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尽管细胞培养具有很多优点,但也存在一定的不足。
其最根本的问题是尽管培养技术不断发展,并努力创造条件以模仿动物体内的状态,但体外培养的组织或细胞与体内相比仍然存在着较大的差异,特别是细胞分化的问题。
可以说,任何组织或细胞经过体外培养后,其细胞形态和功能都会发生一定程度的改变。
因此对于体外培养的细胞,应该把它们视为一种既保持动物体内原细胞的一定性状、结构和功能又具有某些改变的特定细胞群体,而不能将之视为与体内相应的细胞完全等同。
另外,体外长期培养的细胞,尤其是经过反复传代、长期培养者,有可能发生染色体非二倍性改变等情况。
但从总体上来说细胞培养确实是一种研究活组织和细胞的良好方法。
利用这一技术,可进行多方面的研究。
归纳起来,可有以下四个方面:
(1)细胞与细胞之间的相互作用。
如细胞与细胞之间的粘附作用、接触抑制、细胞识别以及密度抑制等;
(2)细胞内部与细胞外界环境之间的作用,如细胞对外界刺激的反应、药物对细胞的作用、细胞内产物的分泌等;
(3)细胞内细胞质的各种生理活动,如能量代谢以及细胞内核酸、蛋白质的合成等;
(4)细胞质与细胞核之间的物质信息流动,如RNA从细胞核到细胞质的移动、激素受体复合物的移位等。
总之,目前细胞培养仍然是细胞生物学研究方面的一项十分重要的技术,应用范围极为广泛,如病毒学、细胞免疫学、遗传学、细胞的分化与发育、肿瘤细胞学、细胞生物化学、细胞的超微结构、原生质体培养、细胞工程以及临床医学及生物技术方面的应用等方面,都需要借助于这一项技术。
因此,它的发展前途是不可估量的。
第二节培养细胞的特性
一、培养细胞的生长方式及类型
细胞离体培养时,失去了神经和体液的调节以及细胞之间广泛相互影响的制约关系,因此离体培养细胞与体内并不完全相同。
体外培养的细胞,根据能否贴附于支持物上生长的性质,主要可分为贴附型和悬浮型两类:
(一)贴附型:
大多数培养细胞呈贴附生长,属于贴壁依赖性细胞。
根据其形态大致可分为以下四种类型:
1.成纤维样细胞型:
细胞呈梭形或不规则的三角形,中央有卵圆形细胞核,细胞质向外伸出突起。
细胞在生长时呈放射状、火焰状或漩涡状走行。
由中胚层间充质起源的细胞,如心肌、平滑肌以及成骨细胞等常呈本型形态。
2.上皮样细胞型:
细胞成扁平不规则多边形,中央有圆形核。
细胞彼此紧密相连形成单层膜,生长时呈膜状移动,处于上皮边缘的细胞总与膜相连,很少脱离细胞群体单独活动。
起源于内、外胚层细胞如皮肤表皮及其衍生物;
消化管上皮;
血管内皮、肝、胰和肺泡上皮等皆属本型细胞。
3.游走细胞型:
本型细胞在支持物上散在生长,一般不连接成片,细胞质经常伸出伪足或突起,呈活跃的游走或变形运动,速度快且方向不规则。
此型细胞不稳定,有时难以和其它类型的细胞相区别。
4.多形细胞型:
某些组织的细胞,如神经组织的细胞等,难以确定其规律和稳定的形态,可统归于此型。
(二)悬浮型:
见于特殊的细胞,如某些类型的癌细胞和白血病细胞,细胞形状为圆形,适于繁殖大量细胞。
(三)贴附兼悬浮型:
如B95-8和某些肿瘤细胞如SGC7901等既可呈现贴附生长,也可表现为悬浮生长。
当培养条件良好时,细胞形态上有相对的稳定性和一致性,在一定程度上反映细胞的起源,以及正常和异常(恶性)的区别,可作为细胞形态学的一个指标和依据。
二、细胞形态结构
