HsamiR200a对HEC1B人子宫内膜腺癌细胞系增殖与凋亡的影响Word文件下载.docx
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LIUXue-qing(刘学庆),E-mail:
a68733172@
[Abstract]Objective:
Toinvestigatetheeffectsofhsa-miR-200aandthepotentialmechanismoncellproliferationandapoptosisofhumanendometriumadenocarcinomaHEC-1Bcellline.Methods:
Theexpressionofhsa-miR-200ainHEC-1Bcelllinewasmeasuredbyreal-timefluorescencequantitativePCR(FQ-PCR).Synthetichsa-miR-200amimicsandinhibitorweretrnsfectedintoHEC-1Bcelllinebylipofectamine.Cellulargrowth、proliferationcapacityandapoptoticratewereassayedbythemethylthiazolyltetrazolium(MTT)assayandfloweytometry(FCM).Bioinformaticanalysiswasusedtopredicttargetsofhas-miR-200aonproliferationandapoptosis.WesternblotwasusedtomeasurePTENproteinexpression.Results:
Itindicatedthattransfectionissuccessfulthattheexpressionofhsa-miR-200ainHEC-1Bcellwassignificantlychangeaftertransfection.Comparedwiththoseofblankcontrolgroupandnegativecontrolgroup,thecellgrowthinhibitionofmiR-200ainhibitorgroupwasdemonstratedbyMTTresults.FCManalysisshowedthatthecellapoptoticrateinthemiR-200ainhibitorgroupwasincreased.BioinformaticanalysisresultsshowedPTENwasthetargetofhas-miR-200a.ThePTENproteinexpressionofHEC-1Bcellssignificantlydecreasedaftertransfectedwithhsa-miR-200amimics.However,ThePTENproteinexpressionwasenhancedaftertransfectedwithhsa-miR-200ainhibitor.Conclusion:
hsa-miR-200acannegativelyregulatePTENexpressioninHEC-1B.ThecellproliferationandapoptosisabilityofHEC-1BisafectedbyPTENregulatedbyhsa-miR-200a.
[Keywords]Endometrialcarcinoma;
hsa-miR-200a;
PTEN;
proliferationandapoptosis
MicroRNA是一类普遍存在于细胞中的长度为18~25个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA,通过与靶mRNA特异性的碱基配对,即完全配对引起靶mRNA的降解;
而不完全配对则抑制其翻译,从而对基因进行转录后表达的调控[1,2],在哺乳动物体内主要以不完全配对抑制靶mRNA翻译的形式发挥转录后表达调控的功能。
miRNAs的表达具有时空特异性,即在生物发育的不同阶段表达不同的miRNAs;
在不同组织中表达不同的miRNAs[3]。
目前的研究表明miRNAs的异常表达与肿瘤的发生于进程存在密切关系。
子宫内膜癌(endometrialcarcinoma,EC)是妇科三大恶性肿瘤之一,约占女性生殖道恶性肿瘤的20%~30%,其发病率近年呈上升趋势[4],严重威胁着女性的健康和生命。
但其发病机制目前尚不完全明了。
随着对子宫内膜癌的研究从蛋白质层面转到基因水平,越来越多的研究[5~9]证实miRNAs在子宫内膜癌中扮演了重要角色。
近年多项研究[10~14]表明,miRNAs在肿瘤发生过程中起癌基因或抑癌基因的作用。
Eri等[6]报道子宫内膜腺癌组织中miR-200a表达与癌旁正常组织相比明显增高,提示其可能参与肿瘤的发生发展过程。
本研究旨在分析hsa-miR-200a对子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖与凋亡的影响,并探讨其机制,以期为子宫内膜癌的诊断和治疗奠定基础。
1材料和方法
1.1材料HEC-1B(人子宫内膜腺癌细胞)购自上海中科院细胞库。
DMEM/F-12培养基(Hyclone公司);
胎牛血清(杭州四季青公司);
DMSO(sigma公司);
TrizolReagent(Invitrogen公司);
