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单链
模板
不要模板
要模板
连接的对象
2个DNA片段
单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上
相同点
作用实质
形成磷酸二酯键
化学本质
蛋白质
(三)“分子运输车”——载体
1.载体具备的条件:
①能在受体细胞中复制并稳定保存;
②具有一至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段插入;
③具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。
2.基因工程常用的载体有:
质粒、噬菌体和动、植物病毒等。
最早应用的载体是质粒,它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。
补:
基因结构:
真核原核
三.基因工程的基本过程
(一)获得目的基因(目的基因的获取)
1.获取方法主要有两种:
①从自然界中已有的物种中分离出来,如可从基因文库中获取。
基因文库的种类:
基因组文库、部分基因文库(如反转录法得到的cDNA文库就是部分基因文库)
②用人工的方法合成。
③利用PCR技术扩增目的基因
适用对象:
①②③
苏教版:
★获得原核细胞的目的基因可采取直接分离,获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。
★人工合成目的基因的常用方法有化学合成法。
2.利用PCR技术扩增目的基因
(1)PCR的含义:
是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
全称:
聚合酶链式反应。
(2)目的:
获取大量的目的基因
(3)原理:
DNA双链复制
(4)过程:
第一步:
加热至90~95℃DNA解链为单链;
变性
第二步:
冷却到55~60℃,引物与两条单链DNA结合;
退火
第三步:
加热至70~75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。
延伸
重复
反应容器中预先提供的物质:
(5)特点:
指数形式扩增
(二)制备重组DNA分子(基因表达载体的构建)
1.重组DNA分子的组成:
除了目的基因外,还必须有标记基因、、。
★标记基因的作用:
鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
2.方法:
同种限制酶分别切割载体和目的基因(目的基因插在载体内部时两端都有断口),再用DNA连接酶把两者连接。
(三)转化受体细胞(将目的基因导入受体细胞)
1.转化的概念:
是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.常用的转化方法:
①将目的基因导入植物细胞:
采用最多的方法是农杆菌介导转化技术(农杆菌转化法),其次还有基因枪介导转化技术(基因枪法)和花粉管通道技术(花粉管通道法)。
②将目的基因导入动物细胞:
最常用的方法是显微注射技术。
此方法的受体细胞多是受精卵。
③将目的基因导入微生物细胞:
Ca2+处理法。
工程菌常用原核生物的原因:
单细胞、遗传物质少、主要是繁殖快
(四)筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达(目的基因的检测与鉴定)(标记基因的应用)
1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,方法是采用DNA分子杂交技术。
2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA,方法是采用DNA分子杂交技术。
3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法是采用抗原—抗体杂交技术。
4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。
如抗虫或抗病的鉴定等。
基因工程的应用B
基因工程的应用
1.运用基因工程改良动植物品种最突出的优点是:
能打破常规育种难以突破的物种之间的界限。
2.基因工程的应用
(1)植物基因工程:
抗虫、抗病、抗逆转基因植物,利用转基因改良植物的品质。
(2)动物基因工程:
提高动物生长速度来提高产品产量、改善产品品质,用转基因动物生产药物,用转基因动物作器官移植的供体等。
(3)基因诊断和基因治疗:
基因诊断:
又称为DNA诊断,是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带
病原体。
基因治疗:
指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。
实例:
ADA基因缺陷症的基因治疗(注入有缺陷的T细胞中培养后在回输体内)
种类:
体内治疗和体外
蛋白质工程A
蛋白质工程
1.蛋白质工程的实质:
根据蛋白质的结构与功能之间的关系,通过改造基因,以定向改造天然蛋白质,甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。
2.蛋白质工程的基本原理
预期蛋白质功能→测定蛋白质三维空间结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)→具有预期功能的蛋白质
3.蛋白质工程的应用
(1)通过改造酶的结构,有目的地提高蛋白质的热稳定性。
(2)合成嵌合抗体。
(人+鼠的抗体)
(3)改变蛋白质的活性。
★蛋白质工程与基因工程区别
蛋白质工程
基因工程
实质
通过改造基因,以定向改造天然蛋白质,甚至创造自然界不存在的蛋白质
将目的基因从供体转移到受体细胞,并在受体细胞中表达
合成自然界不存在的蛋白质
只能生产自然界已存在的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程基础上,延伸出的第二代基因工程
细胞工程
概念:
分析:
1、操作水平:
2、操作对象:
3、结果:
4、技术种类:
(一)植物细胞工程
植物的组织培养B
植物的组织培养
1.理论基础(原理):
细胞全能性、、、、、
全能性表达的难易程度:
受精卵>生殖细胞>干细胞>体细胞;
植物细胞>动物细胞
2.植物组织培养技术
(1)过程:
离体植物器官、组织或细胞―→愈伤组织―→胚状体(根、芽等)―→试管苗―→植物体
(培养基种类和成分:
分化培养基---;
脱分化培养基---。
其中激素在调节分化和脱分化中起关键作用)
(2)用途:
微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、培育新品种(突变体的利用、单倍体育种)、细胞产物的工厂化生产。
(分别应用工程技术的那些重要环节?
