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培养条件对WortmannilactonF及其类似物产量及种类的影响
董悦生1尹哲媛2初晓岚1路新华3张华3修志龙1阎浩林2
(1大连理工大学生命科学与技术学院大连116024;2沈阳药科大学生命科学与生物制药学院沈阳110016;3华北制药集团华北制药集团新药研究开发有限责任公司石家庄050015)
[摘要]目的基于OSMAC理念,研究培养条件对邬氏黄丝曲霉代谢产物WortmannilactonF产量及其类似物种类的影响。
方法:
考察培养基种类、pH、含水量和DMSO加入量对WortmannilactonF产量的影响,采用响应面优化法确定最佳培养条件;考察Wortmannilactons类似物在麸皮和大米培养基中种类的变化。
结果在pH7.46,DMSO2.23%,缓冲液加入量18.3ml的条件下,wortmannilactoneF为3.90mg/g,与初始大米-微量盐培养基相比提高了341倍;麸皮-水培养基中四烯类化合物数量为10个,是大米-微量盐培养基的2.5倍。
结论:
改变培养条件不仅能够增加目标化合物的产量,还能够充分发掘微生物的潜力,发现更多的新代谢产物,是一种快速发现微生物新代谢产物的方法。
关键词:
邬氏黄丝曲霉Wortmannilactons培养条件OSMAC优化
微生物药物是20世纪人类最伟大和最有意义的发明之一,为人类健康事业和制药产业的发展作出了伟大的贡献。
但是随着研究的不断深入,对于微生物来源创新药物的研究存在许多困难,首先微生物的次级代谢产物表达量少,产物富集困难;其次微生物中存在沉默基因,其在自然条件下表达水平极低或不表达,为研究微生物新代谢产物又增加了难度。
因此如何增加微生物次生代谢产物的种类并提高其产量就成为迫在眉睫解决的问题1,2。
德国Gottingen大学的Zeeck小组,提出了OSMAC(OneStrainManyCompounds)的研究方法,即用一系列简单可行的方法对微生物培养过程中可能涉及到的影响因素加以改变,以增加其次级代谢产物的数量和含量。
应用OSMAC方法,该小组从6种真菌和放线菌中,发现了25类,共100多种结构不同的微生物次生代谢产物1。
Paranagama等,通过将培养基中的自来水变成去离子水后发现了6个新的次级代谢产物,同时在培养集中加入重金属离子后发现monocillinI的产量明显提高3。
Russell等在枝孢芽枝菌(Cladosporiumcladosporioides)培养基中加入微生物表观遗传调控剂DNA甲基化酶抑制剂-5-azacytidine和组蛋白去乙酰化酶抑制剂-suberoylanilidehydroxamicacid(SAHA),并分析和分离了发酵液的次级代谢产物,结果显示两种表观遗传调控剂可以产生不同的次级代谢产物,加入5-azacytidine能够产生羟脂类化合物,而加入SAHA后能够产生7个二萘嵌苯醌类化合物,其中2个是新化合物4。
这些研究均表明OSMAC方法能够重复发掘微生物产生新次级代谢
产物的能力,提高新型微生物代谢产物的发现效率。
图1WortmannilactonsE-H(1-4)的化学结构
Fig1.ChemicalstructureofwortmannilactonsE-H(1-4)
在前期的研究中,从邬氏黄丝曲霉发现一组新次级代谢产物WortmannilactonE-H5,该类为一类含有四烯、氧杂二环-[2.2.1]-庚烷和二氢吡喃环子结构的新母核化合物,小鼠的体内急性毒性实验显示该化合物LD50大于500mg/kg,安全性较好。
最近Omura等的研究表明,WortmannilactonE-H的结构类似物UkulactoneA对肠虫呼吸链传递的关键酶NADH-延胡索酸还原酶具有极强的抑制活性,IC50为2.4nM,而对牛心NADH-泛醌还原酶的抑制活性要弱500倍,提示该化合物对肠虫呼吸链传递的关键酶具有极高的选择性,有望开发为新型的抗寄生虫药物。
研究还表明化合物的C-2构型对活性影响很大,C-2异构的UkulactoneB活性比UkulactoneA的1/2006。
研究WortmannilactonE-H类化合物对NADH-延胡索酸还原酶的抑制活性、发现该类化合物构效关系以及积累样品进行体内抗虫活性研究具有重要意义,而目前该类化合物发现的数目还很少且含量低,阻碍了该类化合物抗虫活性的进一步研究,本研究采用OSMAC的方法,通过培养条件的改变增加WortmannilactonE-H的代谢产物产量和种类,为发现活性更好含有四烯、氧杂二环-[2.2.1]-庚烷和二氢吡喃环子结构的化合物和活性评价样品积累奠定基础。
