BD FACSCalibur流式细胞仪培训手册Word文档下载推荐.docx
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35μl/min
HI:
样品流速:
60 μl/min
功能控制:
∙RUN:
此时上样管加压,使细胞悬液从进样针进入流动室。
(正常显示绿色;
黄色时表示仪器不正常,请检查就是否失压、)
∙STANDBY:
ﻩ无样品或暖机时之正常位置,此时鞘液停止流动,雷射功率自动降低、
∙PRIME:
去除流动室中得气泡,流动室施以反向压力,将液流从流动室冲入样品管,持续一定时间后,以鞘液回注满流动室。
PRIME 结束,仪器恢复STANDBY状态。
4、储液箱抽屉:
在主机左下方之储液箱抽屉。
可向前拉开,内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter,及空气滤网Airfilter、请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置、
∙鞘液筒:
位于抽屉左侧,容积4升、装八分满鞘液筒,仪器可以运行大约3小时。
筒上装有液面感应器,鞘液用完时,仪器软件上会有显示。
鞘液筒盖上有金属环扣,保证鞘液筒密闭、
∙废液筒:
位于抽屉右侧,容积4升。
筒上装有液面感应器,废液盛满时,仪器软件上会有显示。
注意废液可能有潜在得生物传染性。
∙鞘液过滤器:
0、22μm过滤器,去除鞘液中得杂质,保证进入流动室得鞘液就是干净得。
∙气路减压阀:
沿箭头方向移动阀门开关,鞘液筒减压,气压恢复正常、在鞘液筒添加鞘液时,需要减压。
∙空气过滤网:
用于过滤冷却雷射得空气、
5. 上样品区:
上样品区就是样本管得上样位置。
它包括三个部分,一个就是进样针Sample Injection Tube,将样本输入流动室,还有就就是支撑架 TubeSupport Arm、与液滴存留系统DropletContainmentSystem。
∙进样针:
就是一根不锈钢管,将细胞从样本针中吸入流动室。
进样管外有一套管,就是液滴保留系统得一部分。
∙支撑架:
用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。
支撑架有三个位置:
位于样本管之下得中位,样本管左侧或右侧。
液滴存留系统:
系统由支撑架、真空帮浦与外套管组成。
当支撑架位于左侧或右侧位置时,真空帮浦就会启动,将液体从外管吸入废液筒内。
上样时,须注意将支撑架位于中位,以避免过多样品被抽吸到废液筒内(当支撑架位于中位,真空帮浦停止工作)、更换样品时,让仪器保持RUN得模式,使得进样针可以反冲;
切换到STANDBY模式前,确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。
1。
2Macintosh计算机与打印机:
准备您得细胞样品
1.理想样品浓度调至1—10 X105cells/ml?
一般实验只需0.5 ml得样品、
2.细胞样品务必放至BDFALCON 352052试管中,否则无法上机。
3.上机前务必去除样品中之细胞团块,以防止管路堵塞?
可使用附滤网BDFALCON试管(Cat.No.352235)或35-55μm得尼龙筛网。
4.供流式分析得样品就是单细胞悬浮液,而且大部分样品都需经荧光染色。
表面抗原荧光染色得方法大致有两种:
直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。
研究生可至本公司网站下载染色方法
∙直接免疫荧光染色
∙Lysed—No— WashProcedure
∙Lysed-And—Wash Procedure,SimulTEST&
HLA—B27
∙PeripheralBloodMononuclearCellProcedure
∙LeukemiaandLymphomaProcedure1
∙LeukemiaandLymphomaProcedure2,B—cellClonality Assay
∙间接免疫荧光染色
∙滴定抗体浓度
∙常用试剂
5.如因特殊因素无法下载上述实验方法,请e—mail:
或、
二、开机、关机标准操作
2、1 FACSCalibur 开机
1.开启细胞仪电源。
2.开启其它周边配备电源,如打印机及MO机。
3.开启计算机。
4.确认鞘流液筒有八分满得FACSFlow,确实旋紧(鞘液筒容量为4L)。
5.将废液倒掉,并在废液筒中加入200ml家用漂白水(废液筒容量为4L)。
6.将减压阀方向调在加压(Pressurize)位置。
7.排除液流管路与过滤器中得气泡、
8.取下样品管,执行PRIME功能两次。
9.使用1ml PBS,HIGHRUN 两分钟。
10.可开始分析样品。
2、2 FACS Calibur关机
关机前必要动作:
清洗进样管与外套管,防止进样管堵塞、或有染料残留、
1.将样品支持架左移,取2mlFACSClean(10%Bleach)上样品,让仪器得真空系统抽取约1 ml得液体。
2.将样品支持架回正,按 HIRUN,然后让FACSClean清洗管路10分钟。
3.按Standby,取下样品管,执行PRIME功能两次、