单倍体育种流程图?
细胞产物的工厂化生产流程图?
)
(3)地位:
是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。
3.植物细胞培养(苏教版)
(1)概念:
在实验室工厂化生产的条件下,将组织培养过程中形成的愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中,进行悬浮培养,得到分散游离的悬浮细胞,通过继代培养使细胞增殖,从而获得大量的细胞群体的一种技术。
(2)与植物组织培养的关系
①植物组织培养是基础。
②目的不同:
植物组织培养的目的是得到更多的植物体,植物细胞培养的目的是获得人类所需的细胞
(3)实例:
成功地培养红豆杉的细胞,从中提取出重要的抗肿瘤药物——紫杉醇。
补.植物体细胞杂交技术
(2)诱导融合的方法:
物理法包括离心、振动、电刺激等。
化学法一般是用聚乙二醇(PEG)作为诱导剂。
(3)意义:
克服了远缘杂交不亲和的障碍。
动物的细胞培养与体细胞克隆
(二)动物细胞工程
动物的细胞培养与体细胞克隆A
1.动物细胞培养
动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和繁殖。
(2)动物细胞培养的流程:
取动物组织块(动物胚胎或幼龄动物的器官或组织)→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
(3)细胞贴壁和接触抑制:
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁。
细胞数目不断增多,当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时,细胞就会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的接触抑制。
(4)动物细胞培养需要满足以下条件
①无菌、无毒的环境:
培养液应进行无菌处理。
通常还要在培养液中添加一定量的抗生素,以防培养过程中的污染。
此外,应定期更换培养液,防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
②营养:
合成培养基成分:
糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。
通常需加入血清、血浆等天然成分。
③温度:
适宜温度:
哺乳动物多是36.5℃+0.5℃;
pH:
7.2~7.4。
④气体环境:
95%空气+5%CO2。
O2是细胞代谢所必需的,CO2的主要作用是维持培养液的pH。
(5)动物细胞培养技术的应用:
制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。
2.动物组织培养(苏教版):
动物细胞培养与动物组织培养方法类似,主要区别是动物细胞培养过程中需要用胰蛋白酶等使组织块中的细胞离散,而动物组织培养过程中不需要使用胰蛋白酶等。
补:
动物细胞培养与植物体组织培养的比较:
3.动物体细胞核移植技术和克隆动物
(1)哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植(比较容易)和体细胞核移植(比较难)。
(2)选用去核卵(母)细胞的原因:
卵(母)细胞比较大,容易操作;
卵(母)细胞细胞质多,营养丰富;
含有促进细胞核全能性表达的物质
(3)体细胞核移植的大致过程是:
核移植
胚胎移植
(4)体细胞核移植技术的应用:
①加速家畜遗传改良进程,促进良畜群繁育;
②保护濒危物种,增大存活数量;
③生产珍贵的医用蛋白;
④作为异种移植的供体;
⑤用于组织器官的移植等。
(5)体细胞核移植技术存在的问题:
克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。
细胞融合与单克隆抗体A
4.动物细胞融合
(1)动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。
融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞,称为杂交细胞。
