环糊精通过巨噬细胞的重组促进动脉粥样硬化的消退Word格式文档下载.docx
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硬化。
引言
动脉粥样硬化是一种基础性病变,它引起心脏病发作、卒中和外周血管疾病。
总的来说,这些疾病代表着一个常见健康问题,而当前的治疗不足以充分地降低疾病发展的风险。
高胆固醇浓度的药理性下降(1-3),是降低发生心血管疾病和卒中风险最成功的疗法,但低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度的充分降低在所有患者中是不可能的。
动脉粥样硬化是以动脉壁重构为特征的,它是由不同类型的脂质在血管内皮下层滞留和累积开始的。
血管壁中的脂类沉积和胆固醇晶体(CCs)的显现,导致血管壁中炎性反应
而发生病理改变。
系统性炎症增强的患者,其心血管疾病死亡的风险提高,所以,正在进行
着一些测试抗炎治疗是否可降低心血管事件发生率的研究⑹。
CCs是由动脉粥样硬化病变中胆固醇过多沉积所形成的,是动脉粥样硬化发生期中促炎
性反应的触发剂⑺。
CCs可触发补体激活和嗜中性粒细胞细胞外诱捕(网)的形成,以及诱导固有免疫通路(4,5,8-10)。
因此,治疗策略的目的在于预防胆固醇相变或消除CCs,以降
低组织炎症程度和疾病进展速度。
用基因方法来提高巨噬细胞移除动脉粥样硬化病变中游离胆固醇的能力,已证明在一
些临床前的试验中获得了高度的成功(11)。
这促使我们测试药物是否可以提高胆固醇的溶解
性、清除和分解代谢,而利用于动脉粥样硬化的预防或治疗。
2-羟丙基-3-环糊精(CD)是
美国食品药品管理局(FDA)批准在人体中用于溶解和包载递送尤其是治疗性的亲脂性药物
(12-13)。
虽然,以前曾显示CD提高了胆固醇的溶解性,在体内促进泡沫细胞中胆固醇的清除,和启动抗炎机制(14-16),但CD是否在体内能发挥抗动脉粥样硬化的作用,仍然是未知的。
这里,我们发现在小鼠模型中,诱导了已形成动脉粥样硬化的消退。
此外,CD增强了胆固醇代谢和肝脏
经皮下给予CD极大地减少了动脉粥样硬化的形成,和
CD增强了CCs的溶解,减少了CCs在病变中的出现。
X受体(LXR)依赖的细胞重新编程,这导致了胆固醇
更有效地逆向运输(RCT),和降低了促炎基因的表达。
低密度脂蛋白受体(LDLR)缺陷
小鼠中,CD的抗动脉粥样硬化作用,取决于所移植骨髓细胞中LXR的表达。
这些研究表明,CD通过提高氧化型胆固醇产生、LXR依赖的细胞重新编程,来发挥抗动脉粥样硬化作
用,而且所提供的临床前证据表明,CD可被开发作为人动脉粥样硬化有效的治疗药物。
结果
CD治疗动脉粥样硬化形成的病变
为了研究CD治疗小鼠动脉粥样硬化的效能,给载脂蛋白E(ApoE"
-)缺陷小鼠喂以高
胆固醇日粮,同时皮下注射CD治疗或载体物作对照,历时8周。
虽然,动脉粥样硬化的主要驱动物血浆胆固醇仍然不受影响(图.1A),不过,CD治疗鼠主动脉根部内极大地减少了
动脉粥样硬化病变(图.1B)。
此外,我们发现当用激光反射显微镜评估时,CD治疗小鼠动
脉粥样硬化斑块中减少了大量的CCs(图.1,C和D)。
CD不影响鼠的增重、血压、心率和
骨髓细胞诱导或循环的scal/flk-阳性细胞的数量(图.S1,A-E)。