4.取 2mldH2O,重复上述步骤1-3。
5.注意最后只留约 1 mldH2O在试管中。
6.按STANDBY五分钟,使风扇冷却雷射后,关闭细胞仪(必要动作,以保护雷射光源、)
7.倒掉废液,并回填200ml漂白水。
8.将减压阀放在「VENT漏气」位置。
将鞘流液筒充填至八分满、
9.退出软件“File”→“Quit”(如有对话选项,选择“Don‘t save”)。
确认退出计算机中所有BD应用软件,所有数据数据已储存备份。
10.关闭计算机、“Special"
→“Shutdown”。
三、上机分析流程
建议首次试机避免进行大量试验,仅需准备下列样品。
(1)NegativeControl(不加任何抗体)。
(2)CD3-FITC(FL1 单染)。
(3)CD19-PE(FL2单染)。
(4)CD3-FITC/CD19-PE(FL1/FL2双染)、
3。
1Calibur开机
1.先开启细胞仪本体再打开计算机。
*秘技1:
如顺序相反,仪器与计算机之间无法建立正常通讯,无法执行“connecttocytometer”、解决之道,两者都关机、然后以正确方式重开。
2. 向前拉开储液箱抽屉,检查鞘液筒、废液筒水量,如需充填鞘液,将减压阀方向调在VENT位置(箭头方向)、
3。
仪器会对鞘流液筒打气加压,请确认筒盖确实旋紧。
*秘技2:
将减压阀方向调在加压(向前)位置。
减压阀如在VENT(箭头方向)位置,按RUN功能键时将显示橙黄色(表示仪器不正常,请检查就是否失压),正常为绿色显示。
2开启CellQuest 软件、编辑实验文件
4、 在苹果菜单下点击CELLQuest启动软件。
桌面会出现一’Untitled'
实验文件,可点击实验文件得右上角得放大钮,将实验文件窗口放大。
5、从工具板中点击散点图图示。
在实验文件得空白区点击,拖曳对角线至适当大小,然后放开鼠标。
出现散点图对话方框。
6、在出现得散点图对话方框中点击Plot Source,选择Acquisition(收取),确认X与Y轴参数预设为FSC-H1024、SSC-H1024、在颜色方框中点击Multicolor Gating(收取样品时,门内细胞将出现颜色)、点击OK。
此时实验文件会出现FSC/SSC散点图。
7、说明:
散点图(Dotplot),又称二维散点图就是流式分析最常用图谱,它可以显示两个独立参数得相互关系。
在图中,横坐标X轴为为荧光1强度得相对值,单位就是道数,纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度得相对值、仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。
第一图X与Y轴参数分别设为FSC-H1024、SSC—H 1024;
第二图X与Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H1024。
修改动作为轻击图谱上X与Y轴参数,并依需要选择之(FSC:
细胞大小,SSC:
细胞折射率,FL1:
FITC绿色荧光,FL2:
PE橙色荧光,FL3:
PerCP红色荧光)、
8。
从屏幕上方Plots菜单中选择DotPlot功能,可复制一个同样大小得散点图,在出现得对话方框内选择X轴:
FL1—H1024,Y轴:
FL2—H1024、点击OK,FL1/FL2得散点图出现。
完成后可将重制图移至原图右方、
9. 在工具板中选择四象限工具,在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant得中心将它设定在(x,y)=(101,101)处,这些象限将指定阴性/阳性区域。
建立仪器与计算机之间通讯
10、从Acquire菜单中选择Connectto Cytometer,此时会出现AcquisitionControl 对话方框、如果无法选择ConnecttoCytometer,参考秘技#1、如果没见到AcquisitionControl对话,可到屏幕上方Windows菜单中选择ShowAcquisitionControl。
仪器设置文件
注意:
实验数据质量,取决于最适化仪器设定文件、仪器设定文件不能在数据收取后再更改,研究人员必须在第一次就使用正确得仪器设定文件。
仪器设定文件(Instrument settings),含信号器高压(Detector/ Amps),阈值(Threshold),荧光补偿(Compensation)等仪器条件得组合、一般而言,仪器设定得顺序为Detector/Amps—-Threshold--pensation。
11.检查现有仪器条件,从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。
出现Detectors/Amps窗口、在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC为LIN(线性放大),其它FL1-3为LOG(对数放大),将其拖至空白区。
12.从Cytometer菜单中选择Threshold,出现Threshold窗口在Threshold 窗口:
确认FSC为设阈参数,初步确认预设阈值52。
将其拖至空白区。
13。
