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五种菊花近缘植物组织培养研究
五种菊花近缘植物组织培养研究
摘要:
以紫花野菊变种、纪伊潮菊、龙脑菊、那贺川野菊和矶菊5个菊花近缘种属植物无菌苗为试材,进行了茎段离体快繁体系和离体叶片不定芽再生体系研究。
结果表明:
最佳茎段增殖培养基分别为:
紫花野菊变种,MS+1.0mg·L-1
6BA+(0.05~0.10)mg·L-1IBA;纪伊潮菊,MS+2.0mg·L-1KT+0.1mg·L-1NAA;龙脑菊,MS+0.5mg
·L-1KT+0.1mg·L-1NAA;那贺川野菊,MS+1.0mg·L-1KT+0.1mg·L-1NAA;矶菊,MS+2.0mg·L-1
6BA+0.1mg·L-1NAA。
紫花野菊变种、纪伊潮菊、龙脑菊、那贺川野菊试管苗适宜生根培养基是1/2MS;矶菊试
管苗适宜生根培养基为1/2MS+0.2mg·L-1NAA。
5个材料试管苗离体叶片愈伤组织诱导率均较高,但不定芽的诱导
率则因基因型而异,仅那贺川野菊和矶菊能诱导出不定芽。
那贺川野菊在MS+0.5mg·L-1KT+0.1mg·L-1NAA
培养基上不定芽的再生率和增殖系数均最高,分别为75.0%和3.4;而矶菊在MS+1.0mg·L-16BA+0.5mg·L-1
NAA培养基上的不定芽再生率和增殖系数最高,分别达80.0%和5.8。
关键词:
菊花近缘植物;茎段;叶片;组织培养
菊花近缘种属野生资源具有抗虫、抗病、抗逆等优良性状,对栽培菊花的品种改良、抗性育种等种质创新十分重要,同时也是进行菊属亲缘关系探讨和栽培菊花起源研究的重要材料。
但来自不同生态类型的菊花近缘野生材料在越夏或越冬时难以存活,造成种质资源严重丢失。
植物组织培养技术已广泛应用于种质资源保存和离体快繁。
自Hill(1968)利用芽尖外植体通过愈伤组织诱导成株建立菊花再生体系以来,许多学者以叶片[1-3]、茎段[4-5]、管状花[6-7]、花梗[8]等为外植体相继建立了菊花的离体再生体系,原生质体培养[8]和体细胞胚培养再生体系[8]也获得了成功,但有关菊花近缘野生物种组织培养研究鲜见报道。
本试验以引自日本的具有抗虫性、耐盐性、耐水湿等优良性状的5种野生材料紫花野菊变种(Dendranthemazawadskiivar.latilobum)、纪伊潮菊(Ajaniashiwogikuvar.kinokuniense)、龙脑菊(D.japonicum)、那贺川野菊(D.yoshinaganthum)、矶菊(A.pacificum)为试料,探讨了不同生长调节剂组合和培养基种类对试管苗增殖、离体叶片愈伤组织诱导、不定芽再生以及试管苗生根的影响,初步建立了5种供试菊花近缘野生植物的离体快繁体系和不定芽再生体系,为该类具优良抗性性状野生资源的保存和利用奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
5种供试菊花近缘野生材料(表1)均从日本收集,保存于南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”。
表1 5种菊花近缘野生材料
代号Code
中文名
染色体数目
花色
RG7
紫花野菊变种
2n=2x=18
白色~粉色
ZB1
纪伊潮菊
2n=8x=72
黄色
ZB6
龙脑菊
2n=2x=18
白色
ZB7
那贺川野菊
2n=4x=36
白色~粉色
ZB8
矶菊
2n=10x=90
黄色
1.2 5种菊花近缘野生植物离体快繁体系的建立
1.2.1 不同植物生长调节剂组合对增殖的影响
