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猪胚胎体外培育影响因素的研究
猪胚胎体外培育影响因素的研究综述
摘要:
本研究以孤雌激活胚胎为研究对象,对猪胚胎体外培育进程中的相关影响因素进行了探讨。
体外成熟的猪卵母细胞经孤雌激活后,用添加.05%BSA的NCSU一23培育的囊胚率%)极显著高于添加5%,10%和15%FCS的NCSU一23%,%和%,P<。
在NCSU一23中添加必然比例的TCM一199(10%,25%和50%),虽然对猪卯母细胞孤雌激活后的割裂率无显著影响%%,%和%,P>,但囊胚发育率随着TCM199比例的增加而显著下降%%,%和%,P<。
将NCSU23中的亚牛磺酸浓度从原来的5mmo比降低到.25,或.05mmol几时,对猪卵母细胞激活后的割裂率和囊胚发育率均无显著影响(介.005),但完全去掉亚牛磺酸则致使囊胚发育率极显著下降%)。
在猪卵母细胞激活后的0币oh添加.034mmol几丙酮酸钠和.54mmol几乳酸钠,显著提高卵母细胞的割裂率%%,P<,但60h后在培育液中添加丙酮酸钠和乳酸钠则极显著降低其囊胚发育率,.63,.33%%,<。
从胚胎培育开始就添加葡萄糖可提高胚胎的囊胚发育率%%,P<。
在NCSU一23中添加12mmoUL的山梨醉,孤雌激活胚胎的囊胚发育率有所提高%%),但不同不显著(产司.1875)。
以上结果表明:
(1)BSA的猪胚胎体外培育效果优于FCS;
(2)猪胚胎的体外培育不需要成份复杂的培育液;(3)亚牛磺酸是猪胚胎培育液必不可少的重要成份,但其浓度可下调到现行的1/10;(4)乳酸盐和丙酮酸盐对猪胚胎的初期发育有增进作用,但无益于后期发育;葡萄糖对猪胚胎的整个培育发育进程均有增进作用。
(5)山梨醇对猪胚胎的体外发育可能具有增进作用,但其效果有待进一步验证。
关键词:
猪胚胎;体外培育;割裂率;囊胚率
1前言
人们致力于猪胚胎体外生产的研究至少超过了30年且在不断的进展与进步中[1-3]。
长期以来,大量的研究试图通过改善培育系统来提高体外胚胎生产
效率,尽力提高整个生产系统各个环节的技术水平[2,4-5],但是进展不大,目前猪体外成熟(IVM)/体外受精(IVF)/体外培育(IVC)的整体效率仍然较低。
卵子的体外成熟和胚胎培育是这一技术的重要环节,提高这些环节的技术水平对提高整个体外生产体系的效率尤其重要。
因此,本研究拟以猪孤雌激活胚胎为研究对象,着重探讨猪胚胎体外培育进程的相关影响因素,以便成立一套有效的猪胚胎体外培育系统。
2材料与方式
2.1试剂及药品
TCM-199,Gibco公司生产;犊牛血清(FCS),Hyclone公司生产;人绒毛膜促性腺激素(hCG),宁波激素制品厂生产。
除特别注明外,其他所有无机盐和生物化学试剂均为Sigma公司生产。
卵巢保留及运输液:
含有K+、Ca2+、Mg2+的生理盐水。
洗卵液:
TCM-199+2%发情牛血清(OCS)。
成熟液:
NCSU-23基础液+10%卵泡液(PPF)+半胱胺酸+激素。
胚胎培育液:
NCSU-23基础液+0.5%牛血清白蛋白(BSA)。
以上配制的所有试剂均用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤消毒。
2.2卵母细胞的收集与成熟培育
从屠宰场搜集青年母猪卵巢,将其置于含有30~35℃生理盐水的保温瓶内,在短时刻内送回实验室;然后用10mL注射器和12号针头穿刺抽吸卵巢上面3~8mm卵泡内的卵母细胞,在体视显微镜下挑选出具有完整卵丘细胞层或部份致密卵丘细胞的卵母细胞,用洗卵液清洗2次,放入已装有1.5mL含有激素(10U/mLhCG,0.1μg/mLFSH)的成熟培育液(无血清的NCSU-23基础液+10%PFF+10ng/mLEGF+0.1mg/mL半胱胺酸)的玻璃培育皿(每皿200~300枚)中,在38.5℃、5%CO二、饱和湿度的培育箱中体外成熟培育20~22h,然后转移到不含激素的成熟液中再培育22~24h。
