分支肽段的理论图谱产生算法研究.docx
- 文档编号:9194271
- 上传时间:2023-05-17
- 格式:DOCX
- 页数:29
- 大小:454.77KB
分支肽段的理论图谱产生算法研究.docx
《分支肽段的理论图谱产生算法研究.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《分支肽段的理论图谱产生算法研究.docx(29页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
分支肽段的理论图谱产生算法研究
课题名称:
分支肽段的理论图谱产生算法研究
目 录
摘要…………………………………………………………………………ⅰ
ABSTRACT……………………………………………………………………ⅱ
第1章前言…………………………………………………………………1
1.1节标题………………………………………………………………X
1.1.1小节标题……………………………………………………X
(依此类推)
结论……………………………………………………………………………X
致谢……………………………………………………………………………X
参考文献………………………………………………………………………X
附录……………………………………………………………………………X
摘 要
大规模的蛋白质结构和相互作用是蛋白质组学研究的重要内容。
化学交联质谱法是近十几年来发展起来的用于鉴定蛋白质空间结构和相互作用的新兴方法。
它通过化学交联剂固定空间上相邻的氨基酸,经过串联质谱产生图谱之后,通过与理论图谱进行对比,获得交联位点以及空间距离等信息从而反解出蛋白质结构或确定出蛋白质相互作用。
该方法相比于传统的核磁共振、X射线晶体衍射技术等在蛋白质结构的鉴定中有很多的优势。
交联质谱中由于交联剂的引入,蛋白质酶切之后获得的肽段将不再是简单的直链肽段,会出现分支肽段。
这在离子碎裂中将会产生更复杂的碎片离子信息,利用传统的搜库软件将无法进行有效的鉴定。
通过改写搜库算法中理论图谱产生方法可以直接解决交联肽段鉴定中存在的问题。
本文分析了各种交联产生分支肽段的基本形态和碎裂规律,定义分支肽段结构的表示方法,并在此基础开发了一个统一的肽段理论图谱产生算法。
在典型的数据集上测试图谱产生算法,并对结果进行了相应的分析。
关键词:
蛋白质组学;分支肽段;理论图谱产生;交联质谱
ABSTRACT
Abstract.
KEYWORDS:
keywords1,keywords2,keywords3,keywords4
前 言
前言内容。
①研究工作的目的,要解决的问题及主要观点;②研究工作的背景及已有文献的综述;③研究设想、方法和手段、实验设计、研究工作的界限和规模等;④本课题研究预期结果和意义。
蛋白质是细胞中重要的功能分子结构,是生命活动的主要承担者。
确定蛋白质的结构和蛋白质的相互作用对于认识蛋白质的工作原理具有重要意义。
在确定蛋白质结构方面,一些传统的鉴定方法如核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)、X射线晶体衍射技术(X-raycrystallography)已经取得了显著的进步。
但是这些方法仅仅对单纯的某种蛋白质具有很高的分辨率,对于蛋白质复合物结构的鉴定却受到很大限制,而且这类方法通常成本很高,时间花费很长。
交联质谱技术(chemicalcross-linkingcoupledwithmassspectrometry),简称CXMS技术,在传统的质谱技术基础上,利用化学交联剂作用于蛋白质空间上相邻的氨基酸,通过形成共价键使得两个氨基酸残基之间保持一定的相互作用。
对交联产物进行富集提纯之后利用蛋白酶(如胰蛋白酶)进行酶切,将酶切后的肽段送入液相色谱-串联质谱等中将产生由不同碎片离子对应的质谱图。
鉴定交联质谱数据时,由于交联肽段碎片离子种类复杂,搜索空间巨大等原因,使用传统的搜库方法不能有效的鉴定。