此外,植物固醇、胆固烷醇和胆固醇前体的血浆浓度不受CD治疗的影响,这就间接地表明,CD不改变肠道胆固醇吸
收和整体内源性生物合成(图.S1F)(17)。
CD也不改变斑块的相关成分,包括细胞结构和巨噬细胞含量(图.1,E和F)。
然而,通过CD治疗,减少了主动脉反应的氧族(图.1G)和
促炎细胞因子的血浆浓度(图.1,H-J),表明CD可以减少动脉粥样硬化形成期间的炎症反应。
CD治疗促使动脉粥样硬化斑块的消退
虽然,与西式饮食饲喂的同时,连续地给予药物治疗,是研究可能的抗动脉粥样硬化
物质的标准程序(18),不过动脉粥样硬化形成早期阶段的患者一般未进行治疗。
因此,我们测
试了CD治疗消除动脉粥样硬化的效果。
载脂蛋白E-/-小鼠即使以正常或减脂食物饲喂也是
患高胆固醇血症的,因此,大多数小鼠动脉粥样硬化消退模型,是依赖于使血脂正常化干预策略的,例如,病毒基因的转移、移植、或高密度脂蛋白(HDL)颗粒的输注(19)。
我们对
载脂蛋白E-/-小鼠采用了较少侵入性的消退方案(20),首先,喂饲高胆固醇食物8周,以诱使
动脉粥样硬化病变的发展,然后,切换为正常食物饲喂4周,在此期间给予CD或对照的载体(图.2A)。
正如所料,两个组里与基线相比,血浆胆固醇浓度都下降了,但在对照与CD
治疗之间没有观察到差异(图.2B和图.S2A)。
虽然,切换为正常食物饲喂载体处理鼠,对其动脉粥样硬化的体积没有产生影响,而CD治疗鼠中导致其动脉粥样硬化斑块消退了45%(图.2C)。
虽然,载体处理鼠病变中的CC负载与处理前相比已有减少,不过,CD治疗组
的CC数量则更进一步地减少(图.2D)。
由于心血管病患者通常不能坚持推荐的生活方式改变,包括饮食方面的调整,所以,我们接着研究,CD治疗是否能影响在肠道胆固醇持续危害期间的动脉粥样硬化斑块的消退。
CD或载体处理,高胆固醇食物开始饲喂8周后,并再持续至整个12周(图.2E)。
持续饲喂高胆固醇食物的CD处理鼠,虽然,血浆胆固醇和
总胆固醇代谢没有改变(图•2F和图.S2B),而其动脉粥样硬化斑块的体积和CC负载都减
少了(图.2,G和H)。
这些数据证明,CD处理对缩小已形成斑块是有效的。
CD溶解细胞内外的CCs
有几种可能性来解释CD在动脉粥样硬化的发生和形成方面的保护作用。
因为,我们已测试了CD是否能提高CCs的溶解性,知道了CD与胆固醇能形成可溶性包合物,从而增强胆固醇的水溶性约15000倍。
荧光标记CD与CCs结合(图.3,A和B),CD以剂量依赖性方式促使CCs提高溶解性(图.3C)。
为了使CD在动脉粥样硬化斑块中有效地发生作用,CD也必须作用于细胞内的CCs。
巨噬细胞快速地内化荧光CD(图.3D)和将其浓集于细胞
内的隔室(图.3E)。
此外,CCs与一个亚毒性剂量的10mMCD共孵育,与时俱进地提高了细胞内CCs的溶解性(图.3F和图.S4)。
CD提高了结晶胆固醇的代谢
动脉壁内的巨噬细胞把过量的胆固醇转化为泡沫细胞,这一过程可损害巨噬细胞功能
和促进动脉粥样硬化的发生(21)。
这个过程,可在体外通过给巨噬细胞加载CCs进行模拟
(图.S5)。
CCs被摄入吞噬体后,胆固醇通过C1型尼曼氏集运器被移送至内质网,在此经
乙酰辅酶A(CoA)乙酰转移酶催化形成胆固醇酯。
这种机制,把过量的胆固醇转化成晶体,
该晶体具有细胞毒性,并进入胆固醇酯贮存于脂滴内。