培养细胞与体内细胞的形态相似,亦由细胞膜、细胞质和细胞核三部分组成,但大体形态与体内细胞有显著区别。
根据细胞是否贴附于支持物上生长,其形态可有以下几种不同的表现:
1.呈悬浮状态生长时,不论原来属于哪种类型的细胞,由于生长在液体环境中,受液体表面张力的影响,所有的细胞都呈圆形。
2.如附于支持物表面之后,开始仍为圆形,但为时甚短,经过形态过渡,逐渐恢复成原细胞形态。
3.一般在附于支持物上数分钟以后,即由球形移行成圆饼形。
这种状态的细胞称为放射延展细胞(redialspreadcell),可分为两部分:
A中心区(内质)中央为细胞核,核周细胞质稠密,即内质,含有各种细胞器。
B板层区(外质)是细胞质的外周部分,无色透明,包绕内质,不含细胞器,外质周边为圆形,但常有伪足伸出或回缩。
4.经过一定时间以后,延展细胞过渡为极性细胞(polarizedcell),极性细胞可呈纺锤形、扇形、三角形或星形等多种形态,并随运动而变动。
它们的外质周边有活跃与不活跃两部分:
不活跃部分较稳定;
活跃部分常有伪足伸出,使细胞发生定向运动。
有时细胞贴附于支持物后,也可不经放射延展阶段直接变为极性细胞。
成纤维细胞形态变化过渡与上述过程基本上一致。
上皮细胞略有所不同,经过延展细胞后进入极性细胞,细胞相连接嵌合成片,而且多数细胞的周边部分似乎并无活跃部与不活跃部的区别。
三、培养细胞的生长特点
(一)粘附
细胞粘附并伸展,是多数离体培养细胞的基本生长特点。
虽然血细胞如淋巴细胞在活体体内并无聚集的倾向并在体外可于悬浮状态下生长,但是大多数哺乳动物细胞在体内和体外均需附着一定的基质而生长,在体外这些基质可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。
培养细胞在未贴附于基质之前一般均似球形体,一旦与基质贴附后,细胞将逐渐伸展而形成一定的形状,表现为成纤维样细胞或上皮样细胞等。
细胞粘附于基质并非一种耗能的过程,但与电荷有关。
据资料记载,370C时在2min内细胞之间即可形成键,这键种可对0.01%胰蛋白酶起作用且仅发生于细胞之间,而细胞与基质之间则无,8min后才有稳定的键形成。
一些特殊的促进细胞粘附的因子如基膜素、纤粘蛋白、层粘蛋白、III型胶原、血清扩展因子等,可能参与细胞的粘附过程。
这些促细胞粘附因子均为蛋白质,存在于细胞膜表面或培养液或者血清之中。
在培养过程中,这些带正电荷的促细胞粘附因子先吸附于底物上;
悬浮的圆球形细胞再与已吸附有促细胞粘附因子的底物附着,之后细胞逐渐伸展成原来的形态。
一般来说,从底物脱离下来的贴附型生长细胞,不能长期在悬浮状态下生长而逐渐退变,除非这是一些转化了的细胞或恶性肿瘤细胞。
细胞的粘附和伸展,首先底物需具备一定的条件(如促细胞粘附因子等),另外尚受一些因素的影响,如:
(1)离子的作用,细胞粘附需要Ca2+的存在,低Ca2+培养液不利于细胞的伸展;
(2)机械、物理因素也可影响细胞粘附,低温或培养液流动过快均会影响细胞粘附;
(3)某些生物因素对细胞的粘附可能有影响,表皮生长因子(EGF)可刺激神经胶质细胞的皱褶活动,成纤维细胞生长因子(FGF)能减少3T3细胞在底物上的扁平程度。
(二)接触抑制及密度依赖性
接触抑制是离体培养细胞中某些贴附型细胞的生长特征之一。
离体培养细胞在生长过程中通过细胞分裂而增殖。
以成纤维细胞为例,一般情况下,正常细胞存在有连续的活动或和移动,其外周细胞膜呈现特征性皱褶样活动。