选取生长健壮的无菌苗,切割成带1个节的节段,接种到增殖培养基中诱导不定芽,共设9个处理(表2)。
每处理接种10个外植体,3次重复。
培养20d后统计增殖系数。
增殖系数=(增殖后芽总数-接种芽数)/接种芽数(注:
接种后死亡芽数不计入)。
1.2.2不同基本培养基对生根的影响
将增殖培养诱导的健壮不定芽切割成带3个叶片、长1.5~2.5cm的茎段,分别接种至MS、1/2MS培养基中进行生根诱导。
每处理6瓶,每瓶接种4个外植体。
20d后统计生根苗数及平均根数,测量根长,计算生根率。
1.2.3 不同生长素种类及浓度对生根的影响
外植体的切取方法同1.2.2,分别接种于添加0.05、
0.1、0.2mg·L-1的NAA(萘乙酸)或IBA(吲哚丁酸)的1/2MS培养基上,以不添加生长素的1/2MS培养基为对照。
每处理6瓶,每瓶接种4个外植体。
统计项目与方法同1.2.2。
1.3 5种菊花近缘野生植物叶片不定芽再生体系的建立
1.3.1 不同细胞分裂素对叶片愈伤组织诱导和不定芽分化的影响
将无菌苗叶片切成0.5cm×0.5cm左右的小块作为外植体,分别接种到添加不同种类及不同浓度细胞分裂素的MS培养基中(6BA(6苄基腺嘌呤):
0.5、1.0、2.0mg·L-1;KT(激动素):
0.5、1.0、2.0mg·L-1),再添加0.1mg·L-1NAA。
每处理6瓶,每瓶接种5个叶片外植体。
15d后统计愈伤组织诱导率,再将愈伤组织转接于相同的培养基中,30d后统计叶片再生率和增殖系数。
愈伤组织诱导率=形成愈伤组织的叶片数/接种叶片总数×100%;叶片再生率=发生分化的叶片数/接种叶片总数×100%;增殖系数=叶块发生的不定芽总数/接种叶块总数。
1.3.2不同生长素对叶片愈伤组织诱导和不定芽分化的影响
外植体的切取方法同1.3.1,将其接种到添加1.0mg·L-16BA及不同种类及不同浓度生长素(NAA:
0.5、1.0、2.0mg·L-1;2,4D(2,4二氯苯氧乙酸):
0.5、1.0、2.0mg·L-1)的MS培养基中。
每处理6瓶,每瓶接种5个叶片外植体。
愈伤组织诱导率、叶片再生率和增殖系数统计方法同1.3.1。
1.4 培养条件
培养基均添加30g·L-1蔗糖、7.0g·L-1琼脂,pH为5.8,高压高温灭菌20min。
在(25±2)℃、光照12h·d-1、光照强度36mmol·m-2·s-1条件下培养。
1.5 数据处理
数据统计分析采用MicrosoftExcel和SAS软件处理,多重比较采用Duncan′s检验法。
2 结果与分析
2.1 不同植物生长调节剂组合对芽增殖的影响
5种菊花近缘野生植物带芽茎段接入增殖培养基第10天发现茎段切口处开始膨大,有隆起的愈伤组织形成,第12天开始有黄绿色丛生芽形成。
各个种愈伤组织及不定芽的形成时间先后相差3~5d,其中,RG7最先形成愈伤组织,而ZB7最先分化不定芽。
同时,每个种最适的增殖培养基表现出明显的基因型差异。
由表3可知,RG7在1.0mg·L-16BA、0.05和0.10mg·L-1IBA时,增殖系数较高,分别为2.93和3.30,与其他处理之间存在显著差异,因此,MS+1.0mg·L-16BA+(0.05~0.10)mg·L-1IBA是RG7的优选增殖培养基(图1A)。
ZB1在MS+0.5mg·L-16BA+0.1mg·L-1NAA中增殖系数最高,达4.93(图1B);在MS+2.0mg·L-1KT+0.1mg·L-1NAA和MS+0.5mg·L-1KT+0.1mg·L-1NAA中增殖系数也较高,分别为4.00和3.97,与其他培养基之间差异显著,但三者间差异不显著。
