精品食品中过敏原成分环介导等温扩增LAMP检测方法第14部分花生编制说明.docx
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精品食品中过敏原成分环介导等温扩增LAMP检测方法第14部分花生编制说明
食品中过敏原成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第8部分:
花生
编制说明
1基本信息
1.1标准草案名称
中文
食品中过敏原成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法
第8部分:
花生
英文
Loop-mediatedisothermalamplificationdetectionmethodforallergencomponentsinfoodPart8:
Peanut
1.2与国际标准和国外先进标准一致程度情况
等同
修改
非等效
标准号
/
英文名称
/
中文名称
/
1.3任务来源
批准立项的文件名称和文件号
计划编号
1.4制(修)订情况
制订√
修订
替代的标准编号
/
1.5起止时间
2012年01月~2013年12月
1.6起草单位
中国检验检疫科学院;山东出入境检验检疫局
1.7起草人
刘彩霞、高宏伟、孙敏、龚方、陈颖、吴亚君、韩建勋、黄文胜、邓婷婷
1.8专业类别
1、食品(化妆品)检验√;2、卫生检疫;3、动物检疫;4、植物检疫;
5、纺织产品检验;6、轻工产品检验;7、机电产品检验;8、化工、矿产品和金属材料检验;9、管理;10、鉴定;11包装及危险化学品
1.9标准体系表代码
1.10调整情况
2背景情况
2.1目的、意义
花生是我国主要油料作物和经济作物之一,油料总产居第一位。
花生营养丰富,花生种子可以炒、炸、捣碎磨酱,做花生糖、花生酥等糖果、糕点、饮料等,是100多种食品的重要原料。
同时,花生种子蛋白是重要的食品过敏原之一。
超过敏病人摄入100µg花生蛋白就可有道花生过敏反应,有的会引起致命性的休克并危及生命。
据报道,现在美国和英国有59%的食物过敏是由花生过敏原引起的,占到了第一位。
在亚洲一些的国家和一些地方,花生是食品里面引起儿童食物过敏的主要原因,吃了很少量的花生过敏原就可能引起过敏反应如肠胃不舒服、过敏性皮炎等疾病。
Assemet等研究表明,食品过敏人群中有30%的人对花生过敏,中国协和医科大学变态反应科通过对就诊人群的调查表明,仅北京地区就有约4%的食品过敏患者对花生过敏。
相对于其他过敏原如牛奶、鸡蛋而言,花生过敏通常是终生的,只有10%的过敏儿童会随年龄的增长产生耐受性。
对花生过敏的患者来说,不吃含有花生的食物是目前最有效的预防方法。
鉴别食品中的花生成分过敏原是保障易过敏消费者的安全,降低过敏的发病率的最有效措施。
目前食物过敏仍只能预防不可治愈。
近年来食品安全事件不断发生,食品过敏已成为重要的食品安全问题。
食品安全问题受到越来越多的重视。
特别是随着食品工业的迅速发展,食品过敏为食品监管和检测等提出了新的挑战。
美国和欧盟制定了食品过敏原标签法规,法规要求生产企业明确表明其产品中是否含有8大类主要的食品过敏原。
美国及欧盟等国家开始对部分进口的食品进行花生过敏原抽检,而我国食品出口企业常因食品过敏原标注与实际不准确而遭遇退货。
根据检验检疫工作实际,需要研制出方便、快捷、易于携带的检测花生过敏原的新方法。
2.2与国内外相关标准、文献的关系
目前检测食品中花生过敏原成分主要有2种方法:
(1)检测花生过敏原蛋白成分
(2)检测过敏原基因残留。
食物过敏原在食品中的含量非常少,而且还可能被其他东西包裹,所以食物过敏原蛋白的检测十分困难和不易,检测过敏原蛋白容易出现假阳性。
过敏原DNA残留检测技术主要依靠各种PCR技术。
PCR和Real-timePCR具有高度灵敏性、无放射性污染等优点已经在食品安全检测各领域中广泛应用。
国内外已有使用PCR技术扩增花生主要过敏原的文献报道。
环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP),是由日本的荣研株式会社的Notomi等人2000开发出来的一种新型的核酸扩增方法,其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,在链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下,60~65℃恒温扩增,15~60min左右即可核酸扩增,效率可达109~1010个数量级,具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。