第二个途径,是游离的胆固醇经代谢形成水溶性氧化胆固醇。
氧化胆固醇能跨细胞膜扩散,并已知通过激活LXR(肝X受体),
促使巨噬细胞重新编程,转而调节炎症反应和支持HDL逆向转运胆固醇(RCT)(22-24)。
为了研究CD如何影响巨噬细胞减少源自CCs的胆固醇数量的能力,我们把制备自D6-胆固
醇(D6-CCS)的CCs一起孵育,接着对细胞和细胞的上清液中的D6-胆固醇代谢产物,通
过气相色谱-质谱选择性离子监测(GC-MS-SIM)(图.4A)。
该分析显示,CD治疗促进了源自D6-胆固醇晶体的酯化反应(图.4B)。
此外,CD提高了上清液中D6-胆固醇的浓度,而减少了整个细胞库内的D6-胆固醇(图.4C)。
因此,CD治疗提高了巨噬细胞排出胆固醇的能力,标志着这是冠状动脉病患者中的一个重要保护因子(25,26)。
活跃的胆固醇运输,主
要是通过腺苷5’-三磷酸盐-结合盒式转运蛋白A1和G1(ABCA1和ABCG1介导的,ABCA1转移游离胆固醇给载脂蛋白A1(ApoA1),ABCG1转移成熟的HDL粒子(27)。
巨噬细胞与CCs
共孵育,与观察到提高巨噬细胞排出胆固醇能力相一致的是,增强了ABCA俐ABCG1二者的
表达,这还可由CD的治疗得到更进一步地加强(图.4,D-F)。
涉及驱动胆固醇排出的基因包括Abca1和Abcg1,是受LXR/类视黄醇X受体(RXR转录器控制的(22,28)。
因为LXRs的转录活性是受氧化胆固醇正调节的,我们接着分析了CD是否能增强胆固醇的氧化。
我们
发现了D6-CC-负载巨噬细胞的CD治疗,虽然,Cyp27al的表达没有改变(图.S6),而导致D6-胆固醇中衍生的27-羟化胆固醇(C5-27羟化胆固醇)增加了15倍(图.4G)。
出乎意料地,CD在正常胆固醇血条件下,也增加了27-羟化胆固醇的产生和来自巨噬细胞的分泌,这
意味着,巨噬细胞没有受到D6-CCs的影响(图.4H)。
因此,CD增强了游离胆固醇的代谢,
并也许从而降低了胆固醇相变为晶体的可能性。
CD诱导巨噬细胞中LXR靶基因的表达
在D6-CC负载情况下,CD介导了氧化胆固醇产生的急剧增加,以及意外地发现在正常胆固醇血巨噬细胞中CD可提高氧化胆固醇含量,这促使我们综合地研究CD是否影响LXR
调节基因的表达谱。
野型或LXRa-/-3-/-巨噬细胞暴露于CDCC或CC和CD和基因的表达,
通过汇集全基因组mRNA资料作了评估。
为了研究CD是否改变了巨噬细胞中LXR靶基因的表达,我们用先前鉴定的一批533个LXR靶基因,进行了基因集的富集分析(GSEA(29)。
当野型巨噬细胞与CCs孵育时(图.5B),鉴定了富集的一些LXR靶基因集,可能是因为巨噬细胞胆固醇过负载的缘故。
这与CC衍生的27-羟基胆固醇的强烈诱导、和看到由于CD增加胆
固醇的排出、当CD加入与CCs在一起时富集了一些LXR靶基因集是一致的(图.5B)。
在正常胆固醇情况下,CD单独治疗也导致LXR基因集的富集,这与观察到细胞27-羟胆固醇的诱导是相对应的(图.4H)。
在LXRa‘3'
巨噬细胞中,没有那一种条件可导致LXR靶基因集
的显著富集(图.5C)。
此外,对野型中关键的LXR靶基因ABCA1和ABCG似及在mRNZ和蛋白质水平上的LXRa-/-3-/-巨噬细胞(图.5D-F)(31)等发现有可能被确证。
CD增强了活体中胆固醇的逆向运输(RCT