其中,ZB1在MS+2.0mg·L-1KT+0.1mg·L-1NAA中分化的不定芽高度适中、节间均匀、茎充实健壮,生长状态良好。
ZB6各处理间的增殖系数差异较大,除处理2和处理7之间差异不显著外,其他均差异显著,以MS+0.5mg·L-1KT+0.1mg·L-1NAA的增殖系数最高,达11.57(图1C)。
ZB7各处理间除处理3和处理7外,其他差异均显著,以MS+1.0mg·L-1KT+0.1mg·L-1NAA增殖效果最佳,增殖系数达9.87(图1D)。
ZB8在各类培养基上的增殖系数均较低,但6BA比KT更有利于ZB8增殖,其中MS+2.0mg·L-16BA+0.1mg·L-1NAA的增殖系数最高,达3.50(图1E)。
图1 不同培养基对试管苗生长的影响
2.2 不同基本培养基对试管苗生根的影响
5种菊花近缘野生植物在1/2MS和MS基本培养基上均能生根,且在生根率、平均根数和平均根长方面,两者差异不显著(表4,图1F、G)。
但供试材料试管苗在1/2MS培养基中的根系明显粗壮,根毛多,小苗长势健壮,与多种植物试管苗生根要求较低无机盐浓度的结果相似,且可以降低培养基成本。
2.3 不同生长素种类及其浓度对试管苗生根的影响
由表5可知,5种菊花近缘野生植物各处理间的生根率差异不显著。
培养基中添加不同浓度的NAA与IBA对RG7、ZB6、ZB7试管苗生根数的作用不明显,对RG7、ZB1、ZB8试管苗平均根长也没有显著性影响。
与对照相比,IBA对ZB1(图1H)和ZB8试管苗促进生根作用不显著,而不同浓度NAA对ZB1的生根有一定的抑制作用,浓度越大抑制作用越明显(图1I);ZB8在NAA为0.2mg·L-1时生根数显著高于对照,但NAA在0~0.1mg·L-1时与对照差异不显著,表明NAA只有达到较适浓度才能起作用,在一定范围内,浓度越大,促进作用越明显。
对ZB6和ZB7而言,添加NAA时其平均根长显著低于对照,但添加IBA对其平均根长没有显著影响,仅0.1mg·L-1IBA对ZB6根伸长存在明显抑制作用。
综合认为,1/2MS培养基是RG7、ZB1、ZB6、ZB7生根的适宜培养基,ZB8选用1/2MS+0.2mg·L-1NAA更适合。
2.4 不同植物生长调节剂种类及浓度对离体叶片愈伤组织诱导的影响
2.4.1 不同细胞分裂素种类及浓度对离体叶片愈伤组织诱导的影响
叶片外植体接种培养3d后,切口边缘开始膨大,叶片逐渐增厚;5d后,在切口边缘观察到黄绿色的愈伤组织。
RG7、ZB1和ZB7愈伤组织诱导较容易,而ZB6和ZB8相对较难。
由表6可知,在添加不同种类及浓度的细胞分裂素后,RG7、ZB1和ZB7的愈伤组织诱导率达80.0%~100.0%,RG7、ZB1在添加0.5mg·L-16BA时显著低于其他处理,ZB7愈伤组织诱导率在相同细胞分裂素的各浓度间差异不显著。
RG7在添加1.0和2.0mg·L-16BA或0.5、1.0和2.0mg·L-1KT的培养基中愈伤诱导率均达100%;ZB1在6BA为1.0、2.0mg·L-1或KT为0.5mg·L-1时,ZB7在6BA质量浓度为0.5和1.0mg·L-1时愈伤组织诱导率均达到100%。
而ZB6和ZB8的愈伤组织诱导率相对较低,ZB6愈伤组织诱导6BA的效果好于KT,当6BA为2.0mg·L-1时愈伤组织诱导率最高,达86.7%,而2.0mg·L-1KT未能诱导出愈伤组织;ZB8愈伤组织诱导采用KT的效果好于6BA,在KT质量浓度为0.5mg·L-1时诱导率最高,达66.7%,而6BA质量浓度为2.0mg·L-1时愈伤诱导率为0。
2.4.2 不同生长素种类及浓度对离体叶片愈伤组织诱导的影响
由表7可知,RG7的愈伤组织诱导率随着NAA质量浓度的增加而降低。