早期对交联质谱的鉴定主要是基于一级谱图进行,随着质谱仪的不断发展,基于二级谱图的交联肽段鉴定逐渐发展起来。
这类方法主要有两种思路,一种是将交联肽段考虑为直链肽段,从而将交联质谱鉴定问题转化为能够用现有搜库软件进行直链肽段的鉴定中去;另一种是根据交联质谱的特点,对数据库进行预处理,编写专门用于交联质谱鉴定的程序。
目前有很多专门的应用程序已经开发出来,如Popitam、xQuest、crux、pLink等。
本文首先分析普通直链肽段经过碰撞诱导裂解(Collision-inducedDissociation,CID)后产生碎裂离子b离子、y离子、a离子以及各种中性丢失离子等的产生以及产生算法研究,然后通过系统调研化学交联质谱方法,对由于化学交联产生的不同类型的交联肽段规律进行总结,构建交联肽段碎裂模型,通过改写直链肽段的理论图谱产生算法。
针对交联肽段的碎裂还考虑了在HCD(High-energycollisionaldissociation)碎裂下发生多碎裂事件下产生的理论图谱情况,构建了统一的理论图谱产生算法。
通过由Singh等人收集的人类细胞色素b5和细胞色素P4502E1交联质谱数据集上进行测试,测试结果表明编写适合于交联分支肽段理论图谱产生算法,能够显著提高实验质谱谱峰与理论图谱谱峰的匹配数目,从而提高交联质谱鉴定的灵敏度,对于利用交联质谱进行蛋白质结构分析具有重要意义。
本文针对化学交联引起的分支肽段的产生给传统蛋白质数据库鉴定带来的困难,通过编写搜库中理论图谱的产生算法,来提高交联肽段模式匹配的灵敏度,从而促进交联肽段图谱的注释与解析。
算法中充分考虑了交联肽段可能的碎裂离子信息,通过在典型数据集上测试相应的理论图谱产生算法,得到了较好的效果。
第1章 绪论
1.1 引言
随着2003年人类基因组测序全部完成,生命科学的研究进入后基因组时代。
由于蛋白质是生命现象复杂性和多变性的直接体现者,是基因功能活动的执行者,利用蛋白质组的研究有望揭示基因在整个功能网络的地位,从而了解生命现象和生命本质。
因此,蛋白质组学将会在揭示生命奥秘过程中起到极其重要的作用。
对蛋白质组的全面研究将逐渐成为二十一世纪前期的一项重要任务。
蛋白质组学(proteomics)是研究细胞或组织内所有表达的蛋白质的一门新兴学科。
它的目的是通过系统地、定量地研究蛋白质在细胞、组织中的表达情况,来揭示基因的功能、蛋白质之间的关系以及生命过程的运行机制。
其主要任务包括蛋白质序列鉴定、蛋白质修饰鉴定、蛋白质定量分析、蛋白质结构预测和蛋白质功能预测等问题,而确定出某种细胞、器官或组织在一定条件下表达出了哪些蛋白质是其最基本任务之一。
蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术、蛋白质相互作用分析及生物信息学数据处理技术被称为蛋白质组研究的四大基本支撑技术。
其中,在蛋白质鉴定方面,质谱技术是目前在鉴定蛋白质的多种方法中发展最快、应用最广泛、最具发展潜力的技术。
归功于一些软电离技术的应用,如电喷雾(ESI)和基体辅助激光解吸电离(MALDI),质谱技术已经成为蛋白质组学研究的支撑技术之一,可以实现大规模、高通量的蛋白质定性和定量分析。
目前,利用质谱仪进行蛋白质测序定量等方面已经发展较为成熟,出现了Mascot等专业的蛋白质质谱鉴定软件。
这些软件对于传统的直链肽段的测序定量等有很好的效果,但是对于交联等产生的分支肽段的检测却无法准确的鉴定。
交联质谱技术是研究蛋白质结构和相互作用的重要生物技术,它能够通过化学交联和质谱技术相结合来确定交联氨基酸的位点和空间距离。
由于交联肽段的肽段碎裂与直链肽段不同,因此传统的蛋白质搜库软件无法正常鉴定。
关于交联质谱的鉴定主要有两类方法,一类是将交联肽段考虑为直链肽段利用传统的鉴定软件进行鉴定;另一类是针对交联肽段自身的特点设计相应的鉴定软件。