但是当两个细胞移动而相互靠近时,其中之一个或两个都停止移动并向另一方向离开,这就保证了细胞不会相互重叠。
当一个细胞被其它细胞围绕使得无处可去而发生接触时,细胞不再移动,在接触区域细胞的膜皱褶活动亦告停止,此即接触抑制(contactinhibition)。
因此,一般情况下正常细胞并不会相互重叠生长,但是转化细胞或恶性细胞则接触抑制下降,细胞之间可以相互重叠生长。
正常情况下,当细胞生长、融合形成单层时,细胞变得比较拥挤,以致细胞扁平的程度变小,与培养液接触的表面区域亦因此减少,同时培养液中的一些营养物质将逐渐消耗殆尽,尤其是紧靠细胞周围的部位,这样形成的单层细胞,分裂将逐渐停止。
如3T3细胞,在细胞稀少状态下培养时,其生长速度很快,一旦细胞生长形成融合单层细胞后,细胞分裂停止,这种细胞可在静止状态下存活一段时期,但不再发生分裂增殖,其确切的细胞密度与培养液中的血清浓度有关。
上述细胞的这种生长特性即为密度抑制或密度依赖性调节。
转化细胞或恶性细胞则与正常细胞不同,其密度抑制常常降低,因而可以形成很高的细胞密度。
(三)培养细胞的生长过程
1.单个细胞的生长过程
培养细胞的细胞周期较短,细胞增值大于细胞的损耗,属于生长旺盛的细胞群体。
但细胞在培养过程中,细胞周期并不恒定,常随培养阶段不同而有所变化,如在接种或传代后,细胞并不立即进入活跃的周期活动。
一般先要经过一个潜伏期,潜伏期是细胞适应或同化培养基的过程,不同培养细胞的潜伏期的长短不一样。
一个细胞周期是一次细胞倍增的时间,各种细胞倍增的时间不同,一般需1848h,按每毫升培养液51042105个细胞计量接种,到细胞在支持物上长满进行一分为二的传代过程,称做一代(generation)。
但实际上细胞能倍增6-7次,因此培养中代的概念只指从上一次接种到下一次接种再培养所需要的时间,并不等于一个细胞周期。
分裂细胞所占不分裂细胞与分裂细胞之和的千分值称分裂指数(mitoticindex,MI)。
接种细胞经过潜伏期后,开始出现分裂相,并增多,分裂指数也不断提高,随即进入对数生长期(logarithmic或exponentialphase)。
在细胞培养一代中,指数生长期可连续2-8天,由此可观察到各个不同时期的分裂相。
培养中的细胞仍以有丝分裂的方式进行繁殖。
细胞分裂阶段即M期,M期是细胞周期的终结期。
处于分裂中的细胞称为分裂相。
细胞分裂状态和分裂相的多少是判定细胞生活状态的重要指标。
培养细胞的有丝分裂与活体细胞的大体上一致。
细胞分裂全程持续时间一般为30-100min,但因细胞种类不同和温度及营养状况而异,分裂时间的长短也不尽相同。
2.每代细胞的生长过程
置于体外培养的原代培养细胞,若条件合适,将会生长繁殖。
在培养器皿中,细胞繁殖到一定程度后,供给细胞生长的区域被细胞占满,培养液中的营养物质也逐步消耗殆尽,如不即使传代,原代培养细胞会逐渐死亡。
原代培养细胞传代后即为细胞系,成为第二代培养细胞,以后可以继续传代。
有限生长的细胞系经过一定的传代次数后,最终逐步衰退死亡。
无限生长的细胞系或连续传代细胞系则因其不死性而可无限地传代、生长。
在细胞生长过程中,繁殖到一定密度后,将之分开而转移到新的培养器皿中(即接种),使之继续繁殖生长,即为传代。
细胞自接种到新的培养器皿中到下一次再次传代之间的时间间隔为细胞的一代。
每代细胞的生长过程可分为三个阶段:
细胞先进入缓慢生长的滞留阶段,以后为快速增殖的指数生长期(或称对数生长期);
最后达到生长停滞的平台期。
