氨基酸分析Word文档下载推荐.docx
- 文档编号:7836198
- 上传时间:2023-05-09
- 格式:DOCX
- 页数:22
- 大小:995.47KB
氨基酸分析Word文档下载推荐.docx
《氨基酸分析Word文档下载推荐.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《氨基酸分析Word文档下载推荐.docx(22页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
CH2
NHCH2
HCCH2脯氨酸Proline(Pro)
—CH2—苯丙氨酸Phenylalanine(Phe)
—CH2CH2SCH3蛋氨酸Methionine(Met)
—CH2—色氨酸Tryptophan(Typ,Trp)
NH
R——不带电荷的极性基团
-H甘氨酸Glycine(Gly)
-CH2OH丝氨酸Serine(Ser)
-CH(OH)CH3苏氨酸Threonine(Thr)
-CH2SH半胱氨酸Cysteine(Cys)
-CH2--OH酪氨酸Tyrosine(Tyr)
-CH2CONH2天冬酰胺Asparagine(Asn)
-CH2CH2CONH2谷氨酰胺Glutamine(Glu)
R-带负电荷基团
-CH2COOH天冬氨酸Asparticacid(Asp)
-CH2CH2COOH谷氨酸Glutamicacid(Glu)
R-带正电荷基团
-CH2CH2CH2CH2NH2赖氨酸Lysine(Lys)
-CH2CH2CH2C(NH)NH2精氨酸Arginine(Arg)
---CH2---C====CH组氨酸Histidine(His)
NHN
不常见氨基酸
CH2—OH
HCCH24-羟脯氨酸Hydroxyproline(Hyp)
NH2
HCCH2CH2CH(OH)CH2NH2
5-羟赖氨酸Hydroxylysine(Hyl)
三、立体异构体
1.α-氨基酸
αC除甘氨酸外,其中αC上四个取代基不同,为手性C,手性异构体(isomers)Stereo立体,
enantiomers对映体
2.氨基酸立体异构体分类
——按绝对构型(absoluteconfiguration)
左旋L型,右旋D型,
与标准物——甘油醛比较而定
L-甘油醛glyceraldehydeD-甘油醛
L-丙氨酸D-丙氨酸
3.分布
——蛋白质经温和水解后,其中α-氨基酸都是L型氨基酸
——虽然自然界中,存在有D型氨基酸
——人工合成氨基酸DL消旋体racemate(DL等mol混合物)
四、氨基酸的酸碱性质
1.基本性质:
——酸-COOH失H+
——碱-NH2得H+,形成两性离子,两性电解质
两性解离
2.氨基酸得解离过程
以丙氨酸为例,以NaOH的滴定:
PI——iso-ionicpH(PI)
等离子点pH
在某pH,每个氨基酸分子带正负电荷相等,分子表观净电荷为0。
PI——iso-electricpoint
等电点
在某pH,每个分子呈电中性,在电场中无电泳迁移
五、反应
UVVis——20种α氨基酸
——可见区无吸收
——<
220nm,有紫外吸收
——220-300nm,酪、苯丙、色氨酸有吸收
(-)α氨基酸参加的反应
1.与亚硝酸
NH2OH
11
R-CH-COOH+HNO2→R-CH-COOH+N2↑+H2O
气量法测AAs的基础
2.与酰化试剂反应:
弱碱条件下氨基被酰(胺)化
著名丹(磺)酰氯(DansylChloride)AAs荧光衍生试剂
产物——有UV吸收
——有荧光λex=340nm
λem=455nm
3.烃基化反应
2,4二硝基氟苯FDNB+AAs→→→→DNP-氨基酸(黄色)
Sanger反应,用于鉴定氨基酸方程式
荧光胺(Fluorescamine)+AAs→→→产物λex=390nm
λem=475nm
邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)反应
一种重要荧光衍生化反应
OPA+AAs→→→产物
λex=340nm
4.与醛反应,形成西佛碱:
R-CHO+NH2-RCH-COOH→R-CH=N-RCH-COOH+H2O
固定化酶,或标记AgAb时所用的方法
5.脱氨基反应——酶催化反应
AAs氧化酶
AAs+O2→→→→→→→Oxoacid酮酸+H2O2+NH3
α-羧基参与的反应,分析化学中应用不多
(二)α-氨基与α-羧基共同参与的反应
1.与茚三酮反应(Ninhydrin)
分析化学最常用氨基酸衍生方法
水合茚三酮+AAs→→还原茚三酮+AAs被分解→→
兰紫色产物570nm测A.