第一类方法有Maiolica等人于2007年利用Mascot软件将交联肽段转化为两肽段串联的结构进行鉴定,Singh等人于2008年提出的基于Popitam软件的无修饰搜库方法的鉴定。
第二类方法有2008年Rinner等人利用轻重标记的同位素开发了xQuest软件用于交联数据库的搜索鉴定,2009年Sean等人开发crux软件进行交联肽段的搜库鉴定。
2012年杨兵等人开发的pLink软件专门用来鉴定交联肽段。
1.2 蛋白质
蛋白质是由线性排列的氨基酸分子组成的有机化合物。
相邻的氨基酸残基的羧基和氨基通过肽键连接在一起。
不同的氨基酸相互排列形成的肽段序列成为蛋白质的一级结构;肽段部分氨基酸之间会经过α螺旋和β折叠等形成蛋白质的二级结构;相应的二级结构在三维空间上相互作用形成亚基成为蛋白质的三级结构;不同的肽链亚基相互作用形成更为复杂的相互作用结构成为蛋白质的四级结构。
在蛋白质中,某些氨基酸还可以被翻译后修饰如磷酸化、糖基化等,而发生相应的化学结构变化,从而对蛋白质进行激活和调控。
多个蛋白质可以结合在一起形成蛋白质复合物,发挥某种特定功能。
图1 蛋白质形成示意图
组成蛋白质的氨基酸一般有20种。
它们的组成结构都含有氨基(-NH2 )和羧基(-COOH),所不同的在于R基。
表1-1 20种氨基酸表
中文名称
英文名称
符号和缩写
分子量
侧链结构
丙氨酸
Alanine
A或Ala
89.079
CH3-
精氨酸
Arginine
R或Arg
174.188
HN=C(NH2)-NH-(CH2)3-
天冬酰胺
Asparagine
N或Asn
132.104
H2N-CO-CH2-
天冬氨酸
Asparticacid
D或Asp
133.089
HOOC-CH2-
半胱氨酸
Cysteine
C或Cys
121.145
HS-CH2-
谷氨酰胺
Glutamine
Q或Gln
146.131
H2N-CO-(CH2)2-
谷氨酸
Glutamicacid
E或Glu
147.116
HOOC-(CH2)2-
甘氨酸
Glycine
G或Gly
75.052
H-
组氨酸
Histidine
H或His
155.141
N=CH-NH-CH=C-CH2-
|____________|
异亮氨酸
Isoleucine
I或Ile
131.160
CH3-CH2-CH(CH3)-
亮氨酸
Leucine
L或Leu
131.160
(CH3)2-CH-CH2-
赖氨酸
Lysine
K或Lys
146.17
H2N-(CH2)4-
蛋氨酸
Methionine
M或Met
149.199
CH3-S-(CH2)2-
苯丙氨酸
Phenylalanine
F或Phe
165.177
Phenyl-CH2-
脯氨酸
Proline
P或Pro
115.117
-N-(CH2)3-CH-
|_________|
丝氨酸
Serine
S或Ser
105.078
HO-CH2-
苏氨酸
Threonine
T或Thr
119.105
CH3-CH(OH)-
色氨酸
Tryptophan
W或Trp
204.213
Phenyl-NH-CH=C-CH2-
|___________|
酪氨酸
Tyrosine
Y或Tyr
181.176
4-OH-Phenyl-CH2-
缬氨酸
Valine
V或Val
117.133
CH3-CH(CH2)-
正文。
1.3 质谱技术
质谱技术最初是用来测定元素或同位素的原子量,随着质谱技术的不断改进,应用越来越广泛。
质谱技术在生命科学领域的发展逐渐形成了独特的生物质谱技术。
质谱技术的基本原理是将离子化的离子通过电场、磁场等控制进行按时间、空间等进行分离,最终搜集不同质量电荷比(m/z,简称质荷比)的离子的强度信息,从而形成原始质谱数据。
质谱仪通常包括进样部分、离子源、质量分析器和检测器。
进样部分是将分析样品转化为气态、液态或固态送入离子源,主要有进样板进样、进样头进样、毛细管进样(从气象色谱及液相色谱柱)等。