血清的制备
用无菌针头和离心管在发情当天的母牛颈静脉处采血,静置30min;在4℃冰箱中放置24h左右,待血清全数析出后,以3500r/min离心10min;吸取血清,再以同一转速离心10min;弃去沉淀,将血清在56℃水浴中灭活30min;最后将灭活的血清过滤消毒,分装,-20℃保留(使历时掏出解冻)。
卵泡液的制备
从卵巢表面3~8mm的卵泡中抽取卵泡液搜集于离心管中,3500r/min离心10min;弃去沉淀,直接用0.22μm的滤器过滤灭菌,然后小剂量分装,于-20℃保留,备用。
卵母细胞的激活处置
猪卵母细胞成熟培育42~46h后,用吸管反复抽打去掉周围的卵丘细胞,然后在含有5μmol/L离子霉素(ionomycin)的培育液中处置5min(38.5℃),随即用胚胎培育液洗2次,移入含有2mmol/L6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)的培育液中培育3~4h(38.5℃)。
卵母细胞体外培育(IVC)及初期胚胎发育潜力的评定
将经人工激活处置后的卵母细胞置于50μL的培育液微滴中培育48h,检查裂情形,中间不换液,第6~8天检查囊胚发育情形。
实验设计
实验一:
蛋白添加物对猪胚胎体外培育的影响
本实验旨在比较牛血清白蛋白和不同浓度的胎牛血清的猪胚胎体外培育效果。
实验分为4组:
(l)NCSU一23+%BSA;
(2)NCSU一23+5%FCS;
(3)NCSU一23+10%FCS;
(4)NCSU一23十15%FCS。
经激活处置的猪体外成熟卵母细胞随机分派到遍地置组进行胚胎的体外培育。
各组结果以4h8的割裂率和6一sd的囊胚发育率来评定。
实验二:
NCSU一23中添加TCM一199对猪胚胎体外培育的影响本实验旨在探讨两种不同的培育液按不同比例混合后对培育效果的影响。
将NCSU一23和TCM一199这两种培育液别离各自配制完成后,依照设定的体积比,在平衡前混合均匀,平衡后将猪卵母细胞激活进行培育。
实验分为四组,体积比别离为:
(1)NCSU一23培育液占100%,TCM一199培育液占0%:
(2)NCSU一23培育液占90%,TCM一199培育液占10%;
(3)NCSU一23培育液占75%,TCM一199培育液占25%;
(4)NCSU一23培育液占50%,TCM一199培育液占50%。
经激活处置的猪体外成熟卵母细胞随机分派到遍地置组进行胚胎的体外培育,实验各组别离按前述的方式进行胚胎发育能力评定。
实验三:
亚牛磺酸对猪胚胎体外培育效果的影响
本实验旨在探讨亚牛磺酸浓度对猪胚胎体外培育效果的影响。
按照培育液中亚牛磺酸的浓度实验分为5组(O,.05,,.25和几)。
经激活处置的猪体外成熟卵母细胞随机分派到遍地置组进行胚胎的体外培育,实验各组别离按前述的方式进行胚胎发育能力评定。
实验四:
能量底物对猪胚胎体外发育的影响
本实验的目的是探讨能量底物对猪胚胎体外发育的影响。
实验按照葡萄糖,丙酮酸钠和乳酸钠在胚胎培育中的添加时刻(O一60h和60h以后)随机分为7组(见表2一2)。
经激活处置的猪体外成熟卵母细胞随机分派到遍地置组进行胚胎的体外培育。
为了确保一致性,A、B、C、D四组在60h时也换原液一次。
各组卵母细胞经成熟后别离按前述的方式进行激活及胚胎发育能力评定。
实验五:
山梨醇对猪胚胎体外培育的影响
本实验旨在探讨山梨醇对猪胚胎体外培育的影响。
用改良的NCSU一23培育液(亚牛磺酸的浓度为.05~oIL/)为基础液,然后别离添加不同浓度的山梨醇(O,3,6,12,18~olL/)使实验分为5组。
经激活处置的猪体外成熟卵母细胞随机分派到遍地置组进行胚胎的体外培育。
实验各组别离按前述的方式进行胚胎发育能力评定。