为了测试CD诱导巨噬细胞的LXR重新编程,是否改善了活体中巨噬细胞胆固醇的排出,给野型骨髓衍生的巨噬细胞(BMDMS或LXR%“-3亠小鼠负载来自体内的D6-CCS和将其注
入野型小鼠腹腔内。
然后,巨噬细胞负载CCs的小鼠用CD或对照载体处理,通过GC-MS-SIM监测D—胆固醇被从粪尿中排出(图.6A)。
CD增强了野型小鼠CCs衍生的D6-胆固醇的逆向运输(RCT,和降低了在LXRa-/-3-/-巨噬细胞中的含量(图.6B)。
值得注意的是,CD处理不仅诱导了D6-胆固醇从粪便中排出,而且还促进了D6-胆固醇从尿中的排除(图.6C),这
一过程,通常不在RCT期间观察到。
之前,关于一种罕见的遗传病尼曼匹克症C型(NPC病)
的工作中,其胆固醇不能从溶酶体逸出,并已表明CD可调动溶酶体胆固醇和激活LXR依赖
的基因表达(32,33)。
目的在于克服这种胆固醇的运输缺陷,给NPC1缺陷患者每周注射一
NPC1突变患者在CD
并存在一个时间依赖部分地以LXR依赖方
次CD为了研究CD是否也能剌激人从尿中排泄胆固醇,我们监测到了注入后期间尿中胆固醇的排泄。
CD主要地是导致胆固醇从尿道排出,
性(图.6D)。
这些数据表明增强了体内胆固醇自巨噬细胞的逆向运输,式,但也可直接地提取和运输胆固醇进行排泄。
CD调节人斑块胆固醇的代谢和基因表达
为了测试CD对鼠巨噬细胞是否具有保护功能,对人动脉粥样硬化斑块是否也发挥作用,我们接着对以颈动脉内膜切除术得到的活检标本,进行了脂质和基因组的分析(图.7A)。
类
似我们在鼠巨噬细胞中的研究结果,我们把人动脉粥样硬化斑块与CD—起孵育,导致了胆
固醇从斑块向上清液的转移(图.7B)。
此外,我们观察到27-羟化胆固醇产量的增加,这主要是由CD处理和斑块释放到上清液里去的(图.7C)。
对静止或处理过的斑块组织中的一大组人免疫相关基因的基因表达谱和选择的LXR靶基因(表S3)进行了分析。
运用几种生物
信息学方法,分析了这些基因的表达数据。
首先,我们在以CD或对照载体处理后,用基因
差异表达(DE对基因本体进行了富集分析(GOEA。
我们发现,结果是与我们的脂质分析相一致的,当一经与CD接触后,在脂质运输、存储、代谢和排出方面所涉及基因的表达,均被上调。
反过来,这样一些述语表达的“基因调节免疫反应淋巴细胞中免疫反应的调节”、"
白细胞介导的免疫调节”或"
白介素反应、T细胞和自然杀伤细胞调节”,在CD处理后,
这些免疫反应均被下调。
基因本体富集分析(GOEA的进一步探究,显示人斑块的CD处理
影响GO术语“炎症反应调节”(GO0050727)中的许多关键基因。
这些包括固有免疫受体,例如Toll样受体(TLRs)2、3、4、7和9;
TLR适配体MyD88炎性体传感器NLRP3和炎性体依赖促炎细胞因子白介素1b(IL-1b)和IL18(图.7E)。
由于我们观察到CD增加了内源性
LXR激动剂27-羟化胆固醇,所以接着我们分析了CD是否调节人动脉粥样斑块中LXR靶基因
的表达。
GSEA(基因富集分析)显示,当与对照处理斑块比较时,CD处理后,LXR靶基因得
到富集(图.7F和表S2)。
此外,在大多数差异表达的基因中发现了许多LXR靶基因(图.7G,
标记红或蓝基因)。
值得注意的是,炎性体传感器NLRP3和炎性体抑制器HSP90(34)是两