材料和仪器
邬氏黄丝曲霉(Talaromyceswortmannii)F01Z0195分离自我国云南省土壤样品。
WortmannilatonesE-H为本实验室制备,经NMR确认,纯度均大于93%。
乙腈为TEDIA公司色谱纯试剂、其余试剂均为国产分析纯试剂。
Waters色谱系统(美国Waters公司,泵:
600E,检测器:
2996二极管阵列(PDA)检测器),色谱柱(Kromasil公司,ODS反相柱:
4.6250mm,5m),LC-MS系统(HP1100LC/MSD,美国Agilent公司),ZHWY-2102C立式双层恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司),霉菌培养箱MJ-160B5-Ⅲ(上海新苗医疗器械制造有限公司)。
方法
1.邬氏黄丝曲霉培养方法
将在PDA斜面培养的邬氏黄丝曲霉F01Z0195接种于种子培养基(淀粉2.0%,葡萄糖1.0%,黄豆饼粉0.2%,麦芽粉0.6%,酵母粉0.5%,CaCO30.2%,MgSO47H2O0.2%,NaCl0.2%,pH值为7.0),27℃、220rpm培养3d后转接于发酵培养基中,接种量为7%。
2.发酵培养,
发酵培养采用固体培养方式,以各培养基组分搅拌均匀后体积为100.0ml为标准,分别向250ml三角瓶中加入大米50.0g、玉米渣40.0g、小米42.0g、燕麦45.0g和糙米47.0g,同时每种培养基中另加入20.0ml微量盐,其微量盐组成为KH2PO45.0g、MgSO47H2O1.0g、CaCl21.0g、加入或未加入微量盐溶液2.0ml(FeSO40.1%、MnCl20.1%、ZnSO40.1%),补充适量水份,发酵培养14d。
3.分析方法
发酵培养物用乙酸乙酯浸泡提取,超声30min后静置12h。
12000rpm离心后取上清液进行HPLC分析。
分析条件:
乙腈和水梯度洗脱(0~20min70%-100%乙腈,20~30min100%乙腈),流速1.0ml/min,全波长检测。
LC-MS委托大连理工大学精细化工国家重点实验室测定。
结果
1.培养条件对wortmannilactoneF产量的影响
1.1培养体系的筛选:
培养条件对微生物代谢产物产量具有显著影响,首先考察了大米(DM)、玉米渣(YM)、小米(XM)、燕麦(ym)、糙米(CM)和麸皮(FP)等6种培养基对wortmannilactones生成量和种类的影响。
以wortmannilactons中含量最高F组分为检测指标,如图2所示,不同培养基对wortmannilactoneF的生成量影响较大,ym、CM培养基均不产WortamannilactoneF,DM培养基只能产微量的WortamannilactoneF,而XM、FP和YM培养基中WortamannilactoneF生成量均有所提高,其中XM培养基比初始培养基(DM)提高2.7倍,FP培养基提高87倍,而YM培养基提高279倍。
图2培养基种类对wortmannilactoneF产量的影响
Fig.2EffectsofmediatypesonproductionofwortmannilactoneF
1.2含水量对wortmannilactoneF生成量的影响
由于固态发酵最大的特点是无游离水存在,因而基质含水量的变化,必然会对微生物的生长与代谢能力产生重要的影响。
因此我们向玉米渣培养基中加入不同体积的自来水来探讨其对wortmannilactoneF生成量的影响,结果如图3所示随着自来水体积的逐渐增加,产物生成量呈现一个先上升后下降的趋势,其中加入自来水体积为15ml(即含水量为26%)时出现最大值,故确定26%为最佳含水量。
图3含水量对wortmannilactoneF生成的影响
Fig3.EffectsofmoistureonproductionofwortmannilactoneF
1.3pH值对wortmannilactoneF生成量的影响
接着考察了不同pH的0.1mol/LNa2HPO4-KH2PO4缓冲盐体系对产物生成量的影响。
结果如图4所示,在发酵过程中pH值保持为7时,wortmannilactoneF生成量最高,而发酵初始pH值(Z)也为7。