数据的统计分析
所得数据均用卡方查验进行统计分析,肯定不同的显著性。
3分析与讨论
蛋白质添加物对猪胚胎体外培育的影响
己经表明,在培育液中添加蛋白质有利于胚胎的体外发育(carolnaetal,1995)。
血清和血清白蛋白通常被作为蛋白质来源添加到培育液顶用于支持哺乳动物胚胎的体外发育。
有人以为,血清中的某些成份能够缓和一些可能对胚胎发育有害因子的作用(Mauer,r1992;Bvaiste,r1995)。
血清白蛋白与血清相较,潜在的有害副作用可能更小(Bvaiste,r1995)。
血清白蛋白中不但含有各类低亲和力的物质成份,如类固醇、维生素、脂肪酸和胆固醇等,同时包括有各类离子和大分子物质(Maure,1992)。
固然,血清中所含有的某些物质一样能够引发胚胎培育条件和环境的恶化和加重某些不利因素的影响(Baviste,r1995)。
血清对胚胎体外培育具有双重影响(pinyopmunrintrandBaviste,r1991:
Pinyopint:
·nadBaviste,r1994;Baviste,r1995)。
一方面,干与胚胎卵裂球的分化无益于胚胎的初期发育但能增进细胞的增殖增加囊胚细胞的数量和囊胚的孵化(pinyopmunrintrnadBvaiste,r1991;PinyopununinrtnadBaviste,r1994;Thompsonetal,1992;Rorieetal,1994:
Limetal,1994)。
利用血清在胚胎后期的作用,能够修改培育液培育方式。
他们的做法就是在胚胎期培育时每距离48小时依次从10、15到20%血清浓度递增(Baviste,r1995)。
pinyopununinrt和Bvaister(1994,1996)进一步深化研究,成立了一种二步培育法来进行牛体外受精胚胎的生产,他在受精后72小时后才添加血清到培育液中。
这种慢慢添加血清法和二步培育法已经被一些实验室用于进行牛体外胚胎生产(Zhnagetal,1992;Bvaiste,r1995)。
本研究比较T胎牛血清浓度(五、10和巧%)和猪胚胎的体外培育效果,结果发觉,在培育液中添加牛血清白蛋白和不同浓度的胎牛血清其培育效果明显不同。
在割裂期,含.05%BSA和15%FCS组割裂率较高%和%),比5%、10%组的割裂率都高%和%)。
单从割裂看,FCS的浓度增加可能会提高卵子割裂率,但在后期培育中与10%FCS培育液比较囊胚率明显下降。
FCS在三个浓度梯度中,以10%FCS添加于培育液中较为适合。
可是,与添加BSA的培育液比较,效果却不如添加.05%BSA的培育液。
已有报导(PinyPou~inirnadBvaist,er1991)表明,血清能够明显抑制体外受精后卵子的割裂,而且在2细胞到桑堪胚期没有明显的增进发育的作用。
在牛的胚胎体外培育研究中(Whngetal,1997),在培育液中添加FCS比添加BSA更能增进囊胚的孵化,但从桑堪胚发育到囊胚时段,添加BSA比FBS效果更明显。
本研究结果也表明,在猪胚胎培育时,在培育液中添加.05%的BSA比添加FCS更能增进胚胎的体外发育。
添加不同比例TCM一199对猪胚胎体外培育效果的影响
长期以来,人们都在致力于如何提高胚胎体外培育效率的研究。
培育环境与体系对培育的效率关联专门大。
目前,多种培育体系用于猪胚胎的体外培育。
目前有NCSU一23培育液(NorthCmalinaStateUniversity一23NCSU一23)和BECM一3(BeltsvilleEmb叮。
CutiureMdeuim一3),二者均能成功的用于猪胚胎的体外生产,其中NCSU一23是公认猪胚胎体外培育较好的培育液。
在NCSU一23液中发育的猪胚胎卵裂球的皮质、连接处、核周围都存在肌动蛋白微丝,但在TCM一199液中发育的猪胚胎卵裂球的核周围则无肌动蛋白微丝(Wangetal,2000b)。