LipofectamineTM2000(简称lipo2000,Invitrogen公司);
PCR试剂(TaKaRa公司);
hsa-miR-200a模拟物、抑制剂(广州锐博公司);
PTEN抗体(SantaCruz公司)。
1.2方法
1.2.1实时荧光定量PCR(FQ-PCR)用TrizolReagent抽提子宫内膜或细胞总RNA,逆转录成cDNA,用SYBRgreenPCR混合物完成实时定量PCR反应,采用U6作为内参,进行归一化。
所用引物(Invitrogen)序列如下:
Primers
Sequence(5’→3’)
hsa-miR-200a
U6
PTEN
RTprimer
PCRprimer
Forward
Reverse
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA
GGTATTCGCACTGGATACGACacatcg
ggctaacactgtctggtaacgatg
GTGCAGGGTCCGAGGT
GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT
CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT
CCGTTACCTGTGTGTGGTGATATC
GAATGTATTTACCCAAAAGTGAaacatt
1.2.2WesternBlotting细胞裂解液抽提细胞总蛋白,8–10%SDS-PAGE分离蛋白,转至PVDF膜,与一抗和辣根过氧化物酶标记的二抗结合,ECL法显色。
1.2.3细胞培养及转染HEC-1B细胞用DMEM/F12培养基+10%胎牛血清,于37℃、5%CO2培养箱中培养。
接种5000个细胞/孔于96孔板中,次日转染:
配制miR-200amimics-lipo2000混合液(终浓度20nM)、miR-200ainhibitor-lipo2000混合液(终浓度100nM)及其阴性对照,室温孵育20分钟加入细胞中,分别培养24、48、72、96小时收获。
1.2.4MTT法HEC-1B细胞接种于96孔板中,次日转染miR-200amimics、inhibitor及其阴性对照,分别于转染后24h、48h、72h、96h加入MTT和DMSO,酶联免疫检测仪570nm波长处测定各孔光吸收值。
实验重复3次。
1.2.5流式细胞仪检测细胞周期和凋亡取对数生长期细胞,转染48h后,PBS润洗,分别置70%冰乙醇或PBS中制备浓度106/ml单细胞悬液,应用流式细胞技术分析各组细胞周期时相分布或凋亡比例。
实验重复3次,计算均值。
1.2.6生物信息学分析对Pictar、MirGen、Targetscan三个预测miRNAs靶标的数据库进行比对[15~17],找出交集,再筛选出与增殖或凋亡相关的基因作为研究对象。
1.2.7统计学分析采用SPSS17.0统计软件分析数据,计量资料采用t检验,数据用均数±
标准差表示,P≤0.05为差异显著有统计学意义。
2结果
2.1HEC-1B细胞中hsa-miR-200a的表达水平
运用荧光实时定量PCR(FQ-PCR)法检测hsa-miR-200a在人子宫内膜癌细胞HEC-1B中的表达水平(图1)。
图1hsa-miR-200a在HEC-1B细胞中的表达水平。
A:
扩增曲线;
B:
溶解峰
2.2细胞转染效率的检测
HEC-1B细胞转染miRNAsNegativecontrol24h后,荧光显微镜观察荧光分布情况,90%以上的细胞内有荧光分布,转染效率达90%以上(图2)。
图2转染miRNAsNegativecontrol的HEC-1B细胞。
A:
普通光镜;
B:
荧光显微镜(10X)
2.3FQ-PCR检测转染后各组hsa-miR-200a的表达量
转染模拟物组中hsa-miR-200a表达显著升高,而抑制剂组则显著降低(P<0.05),对照组与未处理组无明显变化,表明转染成功(图3)。
图3转染后各组hsa-miR-200a的表达水平。
(Mi:
模拟物,Ih:
抑制剂)
2.4Hsa-miR-200a对HEC-1B细胞增殖凋亡的影响
2.4.1MTT法检测细胞增殖活性
转染inhibitor组的HEC-1B细胞的增殖活性较正常组及阴性对照组明显降低,抑制效应在转染48h后出现,并持续48h以上(图4,表1);
而转染mimics组的HEC-1B细胞增殖活性无显著变化(P>0.05,表1)。
表明下调miR-200a的表达可影响HEC-1B细胞增殖活性。
图4转染hsa-miR-200ainhibitor对HEC-1B细胞增殖活性的影响
表1转染hsa-miR-200ainhibitor、mimics对HEC-1B细胞增殖活性的影响
Group
Proliferativeactivity(
)
24h
48h
72h
96h
Untreated
0.201±
0.0045
0.404±
0.026
0.613±
0.04
0.794±
0.01
Negativecontrol
0.203±
0.0038
0.411±
0.035
0.582±
0.02
0.811±
0.025
miR-200ainhibitor
0.0052
0.321±
0.035*
0.410±
0.02**
0.601±
0.025**
miR-200amimics
0.202±
0.0039
0.407±
0.016
0.598±
0.021
0.803±
*p<
0.05,**p<
0.01comparedwithcontrol.