(2)动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同,诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似,常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。
(3)动物细胞融合的意义:
克服了远缘杂交的不亲和性,成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。
(4)动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较:
比较项目
细胞融合的原理
细胞融合的前处理
诱导手段
用法
植物体细胞杂交
细胞膜的流动性
去除细胞壁后诱导原生质体融合
离心、电刺激、振动,聚乙二醇等试剂诱导
克服了远缘杂交的不亲和性,获得杂种植株
动物细胞融合
使细胞分散后诱导细胞融合
除应用植物细胞杂交手段外,再加灭活的病毒诱导
制备单克隆抗体的技术之一
5.单克隆抗体
(1)抗体:
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
血清中有多种浆细胞产生的抗体混合。
从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
(2)单克隆抗体的制备过程:
(3)杂交瘤细胞的特点:
既能大量繁殖,又能产生专一的抗体。
(4)单克隆抗体的优点:
特异性强,灵敏度高,并能大量制备。
(5)单克隆抗体的作用:
①作为诊断试剂:
准确识别各种抗原物质的细微差异,并跟一定抗原发生特异性结合,具有准确、高效、简易、快速的优点。
②用于治疗疾病和运载药物:
主要用于治疗癌症治疗,可制成“生物导弹”,也有少量用于治疗其它疾病。
胚胎工程
胚胎工程的理论基础A
动物的胚胎发育和胚胎工程
一、哺乳动物生殖细胞的发生和受精作用
1.哺乳动物生殖细胞
1.1精子的发生
精原细胞先进行有丝分裂后进行减数分裂,最后形成4个精细胞,再经过成熟过程形成精子。
产生部位:
睾丸的曲细精管;
储存部位:
曲细精管的管腔中;
营养来源:
支持细胞。
细胞核→精子头的主要过程
高尔基体→头部的顶体
精子细胞中心体→精子的尾
线粒体→精子尾基部线粒体鞘膜
其他物质→原生质滴(最后脱落)
1.2卵子的发生
卵原细胞先进行有丝分裂后进行减数分裂,最后形成1个卵子。
具体过程:
卵原细胞进行有丝分裂演变成初级卵母细胞[被卵泡细胞包围]形成初级卵泡,经过减数第一次分裂形成第一极体和次级卵母细胞,其中,第一极体经过减数第二次分裂形成2个第二极体,而次级卵母细胞的减数第二次分裂是在受精过程输卵管中完成的,形成1个卵子和1个第二极体,最终结果产生1个卵子和3个第二极体。
1.3精子卵子形成过程的不同点
项目
精子的发生过程
卵子的发生过程
发生场所
睾丸
卵巢和输卵管
发生时间
减数分裂
减数分裂和受精过程
发生过程
连续
不连续
核物质含量
减半(n)
是否变形
是
否
一个性原细胞最终产生的生殖细胞个数
4
1
细胞质分裂
均等
不均等
2.受精作用
精子获能
精子在附睾中成熟后必须在雌性动物生殖道内经历一段时间才能获得受精能力的过程。
卵泡液、输卵管分泌物、血清等液体可使精子获能。
特征
(1)受精作用的定义:
卵细胞和精子相互识别、融合成为受精卵的过程。
(2)受精作用的场所:
输卵管的壶腹部
(3)受精标志:
第二极体的形成;
受精完成标志是雌雄原核融合成合子。
(4)受精作用的结果:
使单倍体的精子和卵子结合形成二倍体的受精卵,染色体数目
恢复到体细胞中的数目,其中一半染色体来自父方,另一半来自母方。
(5)减数分裂和受精作用的意义:
对于维持每种生物前后代体细胞中染色体数目的恒
定,对于生物的遗传和变异,都是十分重要的。
防止多精入卵的机制是:
动物胚胎发育的基本过程A
二、哺乳动物胚胎发育的基本过程
受精过程的完成,标志着胚胎发育的开始。
起点:
受精卵;
终点:
幼体;
包括卵裂(细胞进行有丝分裂,数量增加,
)、囊胚(细胞开始分化,其中个体较大的细胞叫内细胞团,将来发育成胎儿的各种
组织)、原肠胚、胚层分化等主要阶段。
各期细胞特点:
卵裂期….
囊胚…….
原肠胚….
