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荧光光谱技术
第二章荧光光谱技术
16世纪,西班牙科学家NicholasMonardes观察到,贮放在由菲律宾紫檀木制成的杯中的水会发出一种神奇而迷人的蓝光。
到17世纪,Boyle等其他科学家也观察并记载了类似的发光现象。
1864年,英国物理学家GeorgeStokes首先提出发光现象作为一种分析方法,他在1852年发表的关于发光现象的基础性论文以及随后的一系列研究工作,奠定了至今还在使用的许多发光概念的基础。
1978年,T.C.O’Haver在其论文里对发光现象及研究做了历史考证和评述(王镇浦等,1989)。
发光光谱法作为最古老的分析方法之一,目前仍然得到极为广泛的应用。
荧光光谱分析技术具有灵敏度高(比紫外-可见分光光度法高2~3个数量级),选择性好,工作曲线线性范围宽,而且能够提供激发光谱、发射光谱、发光强度、发光寿命、量子产率、偏振和各向异性诸多信息等优点,已经成为一种重要的痕量分析技术。
它在生物、医学、药物、环境、石油工业等领域都有广泛的应用。
随着科学技术的发展,激光、微机、电子学等新技术的引入,不仅大大推动了荧光分析法在理论上的发展,促进了诸如时间分辨、相分辨、荧光偏振、荧光免疫、同步荧光、三维荧光技术和荧光光纤化学传感器、荧光光纤免疫传感器等荧光分析新方法和新技术的发展,同时促使各种新型荧光分析仪器的出现(王镇浦等,1989;赵藻藩等,1990)。
§2.1光致发光原理
基本说来,光致发光是分子受光子激发后发生的一种去激发过程。
在吸收紫外和可见电磁辐射的过程中,分子受激跃迁到激发电子态。
多数分子将通过与其他分子的碰撞,以热的形式散发掉多余的这部分能量;部分分子则以光的形式释放出这部分能量,放射出光的波长不同于所吸收辐射的波长。
后一种过程称为光致发光。
从本质上讲,光致发光是一种涉及光子的激发-去激发过程。
下面将对此过程作一描述。
§2.1.1荧光的产生
室温下,大多数分子处于基态的最低振动能层。
处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被激发为激发态。
激发态不稳定,将很快衰变为基态。
下面将主要从分子结构理论来讨论荧光产生机理。
每个分子具有一系列严格分立的能级,称为电子能级,而每个电子能级中又包含一系列振动能层和转动能层,见图2.1。
图中基态用S0表示,第一电子激发单重态和第二电子激发单重态分别用S1和S2表示。
T1为第一电子激发三重态。
图2.1荧光和磷光体系能级图
电子激发态的多重度用M=2s+1表示,s为电子自旋量子数的代数和,其数值为0或1。
根据Pauli不相容原理,分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向,即自旋配对。
假如分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的,即s=0,分子的多重度M=1,该分子体系便处于单重态,用符号S表示。
大多数有机分子的基态是处于单重态的。
分子吸收能量后,若分子在跃迁过程中不发生自旋方向的改变,这时分子处于激发单重态,如图2.1中的S1和S2。
如果分子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变,这时分子便具有两个自旋不配对的电子,即s=1,分子的多重度M=3,分子处于激发三重态,用符号T表示。
处于分立轨道上的非成对电子,平行自旋要比成对自旋更稳定些(洪特规则),因此三重态能级总是比相应的单重态能级略低,如图2.1中的T1。
处在激发态的分子不稳定,它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁等去活化过程返回基态,其中以速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。
有以下几种基本的去活化过程,⑴振动驰豫(Vibrationalrelaxation);⑵荧光发射;⑶内转换(Internalconversion);⑷外转换(externalconversion);⑸系间跨越(Intersystemcrossing);⑹磷光发射(见图2.1)(王镇浦等,1989;赵藻藩等,1990)。
