，是基于其表面吸附的氧进行界面反应，加入量过低，氧化不充分，测定结果偏低；加入量过高，对抗坏血酸有吸附作用，使测定结果也偏低；c. 硫脲的作用在于防止抗坏血酸的继续被氧化和有助于脎的形成。2、VB1的测定测定VB1常用的测定方法有比色法、荧光法和高效液相色谱法。比色法：灵敏度低、准确度差，适用于VB1含量高的样品；荧光法和高效液相色谱法：灵敏度较高、准确度好，适用于微量测定，是目前测定的主要方法。荧光法使用原理及方法如下： 原理：硫胺素在碱性高铁氰化钾溶液中，能被氧化成蓝色荧光化合物硫色素。若不存在其他荧光物质干扰，荧光强度与硫色素含量成正比，即与溶液中硫胺素含量成正比。如样品中所含杂质较多，应经离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后测定纯化液中硫胺素的含量。 仪器、试剂及具体操作方法：详见GB/T 5009.842003。
