布鲁克液质联用操作规程.docx
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布鲁克液质联用操作规程
布鲁克液质联用仪操作规程
1操作前检查
1.1检查液氮罐和高纯氮的出口压力,保证在正常范围
1.2检查洗针溶液和流动相
1.3流动相须现配并超声,缓冲盐溶液过0.22μm微孔滤膜(或者使用色谱纯的盐溶液和酸溶液)
1.4如使用溶融石英进样管,操作前应检查石英管是否拉长,确保其未超出ESI探针尖端。
1.5检查系统真空度,电离真空计读数(分析仪区域)应小于5×10-6Torr。
1.6检查废液液位,及时清空废液。
1.7检查液氮罐和氦气钢瓶是否有一定压力,以便为测试样品提供符合流速和压力要求的氮气(喷雾气体和干燥气体)和氦气(碰撞气体)。
2操作步骤及注意事项
1.检查并打开干燥气(Drygas)和雾化气(NebulizerGas)所需的氮气源;
1)如配备液氮罐,则需打开增压阀及供气阀阀门,使罐体压力保持在100psi以上,并调节减压阀出气口压力至0.6Mpa;
2)如配备氮气发生器,则提前半小时打开氮气发生器电源,以便使氮气能够达到99.99%以上的纯度,再调节氮气流量至20L/min;
2.检查并打开碰撞气(CollisionGas)高纯氮气N2或高纯氩气Ar钢瓶(纯度要求99.999%),并调节减压阀出气口压力至0.4Mpa;
3.检查机械泵泵油的水平线,需在小窗口的1/2~2/3之间;
4.打开计算机,显示器电源;
5.打开质谱仪主机电源(仪器左侧最下方);
6.启动micrOTOFcontrol控制软件,务必保持仪器一直处在shutdown状态,待真空度达到≤1×10e-6mbar后,才可切换至standby状态待机;为了保证良好稳定的实验结果,待真空度下降至10e-7mbar以下后,再operate仪器开始测试。
2.2新建液相方法
打开hystar软件,选择method,然后输入新建方法的名字,点击open,开始方法的新建。
在弹出的对话框中选择edit,然后点击“wizard”进行设置。
液相方法包括梯度、流速、柱温、样品盘温度、时间、进样针吸样速度等,可依次设置即可,全部设置好之后,将。
2.3新建质谱方法
方法一:
在otofcontrol中,打开method,按照自己待检测物的分子量范围及正负偏向性选择合适的质谱方法,小分子有对应的smallmolecular方法,蛋白质组有专门的proteomics方法。
方法二(非专业人员不推荐):
在otofcontrol中,打开method,选择new,即可新建质谱方法。
可以修改的参数包括以下几个方面:
(1)mode中的Focus为active,linespectracalculation为usesumintensity,ionpolarity为pos或neg,massrange调到待检测物合适的分子量范围。
(2)source中capillarypos:
4500V,neg:
3500。
Divertvalve:
source1-2进质谱;source1-6为discardtofluid
(3)Tune中collisionRF小分子调到1000-1500,大分子调到2000-2500;lowmass视目标物分子量大小截留(例如目标分子为500,可调为300,去掉小分子区域的杂峰)。
(4)MS/MS中如果想检测二级,可以勾选autoMS/MS;precursorions中cycletime正常下为3s
(5)chromatogram中选择BPC
根据待检测物的分子量大小和正负偏向性,先在软件自带的质谱方法中选择相应的方法,再在此方法的基础上进行优化及分段(如含盐的样品截掉前2-5分钟,1-6waste)。
仪器在操作状态下
2.4仪器质量准确度校正
2.2.1.药物和酶解多肽样品,选用甲酸钠溶液作为校正标准液。
覆盖质量范围m/z90-1200;校正模式选用
2.2.2.蛋白质类样品选用三氟乙酸钠溶液作为校正标准液。
覆盖质量范围m/z200-2000;校正模式选用
2.2.3.校正液配制
甲酸钠校正液:
溶剂:
异丙醇:
水溶液=1:
1并含有0.2%甲酸
10mM甲酸钠校正液:
1ml1MNaOH+99ml溶剂
三氟乙酸钠校正液:
溶剂:
50%乙氰含有0.1%三氟乙酸钠(TFA)
2.2.3.