离子源是将样品离子化得到以便于质量检测器的检测,主要有电子轰击(ElectronIonization)、快速离子轰击(FastIonBombardment)、基质辅助激光解吸附电离(Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization)、电喷雾电离(ElectrosprayIonization)等。
质量分析器作用是将离子源中产生的离子按照不同的质荷比进行分开。
常用的质量分析器有四级杆质量分析器(QuadrupoleAnalyzer)、离子阱质量分析器(IonTrapAnalyzer)、飞行时间分析器(Time-of-FlightAnalyzer),傅里叶回旋共振质量分析器(FourierTransform-IonCyclotronResonance)等。
检测器主要用来测量通过质量分析器之后离子的质荷比并形成相应的混合物的质量谱。
1.4 基于质谱的蛋白质鉴定
利用质谱获得蛋白质的谱图流程为,对于蛋白质样品首先利用二维凝胶电泳等技术进行初步分离,然后利用蛋白酶(如胰蛋白酶,Typsin)对蛋白质进行酶解,产生的肽段混合物利用高效液相色谱仪等仪器中进行进一步分离,经过离子化之后送入质谱中进行质荷比的检测。
串联质谱是在样品经过一级质谱分析之后,选取感兴趣的前体离子进一步进行碎裂,碎片离子进行第二级质谱分析,从而获得更多的碎片离子信息。
常见的碎裂方式有CID、电子转移裂解(electron-transferdissociation,ETD)、电子捕获裂解(electron-capturedissociation,ECD)等。
典型的经过预处理之后的二级谱图如图2所示。
图2 MS/MS质谱图
对于谱图解析的方法通常有Denovo(从头测序)方法、基于蛋白质数据库搜索方法、基于谱图数据库搜索方法等。
目前基于蛋白质数据库的搜库鉴定方法在蛋白质鉴定中处于核心地位,其中基于二级质谱图的搜库鉴定是目前研究最普遍的方法。
基于数据库的搜索方法的基本流程为:
首先针对蛋白质序列的数据库进行理论酶切,得到相应的酶切肽段,然后在一定的母离子质量误差范围内筛选出理论酶切肽段与实验质谱图中母离子质量相等的酶切肽段作为候选肽段,对这些候选肽段基于不同的碎裂模型如CID等进行理论碎裂,获得对应的碎裂理论图谱,然后将这些理论图谱与实验图谱进行匹配并打分,最终打分值最高的候选肽段即为相应的鉴定结果。
目前基于数据库搜索的蛋白质鉴定软件主要有Mascot、SEQUEST、X!
Tandem等。
其中X!
Tandem为免费的开源软件。
搜库鉴定核心的问题在于理论图谱的产生和理论图谱与实验图谱匹配打分。
目前,理论图谱的产生依据不同的碎裂模型有不同的产生算法。
诱导碰撞裂解方法是使用最普遍的碎裂方法,肽段在碎裂中会产生不同的离子,通过计算不同离子产生的情况从而得到相应的理论图谱。
第2章 交联质谱技术
2.1 交联质谱法
交联质谱技术,是最近十几年来发展起来的用于鉴定蛋白质结构和相互作用的新方法。
它主要是利用化学交联剂(cross-linker)固定蛋白质之间可以与交联剂相互作用并且空间距离合适的两个氨基酸,然后对交联产生的混合反应物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法(SDS-PAGE)或者反相高效液相色谱技术(RP-HPLC)进行分离,然后对于分离出的交联肽段利用亲和色谱(affinitychromatography)等技术进行富集,之后送入相应的质谱仪中进行分析。
与传统的研究蛋白质结构的方法如核磁共振等,它具有可以高通量鉴定蛋白质结构和相互作用、不受蛋白质自身长度影响、可以进行体内交联等优点。
2.2交联剂
交联质谱技术中,交联剂的选取对于实验的结果会产生重大的影响。
目前最常用的交联剂是能够和氨基反应的琥珀酰亚胺酯类(NHSester)交联剂。