§2.1.2荧光和分子结构的关系
分子产生荧光必须具备两个条件:
⑴分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构,才能够吸收激发光;⑵吸收了与其本身特征频率相同的能量后,必须具有一定的荧光量子产率。
荧光量子产率(φ)也称荧光效率或量子产率,它表示物质发射荧光的能力,通常应用下式表示:
许多吸光物质并不能够发射荧光,因为在激发态分子释放激发能的过程中除荧光发射外,还有许多上述的辐射和非辐射跃迁过程与之竞争。
荧光量子产率与上述每一个过程的速率常数有关。
用数学公式表示如下:
式中kf为荧光发射过程的速率常数,Σki为其他有关过程的速率常数的总和。
从上式可知,凡是能使kf值升高而使其他ki值降低的因素,都能使荧光增强。
一般而言,kf值主要取决于化学结构,而Σki则主要取决于化学环境,同时也于化学结构有关。
(1)跃迁类型:
实验表明,大多数荧光物质都是由
或者
跃迁激发,然后经过振动驰豫或其他无辐射跃迁,再发生
或
跃迁而产生荧光,其中
跃迁的量子效率较高。
这是由于
跃迁的摩尔吸光系数比
跃迁的大100~1000倍,
跃迁的寿命(10-7~10-9s)比
跃迁的寿命(10-5~10-7s)短,因此kf值较大;此外,
跃迁过程中,通过系间跨越跃迁至三重态的速率常数也较小,也有利于荧光的发射。
(2)共轭效应:
含有
跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强。
这种体系中的
电子共轭程度越大,则
电子非定域性越大,越易被激发,荧光也就越易发生,而且荧光光谱将向长波移动。
任何有利于提高
电子共轭度的结构改变,都将提高荧光效率,并使荧光波长向长波方向移动。
(3)刚性平面结构:
多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光,因为这种结构可以减少分子的振动,使分子与溶剂或其他溶质分子的相互作用减小,即减小了碰撞去活化的可能性。
例如芴和联苯在同样条件下,其量子产率分别为≈1和0.18,芴中的亚甲基使分子的刚性增强,导致两者在荧光性质上的显著差异。
(4)取代基效应:
芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有显著影响。
一般而言,给电子基团,如-OH、-OR、-NH2、-CN、-NR2等,由于产生了
共轭作用,增强了
电子共轭程度,使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大,使荧光增强。
而吸电子基团如-COOH、-C=O、-NO2、-NO、卤离子等,会减弱甚至使荧光猝灭。
此外,溶液中的溶解氧,由于顺磁性的氧分子与处于激发单重态的荧光物质分子作用,促进形成顺磁性的三重态荧光分子,加速了系间跨越,从而导致产生了荧光猝灭现象(赵藻藩等,1990)。
而一些顺磁性金属离子(如Cu、Hg、Zn等)也能够使荧光猝灭,可能与氧的猝灭作用类似。
这一现象是利用荧光猝灭滴定技术研究有机质与金属离子相互作用的基础。
§2.2影响荧光强度的因素
在谈论荧光强度的影响因素之前,首先讨论一下荧光强度与溶液浓度的关系。
荧光强度
正比于吸收的光量
与荧光量子产率
又根据Beer定律
和
分别为入射和透射光强度。
将此式代入上式得到
式中
为摩尔吸光系数,
是样品池光程,
为样品浓度。
而式中
当
时,可省略第二项之后各项,简化得到
则有
当入射光强度
与光程
一定,得到
即荧光强度与荧光物质的浓度成正比。
但是,这种线性关系只有在极稀的溶液中,当
时才成立。
对于较浓的溶液,由于荧光猝灭现象和自吸收等原因,使荧光强度与浓度之间不呈线性关系。
上述这种关系是应用荧光光谱研究不同来源溶解有机质的DOC含量与荧光光谱强度之间关系的理论基础。
下面就影响荧光强度的一些因素作一小结。
§2.2.1溶剂对荧光强度的影响
溶剂的影响可分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应,前者指的是溶剂的折射率和介电常数的影响;后者指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用,如氢键的生成和化合作用。