可见在发酵过程中维持恒定pH值更有利于产物积累。
图4pH值对wortmannilactoneF生成的影响
Fig4.EffectsofpHonproductionofwortmannilactoneF
1.4DMSO浓度对wortmannilactoneF生成量的影响
DMSO是一种生长刺激剂,对微生物具有促生和抗辐射作用;同时还是一种细胞膜通透剂,具有促进次级代谢产物释放的作用7。
因此我们考察了不同浓度的DMSO对wortmannilactoneF生成的影响,结果发现随着DMSO浓度的不断增加,产物生成量呈现一个先上升后下降的趋势,其中DMSO浓度为2%时,产物生成量出现最大值,与对照(不加DMSO)相比增加7%。
图4DMSO浓度对wortmannilactoneF生成的影响
Fig4.EffectsofDMSOconcentrationonproductionofwortmannilactoneF
1.5响应面优化
初步确立邬氏黄丝曲霉的培养方式为玉米培养基的固态发酵培养,接种量为7%,培养周期为14天,以wortmannilactoneF为考察对象,玉米渣培养基的生成量是大米培养基的280倍。
为进一步提高单位生成量,进一步考察pH值,DMSO加入量和含水量对产物生成的促进作用,采用响应面分析法对其进行了进一步优化。
经DesignExpert软件对缓冲液加入量(含水量),pH值,DMSO浓度设计后得到17组实验,响应值为三个平行样的均值,结果如表2所示。
表2实验设计与结果
Tab.2DesignandResultsofexperiment
实验
A:
pH值
B:
DMSO浓度
(%)
C:
缓冲液加入量
(含水量)
(ml)
生成量
(mg/g)
1
8
4
15
3.79
2
7
2
15
3.86
3
7
4
20
3.18
4
7
4
10
3.61
5
8
2
10
3.65
6
7
2
15
3.86
7
8
2
20
3.41
8
7
1.5
20
3.39
9
7
2
15
3.86
10
7
2
15
3.86
11
6
4
15
3.07
12
8
1.5
15
3.45
13
7
2
15
3.86
14
6
1.5
15
3.09
15
6
2
10
3.06
16
6
2
20
3.35
17
7
1.5
10
3.75
对实验结果进行方差分析及回归分析,拟合得到回归方程为:
Y=3.86+0.22A-0.00375B-0.092C+0.09AB-0.13AC-0.017AC-0.31A2-0.2B2-0.18C2
利用ANOVA方差分析对实验结果进行了F、P-value检验,F=6.2、p-value=0.0126且测定的复相关系数平方R2=0.8885,表明该模型具有显著性,能够很好地描述实验结果。
估计系数及标准误差分析显示,A、A2、B2和C2的p-value都小于0.05,证明pH值(A)对wortmannilactoneF生成量影响较大。
根据模型预测出三因素最优条件为:
pH值为7.46,DMSO浓度为2.23%,缓冲液加入量为18.3ml,此时wortmannilactoneF最优生成量为3.93mg/g。
按最优条件对邬氏黄丝曲霉进行发酵培养,对代谢产物进行检测得到wortmannilactoneF实际生成量为3.90mg/g,与预测值相基本一致,实验结果与建立的模型拟合良好,与优化前相比wortmannilactoneF生成量提高22%,且与对照大米培养基相比提高了341倍。
2.培养条件对邬氏黄丝曲霉代谢产物种类的影响
2.1培养基中邬氏黄丝曲霉的代谢产物的指认。
在培养基对邬氏黄丝曲霉代谢产物种类的影响实验中发现,麸皮培养基可以显著提高邬氏黄丝曲霉代谢产物的种类,为了进一步研究其代谢产物种类的变化规律,进一步增加了培养基的种类,比较了使用麸皮-水,麸皮-微量盐、大米-水和大米微量盐培养基对邬氏黄丝曲霉代谢产物的影响,按照HPLC出峰时间命名为P1~P18,邬氏黄丝曲霉的四个新代谢产物WortmannilactonesE-H因为具有四烯结构,在UV下均显示为312nm为最强吸收的三叉峰,并且在已报道的该微生物代谢产物均不具有此项特征,检测到该紫外吸收特征的化合物应为WortmannilactonesE-H的类似物,故我们将具备该UV特征的化合物为研究重点。
图4邬氏黄丝曲霉在大米-微量盐(A)和麸皮-水(B)培养基中代谢产物的HPLC分析