在DNA合成时,从脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应,产生大量的焦磷酸镁沉淀,呈现白色。
并可与双链DNA显色剂结合通过颜色变化观察判定结果。
因此,可以把浑浊度或颜色变化作为反应的指标,而不需要繁琐的电泳和紫外观察。
由于LAMP反应不需要昂贵的PCR仪器和昂贵的试剂,在检验检疫工作中有广泛的应用前景。
LAMP技术具有高特异性、高效率和快速反应等特点,可以大量扩增所需的靶序列,该方法方便、快捷、易于携带只需要极少的试剂费用和水浴锅即可完成绝大多数PCR检测过程,无论是在实验室检验还是现场检验都可以准确、快速、灵敏的完成,适用于检测一线进行快速的初步鉴定。
研究表明,Aha2与Aha6是导致花生过敏的最主要过敏原。
Koppelman等用免疫印迹、组胺释放实验以及皮内试验研究了32例病人,发现Aha2是最强的花生过敏原。
本研究根据花生中最强过敏原Aha2基因的进行LAMP检测研究,并通过多次试验确证作为食品中过敏原检测方法使用。
3编制过程
3.1准备阶段(可选项)
3.2分工情况
山东出入境检验检疫技术中心承担全部工作。
3.3标准草案编写情况
2012.01-12 完成标准草案的编写。
3.4征求意见情况(适用于送审稿)
2013.01-7完成标准的征求意见。
3.5审定情况
(适用于报批稿)
3.6预期的管理目标(适用于规程类标准)或技术指标(适用于方法类标准)
本标准适用于定性检测面包、糕点、糖果、饮料、冰淇淋及其他含花生酱类食品中过敏原花生成分,其他可能含花生类食品参照使用。
4主要技术内容的确定
1、国内外相关的标准要求。
2、测定步骤:
3、方法灵敏度要求
4、提供的图谱:
一、国内外相关的标准要求
暂未查到相关检测标准要求。
二、测定步骤
1材料
1.1供试材料
当地超市收集花生样品进行试验。
从当地超市购买东北四粒红花生果、山东大花生、花生碎、花生酱和腰果、榛子、芝麻、核桃、杏仁、葵花籽、荞麦、燕麦、玉米、大米、土豆、小麦用于分析方法的特异性。
将花生样品DNA经过不同程度稀释分析方法的灵敏性。
从当地超市购买标示含有、可能含有以及不含花生成分的食品(花生威化、花生饼、花生面包、花生饮品、花生糖果、花生碎、花生酱)共计25种用于实际样品的检测试验。
1.2主要仪器和设备
℃±1℃和80℃±1℃。
mL、1.5mL。
µL~10µL、量程10µL~100µL、量程100µL~1000µL。
1.3主要试剂和材料
除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。
1.3.1实验用水:
应符合GB/T6682中一级水的规格。
1.3.2dNTPs溶液:
每种核苷酸浓度25mmol/L。
1.3.3BstDNA聚合酶:
酶浓度8U/µL。
1.3.410×ThermolPol缓冲液:
含200mmol/LTris-HCl(pH8.8)、100mmol/L硫酸铵、100mmol/L氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100。
1.3.5硫酸镁溶液:
100mmol/L。
mol/L。
GreenI荧光染料,1000×。
2.01基因利用LAMP引物在线设计软件-PrimerExplorerV3(http:
//primerexplorer.jp/lamp3.0.0)设计一套特异性引物,包括两条外引物F3、B3和两条内引物FIP、BIP。
引物序列见表1。
表1LAMP检测花生过敏原引物序列
名称
编号
序列(5’-3’)
LAMP引物序列
外侧上游引物(F3)
CCCTGCGAGCAACATCTC
外侧下游引物(B3)
TGCACCTTTGGTTGTTCTCA
内侧上游引物(FIP)
ATCCTGACTAGGGCTGTACGGGTGCAGAAGATCCAACGTGAC
内侧下游引物(BIP)
GTCCATATGATCGGAGAGGCGCCGTTCAGCTCATTGCAACAC
2实验步骤
2.1阴性对照、阳性对照和空白对照的设置
阴性对照:
采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。
阳性对照:
采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板。
空白对照:
提取DNA时设置的提取空白对照(以水或DNA溶解缓冲液代替样品);