如二(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(bissulfosuccinimidylsuberate,BS3)等。
它的作用基团为赖氨酸(K)侧链的氨基或者蛋白质N端的氨基。
此外还有一些特殊的交联剂,如含有亲和基团的交联剂、能够在二级质谱图中产生特殊离子峰的交联剂、轻重同位素标记的交联剂等。
本文采用的数据集中采用的交联剂是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺,简称EDC。
该交联剂的羧基类交联剂。
化学结构如图所示。
图3 MS/MS质谱图
EDC可以与天冬氨酸(D)或谷氨酸(G)的羧基相互作用,也可以与赖氨酸(K)的氨基相互作用。
相应的化学反应如图所示。
图4 交联剂EDC反应过程
2.2交联产物
两个蛋白质经过交联反应之后,经过相应的蛋白酶进行酶切后会形成多种交联产物,如图5所示,有与交联剂发生作用的单肽段、肽段内交联产物、肽段间交联产物等。
图5 交联质谱法一般产物及图谱
2.3交联图谱的鉴定
与常规直链肽段检测不同,由于交联反应产物种类的复杂性、交联产物丰度较低、碎裂产生的理论图谱更加多样化等特点,使得交联质谱的鉴定非常具有挑战性,此外在打分方法上,交联肽段的检测也与直链肽段不同,打分方法还需要改进以提高鉴定结果的可信度。
对于交联质谱的鉴定最初是利用一级质谱进行的,主要原理是通过计算要鉴定的交联肽段母离子的理论质量,然后在一级质谱中寻找与之匹配的谱峰。
匹配成功之后进行相应的二级图谱人工标注。
随着质谱仪精度的不断提高,利用二级图谱进行交联肽段的鉴定方法逐渐发展起来。
这类方法主要有两类典型代表:
一是设法将交联肽段的鉴定问题转化为直链肽段的鉴定问题。
如Singh等人提出的首先通过对质谱图进行标准序列库搜索然后对那些具有高打分匹配的肽段进行去除,剩下的匹配不好的谱图再利用Popitam进行无修饰开放式搜索;二是针对交联肽段自身在碎裂过程中产生的各种碎片离子信息进行理论图谱的构建然后进行搜库鉴定。
如Sean等人考虑交联肽段离子碎裂的特殊性,利用经验曲线拟合的方法成功鉴定出很多交联质谱数据。
第3章 肽段碎裂
3.1 肽段碎裂方式
肽段在质谱仪中常见的碎裂方式有碰撞诱导裂解、电子捕获裂解、电子转运裂解等。
其中最常见的为碰撞诱导裂解。
碰撞诱导裂解过程是利用电场对肽段离子进行加速到一个很高的能力状态然后与中性粒子(如He、N、Ar等)碰撞,在碰撞过程中一部分动能转化为肽链上化学键断裂的能量。
碰撞诱导裂解主要是利用碰撞能量再分配的机理。
碎裂产生的离子主要为a离子、b离子和y离子。
电子捕获裂解则是利用低能量的自由电子和肽离子相互作用中放热瞬间产生碎裂。
电子转运裂解是通过带一个电子的阴离子和肽离子相互作用而发生类此电子捕获裂解过程中的碎裂行为。
电子捕获裂解和电子转运裂解在碎裂过程中减少了肽段碎裂的随机性,通常产生c离子和z离子。
此外还有一些碎裂方式,如高能碰撞诱导裂解。
与普通CID主要产生b、y离子不同,它可以产生更为丰富的碎片离子以提高肽段质谱鉴定的准确性。
3.2 直链肽段碎裂离子的产生
CID碎裂下,关于肽段离子碎裂模型的一个重要假设是质子迁移假说(MobileProtonHypothesis)。
该假说认为质子在肽段上的迁移引起的导致了肽段的碎裂,同时肽段的碎裂受该肽段物理化学性质和碰撞能量的共同影响。
肽段离子在诱导碰撞下会发生电荷的迁移,迁移的电荷落到某个氨基酸上则相应的氨基酸的N端会发生断裂。
断裂过程中如果最终电荷落在含有N端的电荷上那么则会产生a、b、c离子,相应的落在C端则会产生x、y、z离子。
这些离子的命名最早是Roepstorff和Fohlman提出的。
a、b、c、x、y、z等离子产生时具体的断裂位点如图所示。
产生的相应的离子如图所示。
如对于b、y离子的产生,断裂发生的位点在两个氨基酸形成的肽键上的C-N键,而a、x离子的产生断裂时的位点在发生在C-C键上。
