重组人胰高血糖素样肽前药的表达纯化及生物活性分析文档格式.docx
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纯化得到的蛋白纯度达到95.43%,并且可以在特异性酶作用下缓慢降解,释放出多个GLP-1分子。
纯化的Pro-rhGLPs呈剂量依赖性降低血糖浓度,同时升高血清胰岛素水平。
等剂量Pro-rhGLPs的降糖作用较GLP-1作用更强。
结论建立了Pro-rhGLPs高效表达、纯化方法,获得了高纯度Pro-rhGLPs,对糖尿病小鼠具有明显的降血糖作用。
关键词:
糖尿病;
人胰高血糖素样肽-1;
重组蛋白;
前体药物
Expression,PurificationandBioactivityofofProdrugofRecombinantHumanGLPs
MAXue1,HUIHong-xiang2,ZHOUYing1,HEGong-hao1,MENGJing-ru1,JIAMin1,LUOXiao-xing1*(1.SchoolofPharmacy,FourthMilitaryMedicalUniversity,ShannxiXi’an710032,Shaanxi,China;
2.DepartmentofMedicine,UniversityofCalifornia,CaliforniaLosAngeles,CA90048,USA)
ABSTRACT:
OBJECTIVEToproduceprodrugofrecombinanthumanglucagon-likepeptides(Pro-rhGLPs)andstudyitseffectsonregulationsofbloodglucoselevelsandinsulinsecretioninmice.METHODSTheconstructedE.coliBL21(DE3)/pET32a(+)–hGLPswasinducedby0.01mmol·
L-1IPTG.Theexpressedproductwasidentifiedby12%SDS-PAGE.TheproteinwaspurifiedbyNi-NTApurificationsystem.Pro-rhGLPswasdigestedbythrombininPBSbuffer.ThebiologicalactivityofPro-rhGLPswasexaminedbyscinjectioninC57BL/6miceordb/dbmice.Bloodglucoselevelsweremeasuredusingabloodglucosemeter.PlasmainsulinconcentrationsweredeterminedbyELISA.RESULTSTheexpressionoutputofPro-rhGLPswasapproximately50%ofthetotalbacterialproteins.ThepurityofrecombinantPro-rhGLPswasmorethan95.43%byHPLCanalysis.TheproteinwasslowlydigestedbyspecificendoproteinaseandbioactiveGLP-1couldbereleasedgradually.TheanalysisofinvivoactivityindicatedthatPro-rhGLPshadthebioactivityofnativeGLP-1,andcouldsignificantlydecreasebloodglucoseandincreaseinsulinsecretionindose-dependentmanner.Pro-rhGLPshadastrongereffectsthanGLP-1.Moreover,basalrandomglycemiadecreasedrapidlyandremainedlowerlevelforupto10hfollowingasingleinjection.CONCLUSIONAprokaryoticexpressionsystemofPro-rhGLPswithhighefficiencywassuccessfullyestablishedandtheproteinwasobtained.Preliminarystudiesshowedanewpotentialfordevelopingthelong-actingGLP-1analogsforclinicalapplications.
KEYWORDS:
diabetes;
hGLP-1;
recombinantprotein;
prodrug
胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1,GLP-1)是肠道L细胞分泌的由30个氨基酸残基组成的肽类激素[1]。
作为一种重要的肠促胰岛素(incretin),GLP-1通过多种途径参与血糖调节,对维持机体的葡萄糖稳态起着十分重要的作用[2],其降糖作用严格依赖于血糖浓度,因此用于治疗糖尿病时不会出现低血糖的不良反应[3],表现出良好的临床应用前景。