2.2花生DNA的提取
2.2.1CTAB法
称取处理好样品约100mg(或经过预处理的液体300µL)于1.5mL离心管中,加入300µLCTAB裂解液56℃温育1h,期间不时振荡混匀,必要时,再加入适量CTAB裂解液;8000×g离心5min,取上清于1.5mL新的离心管中,加700µL三氯甲烷,漩涡振荡30s,12000×g离心10min,收集600~650µL上清到新的2mL离心管中,加入2倍体积的CTAB沉淀液,室温1h;12000×g离心5min,去除上清,加350µL氯化钠溶液溶解沉淀,加等体积三氯甲烷,漩涡振荡30s,12000×g离心10min,转移上清到新的离心管,加加0.8倍体积异丙醇,室温20min,14500×g离心10min,加500µL70%乙醇水溶液,漩涡振荡30s,12000×g离心10min,去除上清,室温条件下倒置15~25min,注意不要让沉淀过干。
加100µL双蒸水溶解沉淀,−20℃保存。
2.2.2其他方法
待测样品DNA的提取也可使用市售的适合深加工的植物DNA的试剂盒。
2.2.3DNA浓度的测定
取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸收值。
DNA的浓度按照公式1计算。
当浓度为10μg/mL-100μg/mL,A260/A280比值在1.7-1.9之间时,适宜于LAMP扩增。
C=A260×N×50 …………………………
(1)
式中:
C ——DNA浓度(μg/mL)
A260——260nm处的吸光值
N ——核酸稀释倍数
将设计好的外引物F3,B3及用于LAMP的靶序列进行Blast分析。
NCBI比对靶序列结果显示比对物种为Arachishypogaea、Arachisduranensis、Arachisipaensis,即除花生外该靶序列没有发现与其他物种同源的序列(图1)。
说明该基因靶序列理论特异性非常高。
LAMP反应中外引物F3,B3进行BLAST分析后,除于上述花生物种外,没有发现与其他物种基因匹配。
选择的基因引物能有效扩增花生过敏原基因序列。
引物序列与靶基因的位置如图2所示。
图1靶序列比对结果
F2
F3
ccctgcgagcaacatctcatgcagaagatccaacgtgacgaggattcatatgaacgg
B1C
F1C
gacccgtacagccctagtcaggatccgtacagccctagtccatatgatcggagaggcgct
B3
B2
ggatcctctcagcaccaagagaggtgttgcaatgagctgaacgagtttgagaacaaccaaaggtgca
图2引物与靶序列的位置(右向箭头表示序列链。
左向箭头表示序列的互补链。
GenBank序列号:
FJ713110。
FIP引物序列包含前半段包含F1互补链和F2链,BIP引物序列包含B1互补链和B2。
)
2.3LAMP反应体系
实验过程中设置提取空白对照,阴性对照,阳性对照。
LAMP反应体系总体积25µL,各反应参数及浓度见表2。
表2过敏原花生成分LAMP反应体系
组分
工作液浓度
加样量(µL)
反应体系终浓度
ThermoPol缓冲液
10×
2.5
1×
外侧上游引物(F3)
5µmol/L
1.0
0.2µmol/L
外侧下游引物(B3)
5µmol/L
1.0
0.2µmol/L
内侧上游引物(FIP)
40µmol/L
1.0
1.6µmol/L
内侧下游引物(BIP)
40µmol/L
1.0
1.6µmol/L
dNTPs
100mmol/L
5
20mmol/L
甜菜碱
2mol/L
10
0.8mmol/L
硫酸镁
100mmol/L
0.5
6mmol/L
BstDNA聚合酶
8U/µL
1
0.32U/µL
DNA模板
10ng/µL
2
0.8ng/µL
ddH2O
-
-
-
注:
加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中,不要粘附于管壁上。
实验体系中浓度略有调整的情况下可以用ddH2O补齐25µL。
2.3LAMP反应参数
根据仪器和试剂,在不同的反应温度(61℃、63℃、65℃、67℃)、反应时间(30min、45min、60min、75min)下扩增对LAMP反应参数进行优化,优化后LAMP检测花生适用的最佳反应条件为65℃恒温循环扩增60min,80℃酶灭活5min,反应结束。
2.4结果检测
2.4.1琼脂糖凝胶电泳检测
配制1.5%的琼脂糖凝胶,取4µLLAMP反应结果进行琼脂糖电泳。
