饲料添加剂I粪肠球菌质量内控标准提供伟嘉版本.docx
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饲料添加剂I粪肠球菌质量内控标准提供伟嘉版本
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DBNF-SW-5-Y005
北京大北农科技集团股份有限公司内控标准
饲料添加剂(I)粪肠球菌质量内控标准
2013-6-16发布2013-7-1实施
北京大北农科技集团股份有限公司发布
本标准由北京大北农科技集团股份有限公司提出并起草。
本标准主要起草人:
刘雪连
本标准于2013年7月首次发布
饲料添加剂(I)粪肠球菌质量内控标准
1范围
本标准规定了粪肠球菌产品的要求、检验方法、检验规则、标签、包装、运输和贮存。
本标准适用于本公司生产的粪肠球菌饲料添加剂。
2规范性引用文件
下列文件对本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注明日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T
食品卫生微生物学检验大肠菌群测定
GB/T
饲料采样
GB/T
饲料粉碎粒度测定法
GB/T6435-2006
GB10648
GB/T13079-2006
GB/T13080-2004
GB/T13091-2002
GB/T
GB/T18823-2002
JJF1070-2005
饲料中水分的测定
饲料标签
饲料中总砷的测定
饲料中铅的测定原子吸收光谱法
饲料中沙门氏菌的检验方法
饲料采样方法
饲料检测结果判定的允许误差定量包装商品净含量计量检验规则
国家质量监督检验检疫总局第75号令(2005)定量包装商品计量监督管理办法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
杂菌数
指在选择培养基上,除粪肠球菌外的其他细菌和霉菌菌落数之和杂菌率
指杂菌数在目的菌种数和杂菌数之和中所占百分率。
4要求
感官指标
表1粪肠球菌的感官要求
产品名称
项目指标
色泽
八\气味
杂质
外观
DBN粪肠球菌原粉
淡黄色至黄
褐色粉状'
具有乳酸特有的酸甜味,无腐败,无异臭味
无异物
粉末状
DBN粪肠球菌可溶原粉
淡黄色至黄
褐色粉状
具有乳酸特有的酸甜味,X.无腐败,无异臭味\
溶解度大
于95%无
异物
粉末状
DBN粪肠球菌菌粒
乳白色至淡
黄色颗粒状
具有乳酸特有的酸甜味,无腐败,无异臭味
无异物
颗粒状或条状
理化指标
理化指标应符合表2的规定
表2粪肠球菌理化指标
产品名称
项目指标
孔径
水分
粪肠球菌活菌数
(x108个/g)汽
DBN粪肠球菌原粉
7%
500
DBN粪肠球菌可溶原粉
7%
500
DBN粪肠球菌菌粒
10%
500
卫生指标
标准名称卫生指标应符合表3的要求。
表3粪肠球菌卫生指标
\项目
指标
\杂菌率w
%
致病菌(肠道致病菌或致病性球菌)
不得检出
总砷(以As计)(mg/kg)
w
铅(以Pb计)(mg/kg)
w
其它卫生指标
符合NY/T14442007中的规定
净含量
按国家质量监督检验检疫总局第75号令执行。
5检验方法
本标准使用的水,在未注明其他要求时,应符合GB/T6682中三级用水的要求。
本标准所使用的试剂,在未注明规格时,均为分析纯(AR)。
如有特殊要求另作明确
规定。
抽样
按GB/T的规定,进行样品的米集。
米样时必须特别注意样品的代表性和避免米样时的污染。
首先准备好灭菌容器和采样工具,如灭菌牛皮纸袋或广口瓶,金属勺和刀。
在卫生学调查基础上,采取有代表性的样品。
样品采集后应立即进行检验。
感观检验
取一定量(固态250g、液态250ml)的样品于无色玻璃杯中,采用目测、鼻嗅的方法进行检验。
水分测定
按GB/T6435-2006规定方法测定。
成品粒度测定
按GB/T规定方法测定。
粪肠球菌检测
按附录A(规范性附录)执行。
卫生检测砷含量测定
按GB/T13079-2006规定执行。
铅含量测定
按GB/T13080-2004规定执行。
霉菌检测
按GB/T13092规定执行。
细菌总数
按GB/T13093规定执行。
致病菌检测
按GB/T13091-2001、GB/T和GB/T规定执行。
杂菌率
计算公式:
杂菌率
霉菌数(细菌总数-目的菌数)“C。
/
100%
霉菌数细菌总数