以下以贴附生长型细胞为例说明:
(1)停滞期:
包括悬浮期(游离期)及潜伏期。
当细胞接种到新的培养器皿中,不论何种细胞类型、其原来的细胞形态如何,此时细胞的细胞质回缩,胞体均为圆球形。
细胞先悬浮于培养液中,短时间后,那些可以存活的健康细胞,即开始附着于支持底物,并逐步延伸,恢复其原来的形态。
再经过一短暂的潜伏期,此时细胞已存活,具有代谢及运动但尚未有细胞增殖,以后分裂细胞逐渐增多而进入指数生长期。
一般细胞滞留期的时间不长,约为24-6h,肿瘤细胞及连续传代细胞则更短,可少于24h。
(2)指数生长期:
亦称对数期。
这一时期的细胞增殖旺盛,成倍生长繁殖,活力最佳,适用于实验研究。
细胞增殖状况可以从细胞倍增情况(群体倍增时间)及细胞分裂指数等来判断。
在此阶段,若细胞处于理想的培养条件,将不断生长繁殖,细胞数量逐渐增加,最终细胞将长满融合形成细胞片,并逐渐铺满培养器皿底物,提供细胞生长的区域逐渐减少甚至消失。
因接触抑制而使细胞运动停止、密度抑制而使细胞终止分裂。
细胞不再繁殖而进入平台期。
此期的时间长短随细胞本身特性和培养条件的不同而不同,一般可维持3-5天。
(3)平台期:
亦称生长停止期。
此期可供细胞生长的底物面积已为生长的细胞所占满,细胞虽尚有活力但已不再分裂繁殖。
此时细胞虽已停止生长,但仍有细胞的代谢活动并可继续存活一定时间。
若及时分开培养,进行传代,并补充以新鲜培养液,细胞将于新的培养器皿中成为下一代的细胞而再次增殖。
否则,若传代不及时,细胞会因中毒而发生改变,甚至脱落、死亡。
每次细胞传代接种后,细胞的这些生长繁殖过程,若进行细胞计数,可以以时间为横坐标,细胞数量为纵坐标绘制为生长曲线。
各细胞的生长曲线都具有自己的特点,是该细胞的生物学特性之一。
3.细胞系的生长过程
取自动物并置于体外培养中生长的细胞在其传代之前的培养过程称为原代培养(primaryculture),其细胞为原代培养细胞。
培养的细胞是生长于培养器皿之中的。
当细胞持续生长繁殖一段时间,到达到一定的细胞密度后,就应当将细胞分离成两部分(或更多)至新的培养器皿中并补充新培养液进行培养,此即称为传代培养(subculture)。
原代培养细胞一旦经过传代后,便称为细胞系(cellline)。
一般正常细胞的细胞系只能维持一定的时间界限,称为有限生长的细胞系。
因此,在体外培养细胞时,其寿命并非是无限的。
当细胞自动物体内取出后,在培养中大多数的细胞仅能维持生长一段有限的时间,然后逐渐衰退死亡。
这时即便提供这种细胞所需要的包括血清在内的全部营养物质,细胞仍然会死亡。
细胞系在体外存活时间的长短,主要取决于细胞来自何种动物。
例如:
人胚成纤维细胞约可维持50代,恒河猴的皮肤成纤维细胞在体外培养时可以超过40代,鸡胚成纤维细胞在培养中最多只有少数细胞群体可以扩增30多代,而小鼠成纤维细胞的寿命最短,正常者多数只能传代8次左右。
在体外培养时,不同组织来源及取自不同年龄的人成纤维细胞的平均寿命也不尽相同。
例如从老年个体取得的成纤维细胞的平均寿命比年轻者短。
此外,可能影响培养细胞寿命的因素还有培养条件,如在培养上皮细胞的培养液中加入表皮生长因子,则可以延长其寿命,某些细胞可从50代延长到150多代。
虽然,体外培养细胞一般最终的命运是死亡,但还是可以生存一定时间。
如培养成纤维细胞,若从106个细胞开始,理论上说成倍生长50次即可繁殖105250个细胞。