调整电泳仪电泳电压至110V,电泳时间约45min,置于凝胶成像分析系统下观测结果。
2.4.2显色反应
向试验管中加入SYBRGreenI荧光染料观察管中溶液,阳性结果产生的颜色变化——由橙色变为绿色来快速判断结果。
3结果
3.1特异性检测
花生经过LAMP扩增后琼脂糖电泳结果见图3,只有花生DNA泳道产生阶梯状条带,以ddH2O和DNA稀释缓冲液AEBuffer做模板的空白对照及以大豆为模板的阴性对照均没有产生条带。
对东北四粒红花生果、山东大花生、鲁花9号花生果,海花一号花生果,白沙171号花生果和腰果、榛子、芝麻、核桃、杏仁、葵花籽、荞麦、燕麦、玉米、大米、土豆、小麦共12个物种的DNA样品进行PCR扩增。
电泳结果表明,只有花生样品能扩出梯形条带,而其他物种均无扩增(图4a)。
显色结果与电泳结果完全一致(图4b)。
选用的基因靶序列和筛选引物可以用来特异检测花生及其源性成分。
M12345678
图3花生样品特异性检测的扩增图谱(M:
DNA分子标记,泳道1、2为大豆DNA扩增结果,泳道3、4为
花生DNA扩增结果,泳道5、6为ddH2O扩增结果,泳道7、8为DNA稀释缓冲液AE扩增结果。
M1234567891011121314151617
a
图4花生样品特异性检测的扩增图谱,a为琼脂糖凝胶电泳结果,b为加入SybGreen显色剂的显色结果。
(M:
DNA分子标记,1为东北四粒红花生果;2为鲁花9号花生果,3为海花一号花生果,4为白沙171号花生果,5~15分别为腰果、榛子、芝麻、核桃、杏仁、葵花籽、松子、玉米、大米、土豆、小麦样品,16为阴性对照ddH2O,17为空白)。
3.2灵敏度检测
为确定LAMP检测体系的灵敏度,用ddH2O将花生基因组DNA溶液系列稀释为100%、50%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.05%、0.02%、0.01%、0.005%、0.002%、0.001%的DNA样品。
将梯度稀释的DNA进行灵敏度扩增,结果进行琼脂糖凝胶电泳。
从图5可见,在含有100%~0.1%浓度的花生DNA的样品中可以检出扩增条带。
在低于0.1%的DNA样品中没有扩增条带。
该方法的绝对灵敏度达到0.1%。
M1234567891011121314151617181920
图5花生样品灵敏性检测的扩增图谱(M:
DNA分子标记,泳道1为100%;泳道2为50%,泳道3为10%;泳道4为5%;泳道5为2%,泳道6为1%,泳道7为0.5%,泳道8为0.2%、泳道9为0.1%、泳道10为空白,泳道11为DNA分子标记,泳道12为0.05%,泳道13为0.02%,泳道14为0.01%,泳道15为0.005%、泳道16为0.002%、泳道17为0.001%泳道18、19为阴性对照)
3.3实际样品检测
为验证所建立的LAMP方法的适用性,自本地超市购买了25种不同类型的花生制品,19种食品标示含有花生的制品,分别是:
古德花生面包、笑蕾花生面包、康师傅3+2饼干(花生巧克力味)、青食粒粒皆新酷饼干、青食全麦花生饼干(花生酱)、雀巢威化(花生夹心)、小张师傅酒鬼花生、伊利花生牛奶饮料、新希望核桃花生乳、银鹭桂圆八宝粥、挑豆海苔花生、耶米熊麦通、士力架花生巧克力、能量99棒、徐福记果仁酥心糖、金耀花生牛轧、四季宝花生酱、台湾麻薯(花生味)、甲天下花生汤圆。
5种食品标示可能含有花生的制品:
青食钙奶饼干、卡夫太平苏打饼干、好时巧克力、福事多黑芝麻糊食品、伊利燕麦牛奶饮料和1种非花生样品大麦。
所有样品提取基因组DNA并进行LAMP扩增。
可能含有花生的5种花生制品及大麦样品均未检出扩增条带,19种标示含有花生的样品中有18个样品中检出花生扩增条带,与样品标示基本相符。
实验结果见表3,如图6所示。
表3实验检测样品数据
编号
样品名称
成分
标示
LAMP
检测结果
编号
样品名称
成分
标示
LAMP
检测结果
1
大麦
N
-
14
伊利花生牛奶饮料
含有
+
2
古德花生面包
含有
+
15
雀巢威化(花生夹心)
含有
+
3
笑蕾花生面包
含有
+
16
小张师傅酒鬼花生
含有
+
4
青食全麦花生饼干
含有
-
17
挑豆海苔花生
含有
+
5
康师傅花生巧克力饼干
含有
+
18
耶米熊麦通
含有
+
6
青食粒粒皆新酷(花生碎)
含有
+
19
士力架花生巧克力
含有
+
7
青食钙奶饼干
可能含有
-
20
能量99棒
含有
+
8
新希望核桃花生乳
含有
+
21
徐福记果仁酥心糖
含有
+
9
伊利燕麦牛奶饮料
可能含有
-