从Cytometer菜单中选择Compensation,确认所有预设数值皆为零。
3、3上样品、设置仪器
14、 使仪器处于HighRUN,支撑架左移,上阴性对照管样品,支撑架回位。
确认AcquisitionControl 窗口中☒Setup前需打叉或打勾 (即不储存数据),点击Acquire。
调节FSC/SSC探测器(电压)
15。
观察FSC/SSC图得变化。
FSC电压(Voltage)预设为E00,可调节AmpGain从1、00-9、99 使主要细胞群得以清楚显示(如细胞较大,将FSC电压设置于E—1;
较小细胞,将FSC电压设置于E01)。
调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。
调节FSC/SSC图得原则,在于能得到一独立离散得细胞族群,该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象。
调整定位后,点击AcquisitionControl 窗口中得Pause。
Gating圈选
细胞检品中,常含有大小不同、性质相异得细胞群体。
我们常用前方散射与侧方散射得二维位图,即散射光图谱(ScatterPlot),来圈选出不同细胞群得范围,选择性显示出有意义得细胞群体,如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。
16。
在工具板中选择多边形得Region,在FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1区域(如下图)、分析样品时,区域内细胞应会呈现成红色,可移动或改变形状来圈选有意义得细胞。
如果要删除R1区域,您可以在工具栏中点选Gates→ Regionlist,以鼠标点选R1,再按Delete键删除R1 区域、删除R1区域后,可用绘图工具板,重画R1。
17、选取希望Gate得FL1/FL2散点图,从Plots菜单中选择Formatdot plot、在出现得对话方框内,将NoGate 改选 G1=R1。
点击OK。
调节FL1、FL2得探测器(电压)
18、 点击AcquisitionControl窗口中得Restart、在Detector/Amps窗口中调节FL1、FL2得电压,使NegativeControl细胞群着落在所选直方图或散点图之100——101处、
19、 在Threshold窗口,适当地提高FSC阈值〉52,以去除碎片或低阶噪音。
唯需注意不要切掉主要细胞族群。
20、 点击Acquisition Control 窗口中得Pause、Abort、移去阴性对照管,关闭Detector/Amps、Threshold窗口,我们已设定好有意义细胞群之自体荧光。
调节荧光补偿
说明:
最适化得最后一步就是调节光谱重迭。
(如就是单色荧光实验可跳过此步骤)如就是2色样本,必要时需调节FL2-%FL1,FL1-%FL2(若3色样本,必要时需调节FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3得补偿)。
21。
HighRUN,换上单染CD3—FITC管。
点击AcquisitionControl窗口中得Acquire。
调节FL2-%FL1使FITC阳性细胞在FL1/FL2散点图得右下象限、补偿调节可通过点击↑↓来选择或直接拖动滑标上下移动。
调节完毕,点击AcquisitionControl窗口中得Pause、
22、 移去单染CD3,换上单染CD19-PE管、点击AcquisitionControl窗口中得Restart。
调节FL1-%FL2使PE+细胞在FL1/FL2散点图得左上象限。
调节完毕,点击AcquisitionControl窗口中得Pause、
23。
最后以CD3—FITC/CD19—PE双染样本上机,点击AcquisitionControl窗口中得Restart,确定三群细胞工整垂直、当您已完成2色荧光之光谱重迭时,点击AcquisitionControl窗口中得Pause、Abort。
24、移去样本管,换上dH2O管,让仪器暂且处于Standby状态。
关闭Compensation窗口。
您已完成2色荧光之最适化。
4收集实验数据
决定储存细胞总数
25、预设之「储存细胞总数」为10000。
如需修改,从Acquire菜单中选择Acquisition &Storage,并在出现得窗口功,确认「Collection Criteria」从10000ofAll,再点击OK。
26。
找个档案匣准备储存数据、从Acquire 菜单中选择ParameterDescription,出现Parameter Description对话方框、点击Folder,并在随后出现之对话方框,选择「YourFolder」或新建活页夹,点击此对话方框得Select’YourFolder'
、
27. 命名即将储存之文件名:
点击ParameterDescription对话方框得File,出现文件名编辑窗口。
在Custom Prefix中:
输入文件名,点击此对话方框得OK、日期为最常用之文件名系统。
28。
Optional:
如有需要,可选择或在P1-P5后得空格中输入相关参数名。