胚胎工程的应用B
三、胚胎工程的主要技术与应用
1.胚胎工程的概念及技术手段
对动物生殖细胞、受精卵和早期胚胎细胞所进行的多种显微操作和处理技术,由体外受精技术、胚胎移植技术、胚胎分割技术、胚胎冷冻保存技术和性别控制技术等组成的现代生物技术。
胚胎发育学是胚胎工程的理论基础。
1.1体外受精技术
是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。
[属有性生殖过程]
基本原理:
人工模拟体内环境,包括营养、温度、pH等,使初级卵母细胞成熟,同时使精子获能,最终完成受精作用,并有计划地保存胚胎等。
卵母细胞的采集和培养对体型小的动物用促性腺激素处理,从输卵管冲取卵子(可直接受精);
对体型大的动物从卵巢中采集卵母细胞(要在体外培养成熟)。
体外受精的操作流程:
体外受精技术是哺乳动物胚胎移植技术、克隆技术、转基因技术和性别控制技术不可缺少的组成部分。
1.2胚胎移植技术
a概念:
将雌性动物的早期胚胎移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内,使之继续发育为新个体的技术。
b优势:
可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力,缩短供体本身的繁殖周期。
c胚胎移植的生理学基础:
同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的[对供体和受体进行同期发情处理];
早期胚胎形成后处于游离状态,为胚胎的收集提供可能;
受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应;
移入受体的供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。
d胚胎移植的程序:
①对供、受体母牛进行选择,用激素进行同期发情处理;
②对供体母牛用激素做超数排卵处理;
③选择同种优秀公牛配种[有性生殖过程];
④对胚胎进行收集[此时胚胎处于游离状态];
⑤对胚胎进行质量检查[此时胚胎应发育到桑椹胚或囊胚];
胚胎移植[或冷冻保存];
⑥检查受体母牛是否受孕;
⑦产下胚胎移植的犊牛。
画出流程图:
1.3胚胎分割技术
用显微手术方法将早期胚胎切割成2、4、8等份,经体内或体外培养后植入受体,以获得同卵双生或同卵多生后代的技术[可看作是动物无性繁殖或克隆]。
b基本过程:
选择良好的桑椹胚或囊胚移入培养皿中,用分割针或分割刀片将其切开,吸出其中的半个胚胎注入透明带中或直接移植给受体。
[注意:
内细胞团要均等分割,否则会影响胚胎的恢复和进一步发育]
1.4胚胎冷冻保存技术
将动物的早期胚胎,通过特殊的保护剂和降温措施,使其长期保存在超低温环境下。
B优势:
可以使胚胎移植不受时间和地域的限制,简化引种过程。
1.5动物性别控制技术
指通过人为干预,使动物按照人们的愿望繁衍所需性别的后代的技术。
胚胎干细胞的移植A
第二节胚胎干细胞的研究及其应用
一、胚胎干细胞及其研究进展
1干细胞:
动物(包括人)胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞,是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的种子细胞。
按照分化潜能的大小,干细胞基本上可分为专能干细胞(只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞)、多能干细胞(具有分化成多种细胞或组织的潜能却失去发育成完全个体能力的细胞)和全能干细胞(可以分化为全身各种细胞,并进一步形成机体的所有组织、器官)。
2成体干细胞:
存在于胎儿、儿童和成人组织中的多能干细胞。
造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源,主要存在于骨髓、脐血、外周血中。
3胚胎干细胞:
由早期胚胎[囊胚]或原始性腺[胎儿]中分离出来的一类细胞,又叫ES或EK细胞。
具有增殖能力并保持未分化状态、在一定的条件下可以向各种组织和器官分化、易于进行基因改造操作等特点。
如内细胞团细胞(位于囊胚的囊胚腔一侧)
特征:
形态上体积小、细胞核大、核仁明显;
功能上具有发育的全能性,即可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。
二、胚胎干细胞的应用