个LXR靶基因(24),当与对照组比较时,CD处理导致NLRP3的下调和HSP90的上调(图.7H)。
总之,这些数据表明,CD激活了人斑块中LXR依赖的转录程序,影响胆固醇运输和一些炎
症过程,这些是和动脉粥样硬化的发病机制紧密相关的。
CD的抗动脉粥样硬化作用是LXR依赖的
我们接着测试是否CD介导了在体外分离的巨噬细胞中或处理采自人体内斑块材料中,
反映CD在小鼠中的抗动脉粥硬化的作用。
因为CD治疗降低了LXR调节的细胞因子[IL-1B、
IL-6、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)](图.1,H-J)系统性浓度,并也导致饲喂高胆固醇日粮小鼠主动脉弓内ApoE"
中Abca1和Abcg1的增加(图.S7),我们确定了活体内CD介导的抗动脉粥样硬化作用,是否需要LXR的激活和通过ABCA1和ABCG1使胆固醇从巨噬细胞排出。
我们因此给辐照过的LDLR-小鼠移植野型LXRa亠3-/-骨髓,或剔除巨噬细胞特异的ABCA1
和ABCG啲(MAC-ABC)骨髓。
移植骨髓后,给移植鼠喂饲高胆固醇日粮,同时给以CD或
对照载体8周。
不同的移植组经CD处理,未影响血浆胆固醇的浓度(图.8,A-C)。
除CD处理的移植MAC-AB芒0骨髓的LDLR-小鼠中的HDL有轻微减少外,其脂蛋白谱也仍不改变
(图.S8)。
携带野型骨髓的LDl£
小鼠显示其动脉粥样硬化斑块的体积缩小,证明CD对动
脉粥样硬化的LDLR/-模型也是有效的(图.8D)。
值得注意的,CD对携带LXRa“-3'
骨髓的LDLF-/-小鼠中的病变发展没有影响,这突出地表明LXR的激动作用,对CD介导的抗动脉粥
样硬化是至关重要的(图.8E)。
相比之下,巨噬细胞中的ABCA1和ABCG1缺陷,对CD处理
的有效性不产生影响,这表明CD可绕过这些胆固醇排出通路。
为了更好地了解CD依赖LXR激动剂如何可治疗动脉粥样硬化,我们对移植野型或LXR
a-/-3-/-骨髓的LDL^-小鼠的主动脉组织,进行了全基因组基因表达的分析。
差异表达基因的基因本体富集分析证明,涉及动脉粥样硬化的重要通路包括脂质代谢和炎症,由CD处理
以一种LXR依赖的方式所控制(图.8G)。
类似于我们对人斑块的研究基于CD治疗在重要DE
基因中发现了一些LXR靶基因(图.8H)。
此外,我们对人斑块的观察确认,CD促进NLRP3
抑制剂Hsp90aal的上调,和NLRP3炎性基因以一种LXR依赖方式得到了下调(图.81)。
总之,这些数据表明,在小鼠动脉粥样硬化中观察到CD介导的抗动脉粥样硬化作用,是依赖
于LXR激活和CD在动脉粥样硬化斑块中发挥的多种抗炎作用。
讨论
这里,我们测试了通过药理学方法提高胆固醇的溶解性,对食源性动脉粥样硬化产生了有益的影响,观察到的这种巨大作用和即使在高胆固醇日粮期间的极高胆固醇血情况下,CD具有促使已形成动脉粥样硬化消退的意外能力,不能单用简单的CD巨大作用来解释。
由
于脂质和基因组发现的路径,结合基因缺陷鼠活体中的研究,表明CD主要通过动脉粥样硬
化斑块中的那些重编程细胞来发挥强有力的作用。
CD的作用,是通过增加内源性LXR配体的数量,它类似于一种药物前体,虽然它自己不被代谢,而是促使胆固醇发生药理学的有效代谢。
看来,胆固醇代谢的短暂改变,以及炎症通路与活化的LXR相连接,是这系统中的一个关键的变阻器。