3.测样方式
3.1直接进样测定
对于标准品或相对较纯或混合组分较少并且不含盐的药物样品,如果仅需要进行鉴定,可以采用直接进样方法测定。
3.1.1样品用标准溶剂(50%H2O,50%乙腈或甲醇,0.1%甲酸)溶解或稀释
3.1.2将配好的样品或标准品吸入进样器(针),将进样器(针)放置于进样泵中。
注意:
进样器(针)内不能有气泡
3.1.3将进样器(针)直接与离子源连接(如图)
注意毛细管与注射器之间需紧密连接。
进样器内不能有气泡
3.1.4设置进样泵的流速为120~180微升/小时。
3.2液质联用(LC/MS)测定样品
采用常规液相色谱系统(色谱柱2.1x150mm;流速200-300uL/min)。
启动Hystar软件,打开hystar软件,在sampletable中选择相应的文件并打开,然后复制一个之前做过的样品,对复制后的新的一行进行文件名,存储路径和液相质谱方法的修改(改完之后再检查一遍)。
注:
如果是新建sampletable,可以打开一个新的复制一行粘贴到新建里,因为新建的自动进样的不对。
4.输入下列参考参数
4.1.直接进样:
(低流速)大约在120-180微升/小时
离子源:
Nebulizer0.4bar
DryGas4.0L/min
DryTemp180℃
4.2.药物小分子样品液质联用:
平均流速大约在200-300uL/min
离子源:
Nebulizer0.8bar
DryGas6-8L/min
DryTemp180℃
4.3.酶解多肽样品液质联用:
平均流速大约在200-300nL/min
离子源:
DryGas3.0L/min
DryTemp160℃
5.手动获得一个MS/MS图谱
打开MS/MS界面,选择MRM->输入
6.后期处理
6.1打开分析文件
6.1.1.在任务栏中或者在工具栏中选择按钮均可切换到数据分析程序(DataAnalysis),读取所获得的数据文件
6.1.2.读取数据文件被可选择File菜单下的open对话框,所需要的显示窗口将被程序自动打开。
6.1.3.在文件对话框中选择目录d:
\data\start用鼠标键双击test0000.d,test0001.d,test0002.d来打开数据文件;按住shift键来标记所有文件并点击回车键来一次全部打开所选文件。
6.1.4.质谱图与色谱图按文件名读取并显示在File菜单下。
在分析清单窗口下选择所需的文件,选择后图谱在各自的窗口下显示。
6.2质谱图
6.2.1.在分析清单窗口下选择的结果在质谱图窗口显示。
6.2.2.通过Masslist参数对话框改变离子检测参数
6.2.3.下列对话框被用来在图谱中设置新的离子检测参数
6.2.4.对下一步的Method参数设置参见BrukeDaltonicsDataAnalysisReferenceManual
6.3色谱数据
6.3.1.完整色谱图
1.读取数据文件(e.g.test0001.d),显示TIC(TotalIonChromatogram)
2.读取某一个离子的色谱数据可以打开EditChromatogramTraces对话框
3.通过Edit菜单下选择Chromatogram选项来打开Traces对话框
如下图所示,选择质荷比为622的离子。
6.3.2.获得各组分的质谱图(Compoundspectra)
使用Find–>Compound功能键,快速有效的产生各组分的质谱图;
1)功能键
谱图。
打开CompoundSpectra窗口时,可以看到各组分的质谱图。
2)功能键
3)
7.报告
有几种可用的报告形式来输出数据,一种报告仅有质谱图,另一种报告则只有色
谱图,还有一种两种图谱都保留。
7.1.直接打印:
打印键;或者打开File菜单,选择Print;或者通过打印
预览打印,选择打印预览键或在File菜单选择PrintPreview,然后在打印预
览窗口下选择打印键
7.1.1报告内容下拉菜单包含了所有可选的报告内容
7.1.2.获得参数报告
选择此内容的报告中包含了获得所选分析结果的参数
7.1.3.显示报告
选择此内容将完全按照显示窗口打印(包括色谱窗口、质谱显示窗口、混合
物质谱窗口、质谱窗口)
7.2质谱图
报告内容中几种可选的质谱图形式
7.2.1.质谱清单报告
报告中含所选的质谱图的peak清单
7.2.2.质谱图报告
报告中含所选的质谱图报告
7.3色谱图
报告内容中几种可选的色谱图形式
7.3.1色谱清单报告
报告中含所选的色谱图的色谱峰清单
7.3.2色谱图报告
报告中含所选质谱图的报告
7.3.3混合质谱图报告
报告中含所选色谱图的混合质谱报告
DataAnalysis软件使用
峰面积积分
化合物搜索鉴定
smartformulamanually
selectthemolecularthatyouwanted
findthechemicalformulathatyouwantedandrightclickthensendittocompoundcrawler
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