净含量
按JJF1070-2005规定执行。
监测与仲裁判定
检测结果判定的允许误差按GB/T18823-2002规定执行6检验规则
检验分类
产品的检验分为出厂检验和型式检验两类
组批与取样
组批:
同品种、同一生产线、同一天内生产的同一批料为一批取样:
按GB/T14699-2005方法取样,每批产品包装袋数为1-4时,每袋取样;每批产品包装袋数为5-16袋时,最少取4袋;每批产品包装袋数大于16袋时,最少取,2n袋。
每批取样量不少于。
出厂检验
感官指标、水分、粒度、微生物含量(含活菌数和杂菌率)指标为出厂检验项目,产品出厂前必须由公司质检部门检验合格并出具合格证,方可出厂。
型式检验
一般情况下,企业半年进行一次型式检验。
但有下列情况之一时,亦须进行型式检验。
a)产品成批出厂前;
b)原料、配方、生产工艺及设备有重大变化时;
c)产品停产3个月以上需要重新恢复生产时;
d)国家质量监督机构要求进行质量抽查时。
型式检验项目:
第4章所规定的全部项目。
判定规则
在保证产品质量的前提下,生产厂可根据工艺、配方、设备、原料等变化情况,自行确定出厂检验的批量。
检验时如产品已霉烂变质、有明显结块或有致病菌检出,卫生指标不合格,则判定该批产品为不合格产品,不得复检;
活菌指标若低于表2规定值的80涉为不合格项,允许在原样本中加倍取样复检,以复检结果为依据。
若仍有不合格项,则判定该批产品为不合格产品。
7标签、包装、运输、贮存、保质期
7.1标签
采用鲜明的标签贴于外包装,标签内容应符合GB10648的规定要求。
包装
包装为铝箔袋、纸箱包装或纸塑复合袋包装。
包装应符合运输和贮存的要求。
贮运
贮运过程中防雨、防潮、防止日光暴晒。
不得与有毒有害或其它污染物品混装、混运。
贮存
产品应贮存在凉爽、通风、干燥的库房内,或阴凉贮存。
不得与有毒有害或其它污染物品混贮。
保质期
在符合贮存运输的条件下,自生产日期起保质期为12-15个月。
附录A
(规范性附录)
粪肠球菌检测方法
A1范围
生产分析和质量控制部门适用。
A2原理
细菌呈球状、球杆状,常成对或短链状排列,无芽孢,革兰氏染色阳性。
在血平板上菌落呈针尖大小、灰白色、圆形、表面光滑凸起、溶血。
在葡萄糖肉汤中呈均匀混浊生长。
革兰氏阳性,过氧化氢酶呈阴性,能在瘵化钠肉汤、葡萄糖肉汤及45C生长,能分解葡萄糖产酸
不产气,发酵山梨醇,不发酵阿拉伯糖,硝酸盐还原阴性,精氨酸双水解阳性,最适生长温度36C,
最适。
A3试验方法
仪器设备和材料
生物显微镜(10X100)
菌落计数器
恒温培养箱(36±1C)
恒温干燥箱
恒温摇床
灭菌锅
无菌室或超净工作台
\酸度计
'\架盘药物天平:
0-500g,精度至
试管:
①15mnX150mm①18mnX180mm
灭菌培养皿:
直径9cm
三角瓶:
500ml
无菌吸管:
1ml(具有刻度)5ml,10ml(具有刻度)
玻璃刮刀或L型玻璃棒(涂布棒)
灭菌牛皮纸袋或广口瓶,金属勺和剪刀
酒精灯
载玻片
镊子
接种环、接种针
均质器或微型振荡箱
培养基和试剂
除特别注明外,试验中所有试剂为分析纯试剂,水为蒸馏水或相应程度的水,溶液为水溶液。
BPY琼脂培养基(配置方法见附录B1)
血琼脂培养基(配置方法见附录B2)
的肉汤培养基(配置方法见附录B3)
耐盐试验培养基(配置方法见附录B4)
40%胆汁肉汤培养基(配置方法见附录B5)'
糖类发酵培养基(配置方法见附录B6)
硝酸盐培养基(配置方法见附录B7)
索恩利氏培养基(配置方法见附录B8)
革兰氏染色液(配置方法见附录B9)
解囊液(配置方法见附录B10)
孚L酸纸层析法(配置方法见附录B11)
格里斯氏试剂(配置方法见附录B12)
二苯胺试剂(配置方法见附录B13)
A4粪肠球菌菌落数检测
检验程序如下
检样
用无菌水做成几个适当倍数稀释液
选择2-3个适当稀释度各,加入富集培养基平皿
菌落计数
丨报告
操作步骤
采样
采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。
首先准备好灭菌容器和采样工具,如灭菌牛皮
纸袋或广口瓶,金属勺和刀,采取有代表性的样品,样品采集后应尽快检验,否则应将样品放在低温干燥处。
以无菌操作称取经过充分摇匀的待检样10克移入含有90毫升解囊液(按本标准附录B10规定执行)
的灭菌三角瓶内,并于振荡器中恒温振荡培养器中36C,200rpm预处理30分钟,做成1:
10的均匀稀释液,混合均匀。