用于治疗人类疾病,如利用ES细胞诱导其分化成新的组织细胞特性,移植ES细胞可使
坏死或退化的部位得以修复。
三、胚胎干细胞研究面临的挑战
在法律、伦理、国家和社会安全等方面带来冲击。
生物技术的安全性和伦理问题
一.转基因技术成果
1.1972年美国斯坦福大学的柏格第一次重组DNA成功。
2.微生物方面:
(1)制造出具有重要经济价值的各种重组微生物,如清除石油污染的假单胞杆菌
(2)利用DNA重组的微生物生产稀缺的生化药物即基因制药
3.转基因动物方面:
(1)在培育生长迅速、营养品质优良的转基因家畜、家禽方面不断取得辉煌成就
(2)科学家把转基因动物变成生物反应器,让它们的奶中富含某种营养物质、珍贵药物或人类所需的蛋白质。
4.转基因植物方面:
(1)抗虫作物:
目前已经开发和利用的抗虫基因已有40多个,如苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因(Bt)是目前应用最广泛的基因;
还有植物的蛋白酶和淀粉抑制因子、动物的蛋白酶抑制因子、动物几丁质酶基因
(2)抗病作物:
将病毒外壳蛋白基因(CP)导入植物,从而使植物具有抗性。
我国将人巨细胞病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白基因用质粒导入烟草,获得抗TMV、CMV转基因抗病烟草。
(3)抗除草剂作物:
已获得的抗除草剂作物有大豆、棉花、玉米等
(4)作物品质改良:
如将抗寒基因导入作物,增强植物的耐寒性。
目前从极地鱼体中分离到的基因已被转入番茄、黄瓜,使作物耐寒或耐天气的骤然变化。
二.转基因生物的安全性A
(一)食物安全
1.两种观点的比较:
观点
存在安全问题
不存在安全问题
论据
1.对食物安全检测不全面
2.可能出现滞后效应
3.可能出现新的过敏源
4.营养成分可能改变
1.“实质性等同”只是评价的起点,而不是终点
2.多环节、严谨的安全性评价
3.科学家对社会负责的态度
4.至今未发现转基因食品影响人体健康的实例
2.实质性等同原则是指转基因生物与自然存在的传统生物在相同条件下进行性状表现的比较。
3.保证转基因食品安全的监控和预防措施:
立法、多环节监控、安全评价内容具体而严格
(二)生物安全
引起生物安全问题
不存在生物安全问题
1.可能变成野生种类或杂草
2.可能重组出新的有害病原体
3.有可能形成用除草剂除不去的“超级杂草”
4.可能成为“入侵的外来物种”
1.进入非种植区生命力很差
2.存在生殖隔离,难与其他植物杂交
3.花粉的传播距离和存活时间有限
4.新性状的表现必须具有一定的条件和配套的种植技术
2.外来物种入侵
(1)指有意或无意的人类活动,将某物种从一个地区引入其他地区,给当地的生态系统和社会经济造成明显的损害。
(2)危害:
破坏当地的生态系统;
对当地的农业或林业带来严重的损害(即爆发生物灾害);
造成生物多样性减少;
有些外来植物产生的花粉可能成为新的过敏源。
(三)环境安全
1.潜在的不安全问题:
可能会影响生态系统中原有的动态平衡,加剧环境污染,危害其他动植生存或人体健康。
2.安全依据:
(1)科学家转入的仅仅是有限的一种或几种基因,而转入的基因是否可能会对其他生物或环境造成危害,都要经过分析、实践的,一旦发现有害后果,科学家就会停止实验。
(2)转基因生物从实验室到自然界释放,都要经过一系列安全评价、审批。
(3)制定相关法规监控
三.关注生物技术的伦理问题A
反对者观点
支持者观点
克隆人
1.严重违反了人类伦理道德、冲击现有的婚姻、家庭等传统的道德观念
2.人为制造在心理和社会地位上不健全的人
3.技术不成熟可能孕育出严重生理缺陷的孩子
1.这是一项科学研究,只有通过实践才能使之成熟
2.可以通过胚胎分割、基因诊断、染色体检查等方法解决不成熟的部分
中国政府的态度:
禁止生殖性克隆。
不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验;
不反对治疗性克隆。
设计试管婴儿
1.把试管婴儿当做人体零配件工厂,是对生命的不尊重
2.胚胎也是生命,抛弃、杀死多余胚胎无异于“谋杀”
1.设计试管婴儿是为了救人,是救患者的最好、最快捷的办法之一
2.提供骨髓中的造血干细胞并不会对试管婴儿造成损害
3.利用脐带血中的造血干细胞是更符合伦理道德的。
基因检测
1、目前人类对基因结构、基因间相互作用
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