因此,若一直按一定的要求操作维持其生长,一个培养物可以利用相当长的一段时间。
体外培养细胞寿命的过程一般可以划分为三个阶段:
(1)原代培养期:
原代培养期为新鲜组织自体内取出并在体外生长至第一次传代之间的时期,通常为1-4周。
这一时期的细胞成分比较复杂,具有很高的异质性,含有较少的生长细胞,为二倍体细胞。
细胞移动比较活跃,有细胞的分裂但并不旺盛。
原代培养的细胞与体内相应细胞的性状相似,更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性。
因此是一些实验如药物干预实验等的良好工具,但细胞类型比较复杂,需要引起足够的重视。
(2)传代期:
原代培养的细胞生长到一定时间后,如贴附型细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面,此时应将原代培养细胞接种到两个或多个新的培养器皿中,即传代。
这样就由原代培养物形成了细胞系,一般为有限生长的细胞系。
传代大约数天至一周左右即可进行一次,传代时间间隔主要受细胞生长情况而定。
传代期的细胞生长旺盛,一般仍然是二倍体细胞,并保留原组织细胞的很多特征,但随着长期的反复传代,细胞即逐渐失去二倍体性质,到一定时间后(一般为30-50代)细胞增殖逐步变慢进而停止分裂而进入衰退期。
(3)衰退期:
一般有限生长的细胞系在这一时期细胞开始时虽然存活,但细胞增殖很缓慢并逐渐完全停止,进而细胞衰退、死亡。
在体外培养细胞的生命周期中,有所谓“危机期”(crisis)。
有限细胞系在生长过程中若不能通过危机期将进入衰退期最后全部死亡。
但并非所有原代培养的后代细胞最后都全部死亡,偶尔有少数细胞能安全度过危机期,获得不死性而具有持久或无限繁殖能力,这种细胞系即称为无限生长的细胞系,或连续传代细胞系。
培养细胞无限繁殖能力的是否能够获得,与其种族、来源及性质有关。
鸡细胞在数次传代后即可死亡,即使是鸡的肿瘤细胞也不例外。
一般来说,人的细胞,尤其是肿瘤细胞更有可能无限地生长,而啮齿类的胚胎细胞则很容易形成不死的连续细胞系。
到目前为止,国内外已建立了许多细胞系,其中大多数来自肿瘤,部分细胞系的特征表1-1:
表1-1某些常见细胞系的特征
细胞
来源
特征
种族
组织
形态学特点
悬浮生长性
3T3
鼠(2N=40)
内皮
成纤维细胞
否
L
鼠(2N=40)
结缔组织
能
CHO
中国仓鼠(2N=22)
卵巢
K562
人(2N=46)
慢粒白血病
淋巴细胞
Hep
咽喉癌
上皮细胞
HeLa
宫颈肿瘤
HL-10
白血病
KB
鼻咽癌
第三节培养细胞的生长条件
离体培养细胞需要合适的环境和必需的条件才能生存、繁殖。
一、细胞的营养需要
体外培养的细胞,首先需要能提供其生存所必需的营养条件。
在细胞培养技术发展的早期,多数细胞是在血浆或血纤维蛋白原凝块中,或在胚胎组织等提取物中进行生长的。
后来人们经过反复的研究,证实体外培养细胞如体内细胞一样需要一些基本营养物质及促进细胞生长的因子等物质。
(一)基本营养物质
体外培养细胞的生长必需一些基本的营养物质,如氨基酸、维生素、碳水化合物以及一些无机离子。
氨基酸是组成蛋白质的基本单位,有12种氨基酸对于培养细胞来说是必不可少的,包括亮氨酸、异亮氨酸、胱氨酸、精氨酸、组胺酸、色氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、缬氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸,另外尚需谷氨酰胺。