TcM一199含有丰硕的氨基酸、维生素等物质,多用于牛羊等大家畜动物的胚胎培育。
本研究试图添加必然比例的TCM一199(10%,25%和50%)到NCSU一23培育液中来提高猪胚胎的体外培育效果,但结果与预期的相反,囊胚发育率随着TCM一199比例的增加而明显下降。
猪胚胎可能与牛、羊等动物的胚胎不一样,成份简单的培育液可能更有利于其体外发育。
这可能与猪囊胚形成所需的细胞数较少有关。
亚牛磺酸对胚胎体外培育的效果的影响
母畜生殖道内的氧气压比标准体外环境低约三分一。
胚胎在体外培育进程中,高氧气压(20%)比低氧气压(5%)产生更多的自由基(erferdaieals)(FowlernadCallinghma,1978)。
很明显,活性氧化基团(eractiveo即genspeeies,Ros)在体内的产生和消除的平衡对卵子的受精和胚胎的发育能力相当重要。
研究表明,胚胎体外培育时暴露于氧化压下时,胚胎本身的防御机制不能够完全有效的保护本身精细的细胞结构不受侵害。
在胚胎体外的培育进程中,会受到氧自由基的损害,这己经在多种动物中取得证明。
有报导表明,活性氧化基团会造成线粒体的功能紊乱,使DNA,RNA和蛋白质受到损害(Comporti,1989)。
为避免胚胎在体外培育进程中因氧化压所受的损害,必需在培育液中添加各类抗氧化剂。
例如,为了调节胞外的ROS水平,可在培育液中添加抗氧化酶物质如超氧化物岐化酶(supeorxidedismutase,soD)和过氧化氢酶(catalase)。
超氧化物岐化酶能促使过氧化离子(护‘)转化为H20:
然后被过氧化氢酶和谷肮甘肤过氧化物酶清除。
有研究报导,在小鼠的体内和体外胚胎发育进程中,添加SOD能保护胚胎不受氧浓度因素的影响(Nnogokaietal,1992)。
在无蛋白添加物的培育液中添加SOn能提高兔胚胎发育到囊胚的比率(Lim,Liouetal,1996)。
亚牛磺酸和牛磺酸常添加于培育液中进行WF和WC,与SOD、半肤氨酸、肤氨酸等成份一路,提高GSH(glutathinoe,谷耽甘肤)水平,保护胚胎不受外环境因素的损害。
曾申明曾用NCSU一23、SOF等培育液对猪胚胎体外培育进行比较研究,NCSU一23培育液效果较其它的好,以为其原因就是NCSU一23培育液中含有的牛磺酸和亚牛磺酸有利于猪胚胎发育。
Lnog等给BECM一7添加了牛磺酸和亚牛磺酸(即BECM一7)后,虽不能提高囊胚率,但胚胎细胞数有所提高(Longetal,1999:
Dobrinskyetal,1996)。
改良的KSOM中添加牛磺酸对牛的初期胚胎发育有利(LiunadFoote,1995)。
Petters和Reed以为牛磺酸或亚牛磺酸能显著提高猪胚胎发育能力(PettersnadRede,1991)。
Elhassna等(2001)发觉牛输卵管液和子宫液中牛磺酸等几种氨基酸含量很高,以为它们在胚胎发育中可能起重要作用(Elhassnaetal,2001)。
但是,由于亚牛磺酸超级昂贵,这无凝会增加猪胚胎体外培育的本钱。
为此,本研究对NCSU一23中亚牛磺酸的浓度进行了进一步实验,结果发觉,将NCSU一23中的亚牛磺酸浓度降低到原
来的1/10~olL/)对猪胚胎的囊胚发育率没有显著影响,但完全去掉亚牛磺酸则使胚胎的囊胚发育率显著下降。
由此表明,亚牛磺酸是猪胚胎培育液中必不可少的重要成份,但浓度可降低到目前通常所用的1/10几)。
能量底物对猪胚胎体外发育的影响
胚胎体外发育需要能量物质支持,早在40年前便得以证明,并提出乳酸盐在小鼠初期胚胎发育中是超级重要的(Brinset:
etal,1%5)。
丙酮酸盐一样被证明是小鼠初期胚胎体外发育的重要能源物质(Brinsetretal,1965)。
在许多种属的胚胎体外发育中添加葡萄糖、乳酸盐、丙酮酸盐对于成功地培育到囊胚是必要的,这一点已取得普遍的认同。