然而,由于GLP-1在体内极易被二肽基肽酶(dipeptidylpeptidaseIV,DPPIV)降解而失活,同时很容易从肾脏排出,故其生物半衰期仅2~6min,在很大程度上限制了其临床应用。
此外,化学合成的GLP-1长效类似物成本高且产率低,也在一定程度上限制了其产业化规模生产。
针对这些不足,我们采用前体药物设计思路,应用蛋白融合技术制备了重组人胰高血糖素样肽前药(ProdrugofrecombinanthumanGLPs,Pro-rhGLPs)。
体外无活性的Pro-GLP-1进入体内后,在特异性酶作用下缓慢降解,释放出多个活性GLP-1分子;
同时,大分子的前体药物也不易从肾脏排出,在很大程度上延长了药物的作用时间。
本研究通过建立Pro-rhGLPs高效表达、纯化方法,并对获得的Pro-rhGLPs蛋白进行体内生物学活性分析,为GLP-1相关药物的研发提供新的思路。
1 材料
1.1 药品与试剂
胰蛋白胨、酵母提取物(OXOID公司);
琼脂粉、氨苄青霉素(Sigma公司);
IPTG(Promega公司);
金属螯合亲和层析介质(Ni-NTA,Invitrogen公司);
ECL发光试剂(PIERCE公司);
乙腈(CNCH3,色谱纯)、三氟乙酸(TFA,色谱纯)购自Merk公司;
HPLC色谱柱(Waters公司);
GLP-1antibody及二抗购自北京博奥森公司;
对照药GLP-1购于美国多肽公司;
D-葡萄糖(Sigma公司);
胰岛素ELISA试剂盒(美国Linco公司)。
1.2 仪器设备
美国GE公司AKTApurifer快速纯化系统;
美国Waters公司HPLC系统;
AlphaFluorChemSP成像系统(美国Alpha公司);
德国罗氏诊断公司ACCU-CHEK®
Active全自动血糖检测仪;
美国BIO-RAD公司Model680型酶标仪;
美国SORVALL公司Biofugefresco冷冻高速台式离心机;
美国MILLIPORE公司Milli-Q超纯水系统。
1.3 动物、菌株
原核表达系统E.coliBL21(DE3)/pET32a(+)-hGLPs由本实验室构建。
SPF级7周龄的雄性C57BL/6小鼠,体重(21.0±
2.0)g,由第四军医大学实验动物中心提供(动物合格证号:
陕动字08-013号)。
饲养环境:
温度(23.0±
2.0)℃,湿度(55±
5)%,光照7:
00~19:
00。
动物进行适应性训练1周后使用。
2 方法
2.1 Pro-rhGLPs的表达
将构建的菌株E.coliBL21(DE3)/pET32a(+)-hGLPs接种于LB培养基(含100µ
g/ml氨苄青霉素Amp),37℃振荡培养10h。
按1:
100比例转种新培养基,继续37℃振荡培养2h,然后加入IPTG至终浓度为0.01mmol·
L-1,37℃诱导4h后,离心收集菌体。
用1000mlPBS重悬100g菌体,冰浴中超声破碎,分别收集上清和沉淀,进行12%SDS-PAGE电泳分析融合蛋白的表达。
2.2 Pro-rhGLPs的分离纯化
参照Ni-NTAPurificationSystem的说明,用超声缓冲液(50mmol·
L-1NaH2PO4pH7.8,300mmol·
L-1NaCl)重悬菌体,加入100mmol·
L-1PMSF至终浓度1mmol·
L-1,冰浴中超声破碎,12000r·
min-1离心15min,取上清液过Ni-NTAHisBind树脂进行亲和层析,收集融合蛋白经超滤离心管脱盐浓缩后进行透析复性并冷冻干燥。
之后加入pH7.9的50mmol·
L-1Tris-Cl(含1%Tween20和10mmol·
L-1CaCl2)溶解至2mg·
L-1,按每0.8mg融合蛋白加入1U肠激酶,于25℃酶切16h。
为去除HisTag及硫氧还蛋白的融合部分,酶切后溶液再次经过Ni-NTAHisBind树脂纯化,收集穿透峰,经冷冻干燥得到rhGLPs样品。
12%SDS-PAGE电泳检测目的蛋白纯度。
2.3 Pro-rhGLPs的HPLC分析及Western-blot检测
纯化的目的蛋白纯度用HPLC分析,色谱条件:
流动相A(去离子水,0.1%TFA),B(100%CNCH3,0.1%TFA),色谱柱为C18(4.6mm×
250mm),流速1.5ml·
min-1,检测波长215nm。
目的蛋白通过Westernblot及ECL化学发光进行检测。
2.4 Pro-rhGLPs的酶切分析
将1mgPro-rhGLPs冻干粉及1.5U的凝血酶溶于5mlPBS缓冲液中,充分混匀后等分为10份分装于1.5ml离心管中,在37℃水浴中进行孵育,分别在孵育后的0,30min,1,2,4,6,9,12,24h取样一支,15%SDS-PAGE电泳后转膜进行Westernblot分析。
2.5 Pro-rhGLPs的生物活性测定
口服葡萄糖耐受实验(OGTT):
健康C57BL/6J小鼠(18~22g),雌雄各半,禁食16-18小时,皮下注射不同剂量的Pro-rhGLPs(0.3nmol·
kg-1,3nmol·
kg-1,30nmol·