22
金耀花生牛轧
含有
+
10
好时巧克力
可能含有
-
23
四季宝花生酱
含有
+
11
银鹭桂圆八宝粥
含有
+
24
台湾麻薯(花生味)
含有
+
12
福事多黑芝麻糊
可能含有
-
25
甲天下花生汤圆
含有
+
13
卡夫太平饼干
可能含有
-
26
ddH20
N
-
注:
N为无相关标示,感官判断成分。
M1234567891011121314151617181920212223242526
图6花生实际检测样品扩增图谱(M:
DNA分子标记,泳道1-26点样顺序与表3样品编码顺序一致)。
4结论
本研究通过针对Arah2基因设计了4条特异性引物,并通过反应体系优化实验确定最佳反应时间和反应温度为65℃,60min,80℃,5min的情况下扩增效果最佳。
并且通过对实际含有可能含有不含有花生的样品进行LAMP扩增,验证了方法的特异性,同时,通过两种不同的结果判断方法,均证明了本研究的可行性。
本方法的检测底限为0.1%。
5验证情况(适用于方法类标准)
5.1验证单位情况
必填
验证单位
验证人员
验证时间
上海出入境检验检疫局
张舒亚
2013年7月24日
辽宁出入境检验检疫局
郑秋月
2013年7月24日
厦门出入境检验检疫局
陈双亚
2013年7月24日
福建出入境检验检疫局
陈文炳
2013年7月24日
中国海洋大学
唐学玺
2013年7月24日
国家海洋局第一海洋研究所
郑明刚
2013年7月24日
5.2验证过程
采用山东局技术中心提供的实验材料及实验方法,分为2部分验证:
1、特异性验证
对3个花生样品(编号1、编号2、编号3)和其他油料作物种子材料葵花籽、核桃、杏仁、榛子4种进行LAMP实验。
2、灵敏度验证
对提供的样品DNA梯度稀释成10%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%进行梯度检测。
5.3验证数据分析
1、特异性检测结果
实验对花生(编号1、编号2、编号3)、葵花籽、核桃、杏仁、榛子进行核酸提取和LAMP检测实验,图谱显示在给定实验条件下,花生样品能扩增除梯状条带,其他4种没有扩增(图1)。
M123456789
图1花生特异性检测结果(M:
DNA分子标记,泳道1为葵花籽扩增结果,泳道2为花生1号,泳道3为核桃、泳道4为杏仁、泳道5为榛子,泳道6为花生2号,泳道7为花生3号,泳道8
为阴性对照)
图2花生特异性检测显色结果,绿色为扩增阳性,橙色为扩增阴性。
(1代表花生1号,2代表花生2号,3代表花生3号,4代表葵花籽,5代表核桃、6代表杏仁、7代表榛子,8代表阴性对照)
2、灵敏性检测结果
M12345678M
图3花生灵敏度检测结果(M:
DNA分子标记,泳道1:
DNA稀释倍数为0.001%扩增结果,泳道2:
DNA稀释倍数为0.05%,泳道3:
DNA稀释倍数为0.1%、泳道4为ddH2O、泳道5:
DNA稀释倍数为0.5%,泳道6:
DNA稀释倍数为1%,泳道7:
DNA稀释倍数为2%,泳道8:
DNA稀释倍数为10%)
图4花生灵敏度检测结果(1-8分别为10%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%和ddH2O)
5.4验证评价
经特异性实验验证,本实验提供的方法能够特异扩增花生样品成分。
灵敏性分析表明DNA浓度水平在0.1%以上能检测到,DNA浓度低于0.1%水平未检测到。
电泳结果与显色结果一致。
实验中未出现假阳性和假阴性。
实验数据呈现结果好。
5.5其他应说明的情况
6附加说明(可选项)
6.1宣贯标准的建议
6.2修订和废除现行有关标准的建议
6.3作为强制性标准或推荐性的建议
6.4其他需要说明的情况
6.5参考文献
SN/T1961.1-2007食品中过敏原成分检测方法第一部分:
酶联免疫法检测花生成分
SN/T1961.2-2007食品中过敏原成分检测方法第二部分:
实时荧光PCR法检测花生成分
张丽,吴刚,武玉花等.新型花生内源特异参照基因的开发与应用研究.中国油料作物学报,2008,30(4):
411-416.
王通,梁炫强,李玲.花生致敏原的研究进展.中国油料作物学报,2007,29(3):
353-358.
刘彩霞,梁成珠,徐彪等.抗草甘膦转基因大豆寄加工品LAMP研究,大豆科学,2009,28
(2):
305-3
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- 精品 食品 过敏原 成分 环介导 等温 扩增 LAMP 检测 方法 14 部分 花生 编制 说明