一般溶剂效应是普遍的,而特殊溶剂效应则取决于溶剂和荧光体之间的化学结构。
特殊溶剂效应所引起荧光光谱的移动值,往往大于一般溶剂效应所引起的影响。
由于溶质分子与溶剂分子之间的作用,使同一种荧光物质在不同溶剂中的荧光光谱可能会有显著差异。
如果溶剂和荧光物质形成了化合物,或者溶剂使荧光物质的电离状态发生改变,则荧光峰位置和强度都会发生较大改变。
§2.2.2温度对荧光强度的影响
温度对荧光强度的影响比较敏感,因此荧光分析时一定要控制好温度。
温度上升使荧光强度下降,其中一个主要原因是分子的内部能量转化作用。
当激发分子接受额外热能时,有可能使激发能转化为基态的振动能,随后迅速振动驰豫而丧失振动能量。
另外一个原因是溶液温度下降时,介质粘度增大,荧光物质与溶剂分子的碰撞也随之减少。
相反,随着温度上升,碰撞频率增加,使外转换的去活化几率增加。
由于荧光物质在低温下荧光强度比在室温下有显著增强,为了提高灵敏度,近年来低温荧光分析已发展成为荧光分析中的一个重要分支。
§2.2.3溶液pH值对荧光强度的影响
带有酸性或碱性基团的多数芳香族化合物的荧光一般都与溶液的pH有关。
因此在荧光分析中要严格控制溶液pH值。
§2.2.4内滤光作用和自吸收现象
溶液中若存在着能够吸收激发或荧光物质所发射光能的物质,就会使荧光减弱,这种现象称为“荧光内滤作用(Innerfilteringeffect)”。
例如,在1μg·cm-3的色氨酸溶液中,如果存在K2Cr2O7,由于在色氨酸的激发和发射峰附近正好是K2Cr2O7的两个吸收峰,吸收了色氨酸的激发能和色氨酸发射的荧光,使测得的色氨酸荧光大大降低。
内滤光作用的另外一种情况是荧光发射光谱的短波长一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。
在溶液浓度较大时,一部分荧光发射被自身吸收,产生所谓的“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度(王镇浦等,1989;赵藻藩等,1990)。
§2.3荧光光谱实验技术
§2.3.1时间分辨技术
时间分辨发光光谱技术是基于不同发光体的发光衰减速率的不同,配置使用带时间延迟设备的脉冲光源(闪光灯或激光器)和带有门控时间电路的检测器件,通过选定延迟时间td和门控时间tg,对发射单色器进行扫描,得到时间分辨发射光谱,从而实现对光谱重叠但是发光寿命不同的组分进行分辨和分别测定。
或者固定激发与发射波长,对门控时间扫描,得到发光强度随时间的衰减曲线,从而实现发光寿命的测量。
时间分辨技术还能够利用不同发光体形成速率的不同进行选择性测定(陈培榕等,1999)。
由于荧光寿命相比磷光寿命要短得多,所以磷光更有利于时间分辨技术的实施。
本论文由于只涉及到天然水体中溶解有机质的荧光光谱特征,所以未使用时间分辨技术对DOM进行研究。
§2.3.2偏振和各向异性
在偏振光激发下,荧光体所发射的荧光在空间不同取向其强度不同,即偏振光。
荧光偏振和各向异性测定只需要在荧光光谱分析仪的激发和发射光路上分别加上起偏器和检偏器(统称偏振附件)。
分子荧光的偏振现象最初由Perrin在1926年发现,后来他用此方法研究溶液中分子的运动及其构型变化。
荧光偏振就是用平面偏振光去探测溶液中分子旋转的速率变化。
只有在电子的迁移力距平行于入射偏振光的平面时,入射偏振光才能被分子所吸收。
吸收了偏振光的分子在返回基态时就发射以电子的迁移力距相平行的偏振光。
但是,如果分子在溶液中旋转,那么该偏振光将会由于电子迁移力距方位的变化而发生去偏振现象(depolarization,即偏振值降低)。
因此,分子发射的偏振光可与溶液中分子旋转的速率相对应。
而溶液中分子旋转的速率又与分子的几何结构有关,因为分子的形状决定了分子旋转时的磨擦阻力的大小。
所以,使用荧光偏振就可通过观察与有机大分子络合的配位体浓度改变时有机大分子发射的偏振光的变化,从而推断出有机大分子的构形变化。
偏振值P的定义由下式给出:
P=(I丄-I║)/(I丄+I║)
I丄和I║为荧光仪或分光光度计的发射偏振器(emissionpolarizer)的方位平行和垂直于激发偏振光而得到的荧光强度。