对于精氨酸(R)、天冬氨酸(N)、谷氨酰胺(R)和赖氨酸(K)等氨基酸残基中含有-NH2基团,可能会脱去一个氨分子。
对于丝氨酸(S)和苏氨酸(T)等氨基酸残基中含有-OH基团,可能会脱去一个水分子。
当肽段离子主链上发生多次碎裂后,会产生相应的中间碎片离子(InternalCleavageIons)。
一种特殊的例子是当某氨基酸两侧发生b、y断裂和a、x断裂时会形成亚胺离子(ImmoniumIons)。
在千电子伏能量的碰撞诱导裂解中,某些氨基酸会发生侧链基团的裂解,从而形成卫星离子。
肽段的断裂还受到肽段中精氨酸数目的影响。
当肽段中精氨酸数目小于等于质子的数目时,所有的电荷都将被固定在精氨酸的侧链上,此时在低能量条件下,肽段的主链上没有质子移动,肽段只能选择性断裂。
当肽段中质子的数目大于精氨酸的数目时,则至少有一个质子没有被固定在精氨酸的侧链上,主链肽段上移动的质子往往能够导致非选择性断裂,此时能够提供丰富的碎裂离子和相应的序列信息。
在低能量CID中(如在四级杆或者离子阱质谱的碰撞中),肽段的碎裂主要发生在主链上,产生的离子主要是a、b、y离子。
此外也会有丢失水分子和氨分子的a°、b°、y°和a*、b*、y*离子。
但来自于侧链断裂的卫星离子观察不到。
在高能量CID中,上述所有的碎片离子都能够观测到。
与低能量CID不同的是,它的碎裂离子通常不容易出现氨分子和水分子的丢失。
计算不同碎裂离子质量公式如下表所示。
离子类型
相对分子质量
a
[N]+[M]-CHO
a*
a-NH3
a°
a-H2O
b
[N]+[M]-H
b*
b-NH3
b°
b-H2O
c
[N]+[M]+NH2
d
a-partialsidechain
v
y-completesidechain
w
z-partialsidechain
x
[C]+[M]+CO-H
y
[C]+[M]+H
y*
y-NH3
y°
y-H2O
z
[C]+[M]-NH2
3.3 交联肽段碎裂离子的产生
由于交联肽段分子量大、长度较长、所带电荷多,因此交联肽段的碎裂比普通直链肽段的碎裂更加的复杂。
例如由于交联肽段通常较长以及为了使得交联肽段离子碎裂更加充分往往采用高能诱导碰撞裂解,因此往往发生不止一次的断裂,导致碎裂产物成平方级规模增加。
如图所示,不同位置的断裂以及断裂数目的不同将产生种类异常复杂的碎片离子。
对于单碎裂事件,形成b、y等离子时碎裂情况相似,对模型进行抽象之后发现,只是在计算质量时需要在交联位点之后将另一条肽段和交联剂的质量考虑进去即可。
对于发生不止一次的断裂时,如断裂两次,则需要考虑各种可能的离子断裂组合情况。
第4章 肽段理论图谱的算法实现
4.1 直链肽段的碎裂理论图谱的c++实现
利用c++编程平台,根据第三章中讨论的直链肽段规律,实现了直链肽段中各种碎片离子的产生。
算法的实现主要流程为:
1.定义20种氨基酸残基以及各种基团(如-OH、NH3、-H、H2O等)的相对分子质量和各种碎片离子的序列表示。
编写读取相应氨基酸质量的函数。
2.依据定义好的不同离子,计算相应的碎裂质量。
如编写b离子产生函数时,假设肽段含有的氨基酸数目为n,则b离子总数为n-1。
然后定义变量循环产生所有的b离子。
初始b离子质量为N端-H基团的质量,一次计算各b离子时叠加上相应位置的氨基酸残基的质量即可。
其他a、c离子的产生与b离子的产生类似。
对于x、y、z离子质量的产生,利用母离子质量减去a、b、c离子获得。
其中由于a、x离子的质量之和为[N]+[M]-CHO+[C]+[M]+CO-H,等于肽段母离子质量减去2个H的质量,因此需要进行相应的调整。
3.对于a-NH3、b-H2O等离子的产生算法。
由于离子只在肽段某些的氨基酸上发生脱去氨或水,并且通常只脱去一分子。
因此,在考虑这些离子产生时,如b-H2O的产生,从N端到C端每个氨基酸进行遍历,当发现丝
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分支 理论 图谱 产生 算法 研究