在培育液中添加乳酸盐和丙酮酸盐将猪体内胚胎培育发育到囊胚期己有报导,一样,添加葡萄糖将体内胚胎培育到囊胚也见有报导(wright,1977;Peettrseta,l1990)。
不同于其它哺乳动物,猪胚胎在整个体外培育进程中均能用葡萄糖作为能源物质。
在初期割裂时便进行葡萄糖代谢和利用(swainetal,2002),直至囊胚时一直需要葡萄糖。
可是近来有报导表明,在培育液中添加葡萄糖反而会阻碍了胚胎的发育(swainetal,2002)。
IvMzlvF胚胎先用含乳酸盐和丙酮酸盐的培育液培育,然后换用含葡萄糖的培育液进行培育,能够增进胚胎的发育并生产出高质量的胚胎,最终能产出正常的后代(Kikuehietal,2002)。
猪体外受精和激活后胚胎的发育能力和囊胚的质量明显受到葡萄糖添加时刻的影响(Mdevedveetal,2004)。
在培育5h8后添加葡萄糖能够更好的增进体外受精或激活后的胚胎发育到质量好的囊胚。
可是在46h后添加却不如58h添加的效果好,囊胚率只有一半,同时伴有较多的畸形胚和死胚(Medvedveetal,2004)。
为进一步提高猪胚胎的体外培育效果,本研究将猪的胚胎培育分为两个阶段(0一60h和60h以后),在不同的培育阶段添加不同能量底物。
结果发觉,乳酸钠和丙酮酸钠在0一60h添加对猪胚胎的初期割裂具有必然增进作用,但在60h以后添加则明显降低胚胎的囊胚发育率,这与Kikuchi等(2002)的研究结果一致。
但是,延期添加葡萄糖不但不能提高胚胎培育效果,反而降低胚胎的囊胚发育率,与Mdevedev等(2004)的研究结果相反。
这可能是实验条件不同所致,因本研究所用NCSU一23培育液的亚牛磺酸的浓度仅有Medvedev等(2004)所用的l/10。
山梨醉对猪胚胎体外发育的影响
成功用于猪胚胎培育的另外一种培育液是NCSU一37,其成份与NCSU一23的主要不同用山梨醇代替亚牛磺酸。
Lnog等(1998)的报导表明,培育液中添加山梨醇后,猪卵母细胞一样能够发育成熟并能受精,而且单精受精的效果也比较理想。
而最近几年来的报导表明,利用NCSU一37进行猪胚胎体外培育至囊胚后移植给受体,能取得更高的孕率和更多的子畜诞生(心kuehiKetal,2002)。
Poreh敏a等(2004)将体内取得的二倍体和四倍体猪胚胎用NCSU一37进行培育,评估其发育能力。
其结果也显示,NCSU一37适宜用于移植前的猪胚胎体外培育。
因此,山梨醇可能对猪胚胎的体外发育具有必然增进作用。
可是一直以来,没有人对山梨醇的作用机理和对胚胎培育的影响进行过深切的研究。
为此,本研究用改良的NCSU一23为基础液,对不同浓度(0,3,6,12,18~ofL/)山梨醇猪胚胎培育效果进行了实验,结果发觉,猪胚胎的囊胚发育率均有不同程度提高,其中添加12~ol几山梨醇组的囊胚发育率达到%,说明其对提高猪胚胎囊胚率有必然作用。
但是,在NCSU一37中是将亚牛磺酸置换为山梨醇,本实验是在原来NCSU一23的基础上添加了山梨醇,培育液中含有~ol几的亚牛磺酸,这二者的是不是存在协同或拮抗作用从而影响了单独的作用,需要进行更进一步的研
究。
同时由于实验数据较小,与对照组相较还未达到显著性水平,如进一步扩大实验,则有可能确证其作用。
4结论
BSA的猪胚胎体外培育效果优于FCS。
在NCSU一23中添加TCM一199影响猪胚胎的体外培育效果,猪胚胎的体外培育不需要成份复杂的培育液。
亚牛磺酸是猪胚胎培育液必不可少的重要成份,但其浓度可下调到现行的1/10,以节约胚胎培育本钱。
乳酸盐和丙酮酸盐对猪胚胎的初期发育有增进作用,但无益于后期发育;葡萄糖对猪胚胎的整个培育发育进程均有增进作用。
山梨醇对猪胚胎的体外发育可能具有增进作用,但其效果有待进一步确证。
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