例如,固有免疫被微生物成分或急性时相反应所激活,可抑制如ABCA1
和ABCG1等LXR靶基因的表达,导致胆固醇滞留,这可以各种方式增强炎症反应(35,36)。
这种类型的固有免疫扩增,可能是一种在进化上保守的抗微生物防御机制的一部分(23)。
胆固醇积累的结果增加了LXR激动剂,从而,可平衡炎症反应和增加胆固醇排出、恢复胆固
醇和免疫内平衡。
然而,由于促炎饮食因素过度丰裕和过量的胆固醇,这种平衡就可能转向慢性炎症和胆固醇滞留,驱使动脉粥样硬化的形成。
通过提高胆固醇的溶解性和动员胆固醇排出,因此CD可以使血管系统中的胆固醇正常化和免疫内环境达到稳定。
CD对巨噬细胞的作用,类似于抗动脉粥样硬化因子HDL。
HDL通过ABC转运蛋白减少细胞的过多胆固醇;
此外,HDL对巨噬细胞可有显著的抗炎作用(37)。
然而,HDL不能激活
LXR不过可增加固有免疫通路的一个关键抑制因子转录活化因子的表达(37)。
虽说CD具
有提高HDL介导RCT的能力,而它也可动员胆固醇直接地分泌到尿和粪中去。
这些数据表明,
CD可绕过ABCA1和ABCG1介导激活胆固醇的排出。
与这些观察相一致的,我们的骨髓移植研究表明,CD的抗动脉粥样硬化作用,是独立于ABCA1和ABCG1介导的激活胆固醇排出过
程的。
这是和最近研究结果的显示相一致的,合成的LXR激动剂介导的抗动脉粥样硬化作用
是独立于巨噬细胞ABCA1和ABCG1W(38)。
我们的研究有几个局限性。
首先,虽然我们的数据证明,CD在斑块巨噬细胞中促进了
LXR的活化,而LXR在髓细胞中由CD介导的抗动脉粥样硬化作用是需要的,但我们还不能排除其他的未鉴定通路。
这是可能的,CD介导的抗动脉粥样硬化作用是多因子的,例如,
在生理上增加胆固醇的溶解性、促进胆固醇代谢和从巨噬细胞中排出,以及它的抗炎症性能,这些是不能够轻易分开的。
第二,虽然我们的数据鉴定了作为在CD处理时主要的LXR激动
剂27-羟化胆固醇,不过,其他内源性氧化胆固醇也可能促成LXR的活化。
在这种情况下,
一些调控酶如Cyp27A1的功能活动以及其在特定类型细胞中的作用,将是有吸引力的。
第三,虽然我们用颈动脉斑块所做的体外实验表明,CD在人类疾病中可诱导抗动脉粥样硬化通路,
不过,用特定的临床试验来验证这些实验结果是必要的。
临床前模型显示,LXR激动剂在预防小鼠动脉粥样硬化中的有效性(39)和促使动脉粥样硬化的消退(40),对LXR激动剂在动脉粥样硬化治疗中的临床应用,提供了一个有希望的前景,但是,临床中治疗分子学的进展,受到了其肝毒性和脂肪生成作用的阻碍(41)。
另一方面,CD已在临床上用于人类亲脂性药物的递送,并没有显示有相关的毒性。
因此,把CD再用于动脉粥样硬化的治疗或预防将是可行的。
我们的研究为通过提高巨噬细胞胆固醇的溶解性和消除性的疗法,提供了一个重要的证明,这对动脉粥样硬化的治疗,可能是一个有效的策略。
材料和方法
研究和设计
我们课题的主要目的是研究CD是否具有抗动脉粥样硬化的作用,和鉴定由CD介导的主要机制。
为此,我们采用动脉粥样硬化小鼠模型,在体外研究巨噬细胞的生物学,和用采自人体的动脉粥样硬化斑块进行间接的体内试验。
各个实验的细节说明如下。
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