kg-1)、hGLP-1(30nmol·
kg-1)或生理盐水,注射15min后灌胃给予糖负荷(1.5g·
kg-1体重),并分别于注射后0,10,20,30,60,90,120,150min后从尾静脉取血,用血糖仪测定血糖水平。
在给予糖负荷后的20min,用ELISA试剂盒测定血清胰岛素水平。
糖尿病db/db小鼠,10周龄,雌性,随机分为2组,分别给予皮下注射Pro-rhGLPs(3nmol·
kg-1)和生理盐水,注射后每隔2h从尾静脉取血测定血糖值。
2.6 统计学分析
实验数据采用SPSS10.0统计学软件进行统计分析,以均数±
标准差(x±
s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA),P<0.05表示差异有显著性。
3 结果
3.1 Pro-rhGLPs的诱导表达
电泳结果显示在相对分子量约35kD处有一明显的新生蛋白条带,0.01,0.1和1.0mmol·
L-1IPTG均能诱导Pro-rhGLPs表达,表达产物主要存在于菌体超声破碎物离心后的沉淀中,且主要以包涵体形式存在,其表达产量约占细菌总蛋白50%(图1)。
图1不同浓度IPTG诱导E.coliBL21(DE3)/pET32a(+)-hGLPs表达的Pro-rhGLPs
M-低相对分子质量标准蛋白;
1~3-IPTG0.01,0.1,1mmol·
L-1诱导后Pro-rhGLPs的表达;
4-未诱导;
5-空载体对照
Fig.1SDS-PAGEanalysisofPro-rhGLPsexpressedinE.coliBL21(DE3)
M-ProteinMarker;
1~3-0.01,0.1,1mmol·
L-1IPTGinducedcellcultures;
4-Uninducedcellcultures;
5-blankcontrol
3.2 Pro-rhGLPs的分离纯化及Western-blot鉴定
包涵体洗涤、溶解后经第一次Ni-NTA亲和层析后,即可得到较高纯度的融合蛋白。
肠激酶酶解融合蛋白,再次过Ni-NTA亲和层析,收集穿透峰,冷冻干燥,制备得到Pro-rhGLPs样品,电泳结果显示纯化后的蛋白为单一条带(图2-A)。
对纯化后的样品进行Westernblot分析,可见特异性反应条带,而未诱导对照在相应位置无阳性反应条带出现(图2-B)。
图212%SDS-PAGE(A)及Westernblot(B)分析Pro-rhGLPs的纯化结果
1-空白对照;
2-纯化的Pro-rhGLPs融合蛋白;
3-肠激酶酶切纯化后的Pro-rhGLPs
Fig.2SDS-PAGE(A)andWesternblot(B)analysisofPro-rhGLPspurification
2-blankcontrol;
3-purifiedfusionproteinPro-rhGLPs;
4-purifiedPro-rhGLPsafterEnterokinasecleavage
3.3 Pro-rhGLPs的纯度分析
融合蛋白裂解纯化后经浓缩、复性,得到的Pro-rhGLPs经HPLC分析,纯度为95.43%(图3)。
图3纯化后Pro-rhGLPs纯度的HPLC分析结果
Fig.3HPLCanalysisofthepurifiedPro-rhGLPs
3.4 Pro-rhGLPs的酶切过程
Pro-rhGLPs在PBSbuffer中经凝血酶作用后,开始降解,应用hGLP-1抗体在不同时间点进行Westernblot检测,结果显示,在24h内随着时间的延长,大分子的Pro-rhGLPs逐渐减少,小分子hGLP-1不断增加(图4)。
图4Westernblot分析Pro-rhGLPs经特异性酶作用后的降解过程
Fig.4WesternblotanalysisofPro-rhGLPsdigestedbyspecificendoproteinase
3.5 Pro-rhGLPs的体内生物活性分析
健康C57BL/6J小鼠的OGTT结果显示,与生理盐水对照组相比,Pro-rhGLPs能够呈剂量依赖性降低升高的血糖,同时升高血清胰岛素水平,上述剂量的Pro-rhGLPs对小鼠正常血糖浓度无影响,等剂量Pro-rhGLPs的降糖作用较hGLP-1作用强(P<0.05)(图5)。
糖尿病db/db小鼠在给予Pro-rhGLPs进行治疗后,血糖在2h内降至正常水平,且该降糖作用至少可以维持10h以上(图6)。
图5皮下注射Pro-rhGLPs的葡萄糖耐量试验中血糖水平(A、B)及血清胰岛素水平(C),与hGLP-1组相比,1)P<
0.05。
-生理盐水;
-hGLP-1(3nmol·
kg-1);
-Pro-rhGLP-1(3nmol·
kg-1)
1–生理盐水;
2~4-Pro-rhGLP-1(0.3nmol·
5-hGLP-1(30nmol·
Fig.5Bloodglucoselevels(A,B)andplasmainsulinlevels(B)duringanOGTTafteri.p.injectionofsaline,hGLP-1orPro-rhGLPs.ComparedwithGLP-1,1)P<
0.05.