2.4.2流式细胞仪分析细胞周期
运用流式细胞分析技术检测细胞周期,发现转染48h后,inhibitor组中G1期细胞数占总细胞数的比例(67.22%)明显高于空白组(52.13%)和阴性对照组(52.37%);
S期细胞数占总细胞数的比例(22.68%)明显低于空白组(36.92%)和阴性对照组(36.08%),组间差异有统计学意义(P<0.05)(图5)。
表明下调hsa-miR-200a的表达诱导细胞周期停滞在G1期,促进细胞凋亡。
而转染mimics组的HEC-1B细胞周期无显著变化(P>0.05,图5、表2)。
图5各组细胞周期结果。
空白对照组;
抑制剂阴性对照组;
C:
抑制剂组:
D:
模拟物阴性对照;
E:
模拟物组。
2.4.3流式细胞仪分析细胞凋亡
运用流式细胞分析技术检测细胞凋亡,发现转染48h后inhibitor组中凋亡细胞数占总细胞数的比例(18.97%)明显高于空白组(7.47%)和阴性对照组(7.13%),组间差异有统计学意义(P<0.05)(图6)。
而转染mimics组的HEC-1B细胞凋亡无显著变化(P>0.05,表2)。
表明下调hsa-miR-200a的表达促进细胞凋亡。
图6各组细胞凋亡结果。
C:
抑制剂组;
空白组;
模拟物阴性对照组;
F:
表2不同处理组的细胞周期和凋亡率
Group
G1
S
G2
AP
52.13±
2.31
36.92±
2.60
10.95±
3.08
7.47%±
0.66
Inhibitornegativecontrol
52.37±
3.10
36.08±
2.45
11.55±
1.79
7.13%±
0.57
67.22±
1.85**
22.68±
2.77**
10.10±
2.75
18.97%±
1.12**
Mimicsnegativecontrol
59.87±
3.25
31.62±
3.23
8.51±
2.23
15.19%±
1.85
61.41±
2.71
34.09±
2.87
4.5±
2.25
13.86%±
1.32
**p<
2.5生物信息学预测has-miR-200a的靶基因
目前预测miRNAs靶基因的主要方法是通过Pictar、MirGen、Targetscan[15~17]等三个靶基因预测数据库筛选出has-miR-200a的靶基因,取其交集(表3),再从中选择与增殖、凋亡相关的靶基因(表3)。
表3hsa-miR-200a的靶基因
Targetgene
Genename
Son
SONDNAbindingprotein
Pdcd4
programmedcelldeath4
Pten
phosphataseandtensinhomolog
Gene
Bindingsites
图7生物信息学预测has-miR-200a的靶基因。
Targetscan数据库中hsa-miR-200a在靶基因PTEN的3’UTR区的结合位点及序列配对。
2.6在HEC-1B细胞中,has-miR-200a负性调控PTEN
将has-miR-200a的模拟物和抑制剂分别转染进入HEC-1B细胞中,用WesternBlotting检测转染前后靶蛋白Son、Pdcd4、Pten的表达水平(图7),转染前后HEC-1B细胞中蛋白Son、Pdcd4的表达量没有明显改变,仅蛋白PTEN的表达发生改变,即模拟物组中PTEN的表达量下调,而抑制剂组中PTEN的表达量是上调的。
运用FQ-PCR检测了转染前后细胞PTENmRNA水平,发现转染前后细胞中PTENmRNA水平没有显著变化(P>0.05)(图8-B)。
该结果符合miRNAs对基因转录后调控的功能。
图8转染前后HEC-1B细胞中PTEN的蛋白(A)及mRNA(B)表达水平。
模拟物;
Ih:
3讨论
本研究通过对人子宫内膜癌细胞系HEC-1B的检测,发现其中有hsa-miR-200a表达。
通过上调和抑制HEC-1B细胞中hsa-miR-200a的表达,并对其作用进行相关研究发现下调hsa-miR-200a的表达使HEC-1B细胞增殖活性降低,促进细胞凋亡。
说明hsa-miR-200a在HEC-1B细胞的表达促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,起着致癌基因的作用。
而上调hsa-miR-200a的表达HEC-1B细胞增殖活性无明显改变。
以前对癌症形成的研究[26,27]主要集中在致癌基因和抑癌基因方面,新的研究表明癌症的形成还与miRNAs对致癌基因或抑癌基因的调控有关。
Stephen等[8]证明在子宫内膜癌中miRNAs调控抑癌基因FOXO1的表达;
Jia等[25]证明在鳞癌上皮中miR-205通过调控抑癌基因SHIP2的表达影响肿瘤的发生或进程。
由于哺乳动物细胞中的miRNAs具有抑制靶基因翻译的功能。
hsa-miR-200a是如何调控HEC-1B细胞增殖与凋亡的呢?
本实验结果表明hsa-miR-200a调控的靶基因为人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometen,PTEN)。
PTEN是一种抑癌基因,在细胞生长、凋亡、粘附、迁移、浸润等方面具有重要作用,尤其在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用[18~25]。
它的突变、缺失或转录水平降低常见于多种原发性恶性肿瘤,如脑胶质瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、子宫内膜癌和恶性黑色素瘤等,表明PTEN基因与肿瘤的形成与发展密切相关[28]。
Hua等[18]证实在卵巢癌中miR-214负性调控PTEN的表达,促进卵巢癌细胞的增殖,因此我们推测miR-200a在子宫内膜癌中也有类似的作用。
本研究通过人工合成hsa-miR-200a的模拟物、抑制剂,上调和抑制hsa-miR-200a的表达,发现PTEN蛋白与miR-200a的表达呈负相关。
hsa-miR-200a表达被抑制,PTEN表达量的上调导致HEC-1B细胞增殖活性降低,凋亡增加。
由此表明hsa-miR-200a影响了HEC-1B细胞的增殖、凋亡。
在本研究中,PTEN的表达量受模拟物、抑制剂的影响发生改变,而模拟物却不影响HEC-1B细胞的增殖活性,我们推测这是因为HEC-1B细胞中miR-200a的表达水平已较高,且miR-200a起着致癌基因的作用,上调其表达量但不增加其致癌作用。
综上所述,hsa-miR-200a在HEC-1B细胞增殖凋亡过程中扮演了重要角色,其生物学功能的发挥是通过对靶基因PTEN的翻译水平的调控实现的。
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