由于偏振光的荧光测量不受光源强度波动的影响,因而精度非常高。
发生荧光去偏振作用的外部因素有两个:
一、通过电子的能量转换导致的激发态迁移;二、处于激发态时分子旋转造成的迁移力距方位的变化。
在运用荧光偏振方法时,我们经常用到r(Anisotropy)值,它是在荧光偏振研究中为了计算方便而假定的一种表达荧光偏振值的方式。
Anisotropy值(r)的定义为:
(r)=(I丄-I║)/(I丄+2I║)
§2.3.3同步荧光扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系,同步扫描技术可以分为固定波长差、固定能量差以及可变角(可变波长)同步扫描。
同步扫描技术具有使光谱简化、谱带窄化、提高分辨率、减少光谱重叠、提高选择性和减少散射光影响等优点。
固定波长差同步荧光光谱中,波长差的选择直接影响到同步荧光光谱的形状、带宽和信号强度,从而提供了一种提高选择性的途径。
例如,酪氨酸(Tyrosine)和色氨酸(Tryptophan)的荧光激发光谱很相似,发射光谱又严重重叠,但是Δλ<15nm的同步荧光光谱只显示酪氨酸的光谱特征,Δλ>60nm的同步荧光光谱只显示色氨酸的光谱特征,从而可实现分别测定。
目前,有关合适Δλ的选择已有若干理论研究,但是在实际应用中大多根据具体体系通过实验加以选择。
在可能条件下,选择等于Stokes位移的Δλ值是有利的,有可能获得荧光信号最强、半峰宽最小的同步荧光光谱。
固定能量差(Δν)同步扫描可克服0-0带跃迁非常弱甚至不显示的情况下,以及不同组分对Δλ的不同要求所带来的困难。
有可能对同一类化合物(如多环芳烃)只选择一个Δν值用于整个光谱的扫描,同时还能最大限度地减小瑞利散射(RaleighScattering)和拉曼散射(RamanScattering)的干扰(陈培榕等,1999)。
可变角同步扫描技术可进一步提高测量的选择性,由于在本论文中未涉及此项技术,在此不在赘述。
§2.3.4三维荧光光谱
三维荧光光谱(Three-dimensionalexcitationemissionmatrixfluorescencespectroscopy,3DEEM),也可称为总发光光谱或激发-发射矩阵图,与常规荧光光谱技术的主要区别是能够普获得激发波长和发射波长同时变化时的荧光强度信息。
三维荧光光谱有两种表示形式:
等(强度)高线图(Contourplot)和等角三维投影图(3Dplotorsurfaceplot)。
等高线图易于获得更多的信息,能体现与常规荧光光谱、同步荧光光谱的关系(如图2.2所示)。
三维荧光光谱能够获得完整的光谱信息,是一种很有价值的光谱指纹技术(陈培榕等,1999)。
自从美国海洋化学家P.G.Coble等(Cobleetal.,1990)应用三维荧光光谱研究黑海DOM的荧光特性以来,国际上地球科学和环境科学家们广泛应用3DEEM来研究和表征DOM的来源、组成等地球化学信息。
图2.2典型的三维荧光光谱图与传统荧光光谱图之间的关系
§2.4荧光光谱分析仪
和大多数光谱分析方法一样,荧光光谱分析仪主要由光源、单色器或波长选择系统,样品池和检测器。
和其他光谱仪器的一个重要区别在于,荧光光谱需要两个独立的波长选择系统,一个用于激发,另一个用于发射(王镇浦等,1989;赵藻藩等,1990)。
(1)光源在紫外-可见区范围内,常用的光源是氙弧灯和高压汞灯。
(2)样品池荧光样品池须用低荧光材料制成,通常用石英,形状为方形和长方形为宜。
(3)单色器比较精密的荧光光谱分析仪均采用光栅,有两个:
第一个用于选择激发波长;第二个用于分离出荧光发射波长。
(4)检测器荧光的强度通常比较弱,因此要求检测器具有较高的灵敏度,一般由光电管或光电倍增管作为检测器,并与激发光成直角。
近些年出品的荧光光谱分析仪如日立公司的F-4500型(见图2.3),PE公司的LS50B型,将荧光和磷光测量装置一体化,通过计算机选择测量方式,即可进行荧光、磷光或化学发光等的测量。
图2.3HitachiF-4500型荧光光谱分析仪
本文所有荧光光谱测定均在中国科学院地球化学研究所环境地球化学国家重点实验室HitachiF-4500型荧光光谱分析仪(图2.3所示)上完成。
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