-saline;
1–saline;
2~4-Pro-rhGLP-1(0.3nmol·
图6单次皮下注射Pro-rhGLPs后db/db小鼠的血糖水平
-生理盐水;
-Pro-rhGLPs(3nmol·
Fig.5Basalglycemiainfeddb/dbmiceafterasingles.cinjectionofsalineorPro-rhGLPs.
4 讨论
糖尿病是世界性疾病,发病率居高不下,对人类健康构成严重威胁。
近年来,胰高血糖素样肽-1(GLP-1)作为一种更安全、更有效的促胰岛素分泌物已成为糖尿病治疗领域内备受瞩目的研究热点[4]。
与现有的抗糖尿病药物相比,GLP-1具有7方面优点:
其促胰岛素分泌作用依赖于血糖水平,从而避免了胰岛素过度分泌导致的低血糖发生,可以长期安全使用[5];
能够改善周边组织的胰岛素受体敏感性,有助于治疗胰岛素抗性[6];
可以抑制胰高血糖素的分泌[7];
对于肥胖引起的2型糖尿病,可以通过抑制胃排空的作用,帮助患者控制饮食或减轻体重[8];
对磺脲类药物无效的患者仍然有效;
能改善患者的糖化血红蛋白、果糖胺等中长期生化指标[2];
能够促进胰岛β细胞的增生[9]。
天然GLP-1多种功效的证实为2型糖尿病的治疗带来了新希望,但是,人体天然的GLP-1很不稳定,可被二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)降解,半衰期仅为2~6分钟。
若采用天然GLP-1来降低血糖,需持续静脉输注或持续皮下注射,临床可行性较差。
目前国际上在研的GLP-1长效类似物多采用化学合成[10],往往技术难度大、生产成本高、纯化困难且会造成环境污染,其免疫原性、稳定性和安全性等尚处于进一步考察中。
此外,部分修饰后的类似物,活性也有所降低。
针对以上问题,本室和美国加州大学医学院合作,采用前体药物设计思路[11],应用基因工程方法制备了具有抵抗酶降解特性的重组人胰高血糖素样肽前药(ProdrugofrecombinanthumanGLPs,Pro-rhGLPs),目的在于延长GLP-1作用时间的同时不影响其生物学活性,为GLP-1相关药物的研发提供新的思路。
本文研究经过克隆、表达、纯化、可得到大量Pro-rhGLPs,且具有显著的降血糖活性。
本实验中,我们构建了原核表达系统E.coliBL21(DE3)/pET32a(+)–hGLPs,在0.01mmol·
L-1IPTG诱导下,Pro-rhGLPs的表达量可达细菌总蛋白的50%以上,Pro-rhGLPs的高表达将为今后的产业化创造有利的条件;
纯化方法简便易行,纯度达到95%以上,符合生物制品的制备要求;
同时建立了Pro-rhGLPs的活性测定方法。
实验结果表明,Pro-rhGLPs通过葡萄糖依赖方式促进胰岛素分泌,并呈剂量依赖性降低过高血糖,提高了实验动物对葡萄糖的耐受性。
从研究结果可以看出,对于未给予糖负荷,血糖正常的动物,Pro-rhGLPs未见明显降糖作用;
对于给予糖负荷的正常动物,Pro-GLP-1可以迅速增加血清胰岛素水平,从而降低血糖,且降糖作用强于GLP-1;
在自发性糖尿病db/db小鼠上,Pro-rhGLPs的降糖作用起效快且作用时间长,至少可以维持12h以上。
下一步的研究将围绕中试工艺和质量标准的建立,在大量获得Pro-rhGLPs的基础上,完成药学研究及系统的药效学研究,为将Pro-rhGLPs开发成为新型高效的糖尿病治疗药物奠定基础。
REFERENCES
[1]DRUCKERDJ.Theglucagon-likepeptides[J].Endocrinology,2001,142
(2):
521-527.
[2]ZANDERM,MADSBADS,MADSENJL,etal.Effectof6-weekcourseofglucagon-likepeptide1onglycaemiccontrol,insulinsensitivity,andbeta-cellfunctionintype2diabetes:
aparallel-groupstudy[J].Lancet,2002;
359(4):
824-830.
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