用无菌吸管吸取1:
10稀释液加到含有无菌水的试管中,并于微型振荡器中8000-10000转/分钟处理2-3
分钟,充分摇匀制成1:
100的稀释液。
用无菌吸管吸取的稀释液加到含有无菌水的试管中,进行10倍梯度稀释,并于微型振荡器上混合3min。
每个稀释度换用一支灭菌吸管,按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10-8。
平板计数法
估计样品的含菌量,选择三个连续稀释度,分别在作10倍稀释的同时,各取分别加到计数培养基平皿,
均匀涂布,各个稀释度作3个平皿,最好同时作2种培养基,同时作无菌水空白对照。
以上操作全过程需在20min内完成。
将平板倒置于36C恒温中培养,培养24小时后观察菌落特征。
选取具有30-300个典型菌落的平板,进行计数。
并计算同一稀释度三个平板的平均菌落数。
根据证实试验确定为粪肠球菌的菌落数,按比例计算出该皿内的粪肠球菌的菌落数,然后乘其稀释倍数
再乘以10,即得每克(或ml)样品所含粪肠球菌数并作出报告。
例:
将检样10-6稀释液涂布于选择富集培养基平板上,生成的可疑菌落数为35个,取5个进行鉴
定,证实为菌粪肠球菌菌的是4个,则1g样品中菌粪肠球菌菌数为(35X4/5)X106X10=X108。
计数后,将可疑菌落、目标菌落分别接种于营养琼脂斜面,与37C培养24小时,进行粪肠球菌鉴定试
验。
A5粪肠球菌的鉴定
在的肉汤培养基上的生长试验
挑取小节中选定菌落的菌苔,接种葡萄糖肉汤()液体培养基,并将未接种的空白作对照,于36C
培养18—24小时,观察生长情况,培养基有混浊物为阳性。
粪肠球菌能够在的肉汤培养基上的生长。
耐盐试验
挑取小节中选定菌落的菌苔,接种耐盐培养基,并将未接种的空白作对照,于35C培养3-7天,
与未接种的对照管对比,观察培养液的混浊情况,记录试验结果。
粪肠球菌能够在%NaCI的培养基上生
长。
耐胆盐试验
挑取小节中选定菌落的菌苔,接种40%旦汁肉汤()液体培养基,置35C培养24-48小时,观察有
无细菌生长。
阳性菌呈颗粒状生长,上液澄清,管底有沉淀;阴性菌则不生长。
粪肠球菌为阳性,可以生长。
葡萄糖产酸和产气试验
挑取小节中选定菌落的菌苔,接种乳酸菌葡萄糖发酵培养基,并将未接种的空白作对照,于36C
培养2-3天,观察记录。
若产酸则培养基变黄色,并可用pH计测定pH值,用纸层析法检查是否为乳
酸。
若产气则德培拉姆氏小试管中有气泡。
粪肠球菌发酵葡萄糖产乳酸不产气,pH可达,发酵山梨醇,
不发酵阿拉伯糖。
硝酸盐还原试验
挑取小节中选定菌落的菌苔,种硝酸盐培养基,并将未接种的空白作对照,于35C培养3天,在
干净的比色瓷盘小窝中倒入少许已接种培养的培养液,再滴一滴格里斯氏试剂的A液及B液。
在对照中
同样加入格里斯氏试剂的A液及B液各一滴。
观察并记录溶液是否变色,若变红色则为阳性,若无红色出现,再加入一滴二苯胺试剂,如溶液变为蓝色则为阴性,不变蓝色,则为阳性。
粪肠球菌为硝酸盐还原阴性。
精氨酸双水解酶测定试验
挑取小节中选定菌落的菌苔,穿刺接种索恩利氏培养基,并用灭菌的凡士林油封管,并将未接种的
空白作对照,于35C培养3、7、14日观察,培养基转为红色者为阳性,不变者为阴性。
粪肠球菌的精氨酸双水解酶测定试验呈阳性。
结果解释及报告
符合粪肠球菌群的特征,有较强的耐盐性、耐胆碱性、能在的培养基上很好的生长、葡萄糖发酵产酸不产气、发酵山梨醇、不发酵阿拉伯糖、硝酸盐还原阴性、精氨酸双水解酶测定试验呈阳性,则可报告为粪肠球菌。
对偶尔遇到的一些少数可疑菌株,可以根据需要进行其他试验。
附录B
B1BPY琼脂培养基
葡萄糖
酵母膏
氯化钠大豆蛋白胨牛肉膏
碳酸钙
蒸馏水
专用培养基和试剂
5g
5g
5g
10g
5g
1000mL
按以上配方配制培养基,溶解后用40%的氢氧化钠溶液调
pH为,高温蒸汽灭菌锅
121C,20min灭
(规范性附录)
菌。
B2
血琼脂培养基
蛋白胨
10g
葡萄糖
2g
氯化钠
5g
磷酸二氢钾
柠檬酸钠
5g
脑浸汁
800ml
猪心浸汁
200ml
羊血
10%
pH
注:
猪心和猪脑浸汁法:
(1)新鲜猪心除去心头和脂肪,搅碎100克加蒸馏水至1000ml;
(2)新鲜猪脑除去血管,取200g加蒸馏水至1000ml;
(3)50C保温1小时,然后煮开15min;
(4)冷却后用纱布过滤备用。
B3的肉汤培养基
的肉汤100ml