如P1:
Size, P2:
Granularity,P3:
CD3FITC。
输入参数名会存入实验档案中,显示在图谱上。
计数器Counters
29、 从Acquire菜单中选择Counters、窗口会显示样品分析速率、与总数进度、
收集实验数据
30。
您可以开始收集实验数据了。
HIGHRUN,将第一管样品放到检测区,在Acquisition Control窗口中,将☒ Setup改成 ☐Setup,此时CellQuest会自动显示Your Folder:
20031231。
001为资料文件名、点击“Acquire”便可启动样品之分析测定与数据储存。
当计算机成功地收取足够数据,会自动储存数据文件20031231、001,并会以“嘟”声告知,CellQuest会自动升幂附加档名成20031231。
002、等待下一指示。
31。
您可以换上下一管样品,点击“Acquire”启动样品之分析测定与数据储存。
可继续分析直到所有检品都分析完毕。
3.5实验数据之储存与备份:
32。
不建议长期使用硬盘储存数据数据,可考虑以烧光盘(如配有 CD-RW)、口袋硬盘(FlashDrive)来备份大量实验数据,以免占用原有硬盘得内存,影响数据处理速度。
可将备份后之数据,拿到另一苹果计算机或个人PC进行离机分析。
33。
确认所有档案皆己备份后,以鼠标圈选欲删除数据,将其拖拉至Trash筒。
退出软件
34. 检品分析完毕后,记得从屏幕上方File指令栏选择 Save As,储存实验文件,以备日后使用,不需每次重新编辑。
35、从屏幕上方 Cytometer指令栏,选择InstrumentSetting,出现Instrument Setting窗口。
点系print打印此次实验条件,可贴入实验笔记留底,再点击Save以储存此一实验得仪器条件,供日后再使用。
点系SAVE后会出现文件保存对话方框,选择文件目录及文件名(例:
YourFolder:
/YourSetting1),点击Save。
点击Done、
36、检品分析完毕后,用鼠标从屏幕上方 Acquire 指令栏中,选取DisconnecttoCytometer以断绝计算机与仪器间之联机。
之后如不分析数据,您可退出软件“File”→“Quit"
(遇有选项永远选择“Don‘tsave”),进行关机程序。
管路清洗
37。
以2ml10%漂白水取代样品,将样品架置于左位以外管吸除约1ml,再将样品架置于中位HIRUN十分钟。
改用2mlDIwater。
重复上述程序,样品架上留约1mlDIwater 。
按STANDBY五分钟。
关主机、关计算机
四、数据分析
FCSlistmode数据文件:
FCSlistmode数据文件就是流式细胞仪得标准格式档案(FCS2、0)。
该文件含有从流式细胞仪收取得平均10,000个细胞数得资料,含有4~6个参数。
一般软件无法打开listmode数据文件,需藉助如CellQuest,WinList,WinMDI,等Flow分析软件,才可开启、绘图、并进行分析统计、
4、1开启一CellQuest实验文件
1、 从屏幕上方File菜单中选择New。
桌面会出现一'
Untitled’实验文件,可点击实验文件得右上角得放大钮,将实验文件窗口放大。
4、2散点图之统计分析(双色)
2.从工具板中点击散点图图示。
在实验文件得空白区点击,然后拖动对角线至适当大小。
Plot拖曳完成后可以在右方瞧到Dot Plot对话框。
3.在DotPlot方框中,PlotSource应预设为Analysis,可点击 SelectFile钮,并用随后之方框来开启预存之Sample Files,它们得路径位于MacHD:
BDApplications:
CellQuestFolder:
SampleFiles。
连续双击鼠标来打开次目录,找到档案后,点击Open来开启NORM001档案。
X 与 Y参数项会出现默认值—FSC—H 256与SSC-H256,在Color方框中点击MulticolorGating,确认无误之后,点击OK 便完成了一个NORM001得FSC /SSC散点图、
4.工具板中选择多角形区隔工具,将Cursor 移至FSC/SSC散点图上,并沿着淋巴球聚落周边画出范围,连点击两次可关闭该区域。
您已完成R1区域得界定,我们将以此区域来圈选淋巴细胞。
(如果要删除R1区域,您可以在工具栏中点选Gates →Regionlist,以鼠标点选R1,再按Delete键删除R1区域。
删除R1区域后,可用绘图工具板,重画R1。
)
5。
从Plots菜单中选择Dot Plot可复制一个同样大小得散点图,屏幕上会出现一Dot Plot 对话方框。
点击X Parameter钮来显示 NORM001 档案中所有得参数项(FSC,SSC, FL1, FL2)将X参数项改成「FL1-H256 Gamma-1」,Y参数项改成「FL2-H256Gamma—2」、从Gate输入栏中将 NoGate 改成G1=R1。
6。
点击OK便完成了一个以G1圈选得FL1/FL2散点图,可将复制图移至原图右方。
NORM
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