NAA为2.0mg·L-1时,RG7的愈伤组织诱导率只有80%,显著低于其他处理;不同质量浓度2,4D的愈伤组织诱导率均达100%。
对ZB1、ZB7而言,不同质量浓度NAA和2,4D的愈伤组织诱导率均为100%。
NAA各质量浓度对ZB6的愈伤组织诱导率均为100%,而高质量浓度2,4D则表现出一定的抑制作用。
与RG7类似,高质量浓度NAA抑制ZB8愈
伤组织的诱导,而0.5~1.0mg·L-1NAA及不同质量浓度2,4D的诱导率均达100%。
2.5 不同植物生长调节剂对愈伤组织不定芽分化的影响
15d后将带有愈伤的外植体继代到相同培养基上,愈伤组织继续膨大,继代后3~5d陆续观察到绿色芽点突起,20d开始有不定芽形成,但仅ZB7和ZB8(图1J)诱导出不定芽。
由表8可知,对ZB7而言,低质量浓度的细胞分裂素有利于不定芽的发生与增殖(图1K),6BA和KT为0.5mg·L-1时,ZB7的再生率分别为60.0%和75.0%,增殖系数分别为3.0和3.4;NAA或2,4D为1.0mg·L-1时有利于ZB7不定芽再生和增殖,浓度过低作用效果不显著,浓度过
高则表现抑制作用,当NAA为1.0mg·L-1时促进效果显著(再生率为70.0%,增殖系数为3.0)。
对ZB8而言,6-BA对不定芽形成和增殖系数的促进作用显著高于KT,且表现低浓度促进效应,6BA为0.5mg·L-1时不定芽再生率和增殖系数最高,分别为70.0%和2.4;NAA和2,4D两种生长素的再生率均较高,NAA质量浓度为0.5mg·L-1时增殖系数可达5.8,而且不定芽生长健壮(图1L)。
3 讨论
植物离体形态发生主要受基本培养基、植物生长调节剂、基因型等因素的影响[9]。
王丽华等[10]研究发现MS培养基最适合菊花组织培养。
本试验在进行菊花近缘野生植物组织培养时,以MS作为基本培养基,添加不同生长调节剂种类及浓度发现,茎段外植体的增殖率与生长调节剂的种类和浓度相关性较大,而且各物种的最佳增殖培养基附加的生长调节剂种类和浓度各异,表现出明显的基因型差异。
其中龙脑菊和那贺川野菊的增殖率较其他基因型的野生种高,快繁体系的构建相对容易;其余3个野生种也可以诱导增殖,但增殖率相对较低,有必要进一步探讨更合适的生长调节剂浓度或采用其他的生长调节剂来进一步提高增殖率。
多数报道表明1/2MS培养基是菊属植物试管苗最适合的生根培养基[10]。
本试验中,以1/2MS为基本培养基,添加NAA或IBA对5种菊花近缘野生植物生根率没有显著影响。
紫花野菊变种、纪伊潮菊、龙脑菊、那贺川野菊的适宜生根培养基均是1/2MS,仅矶菊的适宜生根培养基与李辛雷等[11]关于栽培菊的生根报道一致。
NAA对平均根数与平均根长表现出不一致的作用效果,存在显著的基因型差异。
刘军等[12]曾报道,IBA比NAA对菊花平均根长促进效果好,而本试验中IBA的促进效果不明显。
对叶片外植体愈伤诱导率的研究表明,当生长素浓度一定时,不同的细胞分裂素浓度对愈伤组织诱导率的影响较大;而当细胞分裂素浓度一定时,不同生长素浓度对愈伤组织诱导率的影响不显著,仅较
高浓度(2.0mg·L-12,4D和NAA)降低诱导率,表明细胞分裂素对几个菊花野生近缘种离体叶片愈伤诱导的影响较生长素强烈,这可能与这些菊花内源激素的水平有关。
此外,不同植物生长调节剂对愈伤组织再分化芽能力的影响也因基因型而异,采用不同激素配比试验诱导不定芽时,只有那贺川野菊、矶菊分化出不定芽,其他3个野生种在30d内未能观察到不定芽的形成,其原因有待进一步研究。
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