有紫外吸收
2.成肽反应Peptide
以后详细讲
第二节氨基酸分析
氨基酸分析――分离分析方法
——原因:
氨基酸种类多
结构较相似
不经分离,难以直接分析,
现有直接分析方法,如酶、免疫分析法测定氨基酸选择性不够
——分离方法——高分辨分离技术:
色谱、电泳
按分离方法,分为四部分:
——纸、薄层色谱
——电泳
——气相色谱
——高效液相色谱
一、纸色谱,薄层色谱法
色谱——固定相:
纸色谱
薄层色谱——平面(板)液相色谱
——流动相
1.固定相
纸色谱-滤纸
薄层色谱-硅胶、氧化铝、纤维素粉——铺板,制板
2.流动相
多元流动相:
水、丁醇、HAc,丙酮、酚,NH3……
根据不同要求:
流动相具有不同组成,不同配比
3.分析方法
①试样预处理
采用阳离子交换柱、萃取、渗析——沉淀蛋白
去除干扰物:
蛋白、盐、碳氢化合物
2选择溶剂系统
多种组合配比
常用⑴丁醇-醋酸-水(12:
3:
5)
⑵酚-水(160g:
40ml)
分离方式:
——一维色谱分离
——二维色谱分离,为获得高分辨率
3点样展开
溶剂前沿
氨基酸
XY
点样原点
RF=X/Y比移值——保留值——保留时间
一维色谱分离
二维色谱分离
借用图
横坐标:
酚-水
纵坐标:
丁醇-HAc-水
分离效率高
4定位:
最常用:
茚三酮ninhydrin兰紫色产物
其它:
Sanger反应
丹酰氯AAs——有荧光λex=340nm
λem=455nm常用于分离前衍生化
⑤应用
定性:
利用RF,在三个不同的溶剂系统下,确证
半定量:
重现性不好
定量:
扫描挖点
二、电泳法
1.支持物:
纸、纤维素膜、硅胶
2.缓冲液体系:
常见pH2.0pH5.3
3.分析方法:
——一维电泳
——二维电泳-色谱分离
三、气相色谱法(GasLiquidChromatography)
1.试样的衍生化
——问题提出:
GC要求样品可气化,AAs难气化
——衍生化方法:
·
试剂:
常用三甲基硅烷(TrimethylsilylTMS对AAs衍生
方法:
N.O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA)
+AAs+ACN150℃2小时无水条件
2.分析方法:
毛细管GC可用一个色谱柱
其他常规GC,需用两个色谱柱,可分离常见AAs
检测器:
电子捕获检测器
火焰离子化检测器,使用较多(通用型检测器)
四、高效液相色谱法
分离分析法
色谱分离 检测
柱前衍生化 柱后衍生化
1.检测问题
HPLC检测器:
紫外、荧光、电化学
紫外:
AAs末端吸收,<
220nm,可用,但灵敏度低
荧光:
AAs无荧光
电化学:
干扰、稳定性
需进行衍生化
① 衍生化分类(derivation)
⑴按不同的衍生化试剂
常用:
——茚三酮
——邻苯二甲醛(OPA)
——丹酰氯FMDC
⑵按分离前后顺序
——柱前衍生pre-column
——柱后衍生post-column
⑶按衍生操作
在线衍生on-line可用于柱前或柱后衍生
脱线衍生off-line多用于柱前衍生
介绍具体衍生化方法及特点
② 茚三酮(ninhydrin)最成熟的方法
(1)过程
茚三酮汇合加热100℃570nm测A
(2)特点
Ø
成熟常用
可见检测,紫外也可
只能柱后衍生
灵敏度10-9mol10uL10-4mol/L
③OPA
OPA+AAs→pH9-10快速反应1-2min荧光产物340
455nm
可柱前衍生可柱后衍生
产物不稳定,1-2min后降解,只能在线衍生
需自动反应装置,否则重现性不好
灵敏度高pmol(10-12)-fmol(10-15)
只有伯氨氨基酸可衍生,(羟)脯氨酸不可
④丹酰氯
(1)一般柱前衍生。
但试剂产物对色谱柱寿命有影响
条件:
60℃10min
(2)可紫外可荧光,pmol(10-12)水平灵敏度
⑤FITC异硫氰酸荧光素
⑴过程:
FITC+丙酮+AAs+pH9.2混合,避光放置过夜
⑵特点
只能柱前脱线衍生
灵敏度较高,比OPA高,激光荧光,amol10-18mol
毛细管电泳中常用
2.色谱分离
按柱前衍生柱后衍生
分离AAs衍生物分离AAs
分离对象不同
1分离AAs
色谱柱-离子交换色谱柱-填充阳离子交换树脂
强酸型-SO3H
洗脱剂-缓冲液+盐(柠檬酸钠)
原理-
□-SO3H→碱处理→□-SO3Na+AAH+pH=2-3
→□-SO3AAH++Na+
逐渐提高pH和Na.不同AAH+洗脱下来,梯度洗脱
由此原理生产氨基酸分析仪
检测
采用在线柱后衍生化方法,主要有两种:
⑴茚三酮p374结果见p378
⑵OPA
②分离AAs衍生物,如OPA,
提前衍生,反应1分钟.
色谱柱:
碳18反相色谱柱;
洗脱剂Buffer+甲醇,四氢呋喃,梯度洗脱.
检测:
340nm455nm
4.定量分析:
AAs标准品,工作曲线,
试样定量
五.用途
1.氨基酸分析,药品,食品,饲料,临床
2.
蛋白质分析
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 氨基酸 分析