葡萄糖2g/L
15min,备用。
注:
将普通肉汤调整,加入葡萄糖溶解后,分装试管,每管2〜3ml,121C灭菌
B4耐盐培养基
蛋白胨10g
牛肉膏3g
氯化钠65g
蒸馏水1000ml
将上述成分溶解后,调节,分装试管,高压灭菌121C15min〜20min,冷至45C,备用
B540%胆汁肉汤培养基
蛋白胨10g
氯化钠5g
牛肉浸膏5g
/新鲜胆汁(猪、牛)400ml'\
蒸馏水600ml
每管3ml,
115C灭菌
先将蛋白胨、牛肉膏、氯化钠加热溶于蒸馏水中,调pH至,加入胆汁混匀后,分装试管,
置115C灭菌20min,冷藏备用。
取新鲜猪(牛)胆若干只,取胆汁用纱布过滤,装于瓶中
20min,冷却后置4C冰箱内,次日取出吸取上清液备用。
B6糖类发酵培养基
基础培养基
蛋白胨
1%
酵母膏
%
吐温80
%
(v/v)
\盐溶液A
%
(v/v)
盐溶液B
%
(v/v)
溴甲酚紫(
%水溶液)
约
盐溶液A:
KH2PQ
10g
K
2HPO
10g
蒸馏水100ml
盐溶液B:
MgSO4•7fO
MnSO4•2H2O
FeSO4•7H2O
蒸馏水100ml
以上成分溶解后调pH到,分装试管。
121C高压灭菌20-30min。
葡萄糖、阿拉伯糖、山梨醇各10g
将山梨醇和阿拉伯糖配制成10%勺水溶液,经过滤灭菌后用无菌操作加到无菌基础培养基中。
B7硝酸盐培养基
牛肉蛋白胨培养基1000ml
KNO31g
培养基配制好后,调节,分装试管,每管4-5ml,121C蒸汽灭菌15-20min,冷至45C,备用。
B8索恩利氏培养基
蛋白胨1g
NaCl5g
K2HPO
洋菜6g
酚红
L-精氨酸盐10g
蒸馏水1000ml
将以上成分加热溶解,调节,分装试管,每管4-5ml,121C蒸汽灭菌15-20min,冷至45C,备用。
B9革兰氏染色法
结晶紫染色液
结晶紫1g
95%乙醇20ml
1%草酸铵水溶液80ml
将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
革兰氏碘液
碘
碘化钾
蒸馏水
将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振荡,待完全溶解后,再加蒸馏水至300ml.
沙黄复染液
沙黄
95%乙醇
蒸馏水
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
染色
将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗。
滴加革兰氏碘液,作用1min水洗。
滴加95%乙醇脱色约15-30S,或将乙醇滴满整个涂片,立即倒去,再用乙醇滴满整个涂片,脱色10min.
水洗,滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。
结果
革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
B10解囊液
柠檬酸,磷酸氢二钠加蒸馏水至1000ml,调节pH至,分装,12「C,15min灭菌,备用。
B11乳酸纸层析法
展开剂:
水、乙醇、正丁醇以1:
5:
5的量相混合,然后加1%的甲酸。
显色剂:
%的溴酚蓝酒精溶液,用%的NaOH调pH到。
1mol/L乳酸标准溶液:
吸取分析纯乳酸,移入100ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,备用。
L孚L酸标准使用液:
将1mol/L孚L酸标准溶液稀释至L。
点样
选择大小合适的国产新华滤纸,在滤纸下方距边约3cm处划条横线,每隔划一点作为点样位置,并
表明点样编号。
用干净的毛细管沾取样品点样,每点一次样品用吹风机吹干,L乳酸标准使用液为对照。
层析
将点好样的滤纸放入层析缸,先用展开剂饱和一夜,然后加展开剂开始层析。
上行25cm左右取出
晾干,喷显色剂,并与对照比较黄色斑点的位置,确定是否是乳酸。
B12格里斯氏试剂
A液:
将对氨基苯磺酸,溶解于L乙酸溶液100ml;
B液:
将甲萘胺溶解于L乙酸溶液100ml中。
B13二苯胺试剂
将二苯胺溶于100ml浓硫酸中,用20ml蒸馏水稀释。
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- 饲料添加剂 球菌 质量 内控 标准 提供 版本