Fig4.HPLCanalysisofmetabolitesofTalaromyceswortmanniiinrice-traceelementsandwheatbran-watermedia
图5.WortmannilactonesE-H的UV吸收图谱
Fig.5UltravioletabsorptionspectrumofWortmannilactonesE-H
根据UV特征吸收、LC-MS分析以及和与标准品对照可以确定P2-7以及P9-12具有四烯结构,其中P2、P3、P5和P12分别为已分离并鉴定的化合物wortmannilactoneE、F、G、H,P1、P7、P13和P15分别为已知物Skyrin、Rugulosin、EmecorrugatinB和EmecorrugatinA。
而P4、P6、P8、P9、P10、P11、P14、P16、P17和P18等10种化合物均为首次从邬氏黄丝曲霉中发现的代谢产物,其中P4、P6、P8、P9、P10和P11等6种化合物,同时还具有四烯类化合物的UV特征,为wortmannilactoneE-H的新结构类似物,其结构尚需对培养物进行分离纯化、测定MS、NMR后确定。
2.2不同培养基中邬氏黄丝曲霉代谢产物的种类和产量分析
邬氏黄丝曲霉在4种培养基的代谢产物的种类和含量如表3所示。
表3不同培养基中次级代谢产物的种类及产量
Tab.3Kindsandyieldcomparisonofmetabolitesindifferentmedia
Rt
(min)
UV
max
大米水
AU105/g
大米营
AU105/g
麸皮水
AU105/g
麸皮营
AU105/g
P1
5.46
249
-----
0.14
1.43
1.85
P2*
6.17
312
0.50
0.38
1.13
5.59
P3*
7.69
312
2.39
1.49
8.37
12.40
P4*
8.02
312
-----
-----
0.74
-----
P5*
8.89
312
0.24
0.17
4.90
2.15
P6*
9.32
312
-----
-----
2.39
4.44
P7*
9.68
312
-----
-----
2.18
-----
P8
10.02
223
-----
-----
1.93
3.47
P9*
10.64
312
-----
-----
4.48
5.58
P10*
12.27
312
-----
-----
1.71
1.30
P11*
12.67
312
-----
-----
8.15
1.90
P12*
15.58
312
0.12
0.08
2.66
-----
P13
16.44
303
7.33
5.27
68.83
15.95
P14
16.95
290
-----
0.86
-----
3.26
P15
17.36
303
0.77
0.76
57.41
13.64
P16
17.98
290
0.14
1.92
3.48
7.27
P17
18.57
290
0.34
2.72
6.06
10.30
P18
19.40
290
-----
4.75
5.11
17.98
*:
具有四烯类UV特征的化合物
麸皮-水、麸皮-微量盐、大米-微量盐和大米-水培养基中代谢产物分别为17、15、10和8种,其四烯类代谢产物数量分别为10、9、4和3种。
结果表明麸皮培养基可以明显提高代谢产物的种类和产量,其中麸皮-水培养基代谢产物和四烯类化合物的种类分别是大米-微量盐培养基的1.7和2.5倍,对于5种共有的邬氏黄丝曲霉代谢产物P2、P3、P5、P13和P15,麸皮-微量盐培养基中的产量分别是大米-微量盐培养基中的产量的2.0、4.6、28.3、12.5和74.2倍。
讨论
使用培养条件优化的方法提高微生物药物的产量已经得到了广泛的应用,但基于OSMAC理念,通过培养条件的改变,发现新的微生物代谢产物的研究尚未深入开展,该方法不受微生物遗传背景限制,且分离得到的新代谢产物多为结构类似物,通过系列化合物的活性比对和分子模拟,可以为发现该类化合物活性基团以及确定结构改造的目标提供有价值的信息。
该方法不仅可以进一步发掘微生物产生新代谢产物的潜力,大大提高微生物新代谢产物发现速度,而且操作简单可行,成本低、应用范围广、是一种快速发现微生物新代谢产物的有效方法。
对麸皮-水培养基中新代谢产物进行分离纯化、结构解析和活性评价,有望发现活性更好、毒副性更低的抗寄生虫药物。
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