维生素是维持细胞生长的生物活性物质,其中有些是不可少的,如烟酰胺、叶酸、核黄素、VitB12、泛酸、吡哆醇及VitC。
碳水化合物提供细胞的能源,其中主要是葡萄糖。
此外,培养细胞的生长尚需要钠、钾、镁、钙、磷、氮等基本的无机离子,这些都是细胞组成所必需的并参与细胞的代谢活动。
(二)促细胞生长的因子
体外培养细胞既需要基本营养物质,还需要促进细胞生长的因子等物质才能正常生长、繁殖。
除了促生长因子外,激素也可有助于细胞生长。
如氢化可的松对皮肤上皮细胞及乳腺上皮细胞的生长具有促进作用。
血清中含有多种细胞生长所必需的生长因子,有利于多数细胞的存活和生长,但同时也有一些组分不明以及某些对细胞生长甚至有害的成分。
二、细胞的生存环境
除了满足营养的需要外,培养环境还必须具备细胞生存并繁殖的生理学上能够接受的理化特性。
包括:
温度,气体和pH等。
(1)温度:
体外培养细胞需要在一定恒温的环境中才能生长繁殖,其适宜的温度以接近体内生活状态的细胞为宜。
因此。
在达到有限的值之前,一般细胞繁殖速率因培养温度的升高而加快,但当温度进一步升高超过此限定值后,繁殖速度迅速降低。
人和其它哺乳动物细胞的培养温度为36-380C,鸟类的体温较高,因此在38.50C时生长较好而在36.50C生长减慢;
小鼠的表皮在较低的温度如340C也可以生长,而冷血动物的培养温度则是在接近该种动物理想体温上限的温度时较好。
培养温度如不适当,将会直接影响细胞的代谢及生长,甚至发生死亡。
一般说来,高温比低温对细胞的影响更为明显,在较低的温度时,如25-350C时,细胞的生长速度虽然减慢,但仍然能够生存;
细胞在40C下能够存活数天,只要温度不低于00C,细胞的代谢虽然受到抑制,但伤害作用并不很严重,若加低温保护剂甚至可于-1960C冷冻。
细胞置于高温则不同,不能忍受温度升高20C持续2小时。
在41-420C中培养1小时,损伤严重,到430C以上则多数细胞将死亡。
(2)气体和氢离子浓度:
体外培养细胞需要一理想的气体环境,包括主要为O2和CO2,但其含量必须适当。
多数细胞需要在有O2条件下才能生长,氧张力通常维持在略低于大气状态,若O2分压超过大气中的氧含量,可能对某些细胞的生长有害。
体外培养细胞采取开放培养时,其气体环境一般为95%空气加CO2的混合气体。
CO2为细胞生长所必需,同时又是细胞代谢的产物,并与维持培养液的pH有关,增加CO2将使培养液的pH下降。
各种细胞对pH的要求不尽相同,大多数细胞适于在pH7.2-7.4条件下生长,低于pH6.8或高于pH7.6可能对细胞的生长有害,甚至退变或死亡。
一般说来,细胞对碱性不如对酸性的变化耐受,偏酸的条件比偏碱的条件对细胞的生长更有利。
为了使培养环境的pH保持稳定,多采用在培养液中加入磷酸缓冲盐等缓冲剂的方法。
尽管如此,对于原代培养细胞可稍偏酸,传代培养细胞或血细胞培养物培养液可略微偏碱
(3)渗透压:
多数培养细胞对渗透压有一定范围的耐受能力,理想的渗透压环境随细胞类型和物种而异。
人胚肺成纤维细胞于250-325mmol/L下生长状况较好,由于人类血浆的渗透压约为290mmol/L,因此可以认为这是体外培养人类细胞的理想渗透环境。
而鸡胚成纤维细胞大约为275-325mmol
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