超分辨远场生物荧光成像突破光学衍射极限资料下载.pdf
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生命科学;
非线性效应;
单分子中图分类号TH74265文献标识码Adoi:
103788CJL200835091283SuperresolutionFar-FieldFluorescenceBio-lmaging:
BreakingtheDiffractionBarrierMaoZhengleWangChenChengYa(StateKeyLaboratoryofHighFieldLaserPhysics,ShanghaiInstituteofOpticsandFineMechanics,ChineseAcademyofSciences,Shanghai201800,China)AbstractFar-fieldopticalfluorescencemicrocopyhasbecomeanessentialtoolinlifescienceforalongtimelargelyowingtOitsuniquecapabilitytOprovidenoninvasive,three-dimensional(3D)imaginginsidecellsHowever,resolutionofatraditionalwide-fieldopticalmicroscopyiSlimitedtOabout230nmlaterallyand1000amaxially。
duetOthediffractionlimitoflightResolutionimprovementisurgentlydemandedbecausemolecule-scaledynamicsandstructuresaretOberevealedinsidelivingcellsintodaySlifescienceSofar。
manyscientistshaveproposedasignificantamountofnovelmethodsinordertOenhanceresolutionoffar-fieldopticalimagingForexample,lateralresolutionofapproximately100nmhasbeenachievedbyuseofstructuredilluminationwhereastheaxialresolutionhasbeenenhanced510一foldusingastandingwaveproducedbytwobeamspropagatinginoppositedirectionsNeverthelessdiffractionbarrierwasnotbrokeninthesecasesuntilnonlinearopticaleffectswereintroducedintoopticalfluorescencemicroscopyAsanexample。
theuseofanonlinearopticaleffect,namely。
simulatedemissiondepletionmicroscopyhasresultedina3Dresolutionof3050nmFurthermorethebarrierofdiffraction-limitcanalsobebrokenbynoveltechnologiesbasedonfluorescenceresonanceenergytransferandhigh-accuracylocalizationoffluorophores,bvwhichmoleculescanbepositionedwithflresolutionofseveralnanometersKeywordsoptics;
superres01ution;
far-filedopticalfluorescencemicroscopy;
nonlinearopticaleffects;
singlemolecule收稿日期:
20080307;
收到修改稿日期:
20080604作者简介:
毛峥乐(1982一),男,上海人,硕士研究生,主要从事生物荧光成像方面的研究。
导师简介:
程亚(1971一),男,上海人,研究员,博士生导师,长期从事飞秒激光与物质相互作用、飞秒三维生物成像及飞秒三维微加工研究。
Email:
ycheng一45277hotmailcom(通信作者)国激光3j卷1引言11生命科学与光学显微镜毫无疑问。
纳米技术与牛物技术是21世纪发展最迅速和热门的科学领域。
纳米技术应用广泛,包括1100nm尺度内的成像、测量、加工、操纵等。
如冬l1所示T,许多重要的生物体比如葡萄糖、抗体、病毒等都处于这个尺度范围内,研究这些微,卜物体的需求推动了高分辨率显微成像技术的发展。
反过来,超分辨显微术的发展也推动r整个生命科学的进步。
图1自然界微生物尺度Fig1Sizeofmicroorganismsinnature光学最微镜的发展伴随着人类对微观世界探索的历程。
早在公元前一世纪,人们就发现透过水滴可以观察到物体放大的像。
1590年前后,荷兰透镜工匠ZJanssen和他的儿子把透镜组安装在管中,发明了原始的光学显微镜。
在此之后,AntonvanLeeuwenhoek和RHooke对成像原理进行深入的研究,改进和发明了显微镜各部分结构,包括调焦结构、照明系统和载物台。
得到了现代光学显微镜的雏形口。
他们利用光学显微镜做了一系列生物学观察实验,AntonvanLeeuwenhoek第一次观测到细菌以及一滴水中的微生物,1665年RHooke发现细胞,这一里程碑式的发现展示了光学显微镜在生物学领域的巨大潜力。
1873年,德国人EAbbeo。
揭示了远场光学显微镜由于光的衍射效应和有限孔径分辨率存在极限的原理,此后,提高光学显微镜分辨率工作一度停滞不前。
Abbe分辨率极限的数值约为a2n,其中A是光波波长。
托是样品介质的折射率。
若以波长为500nm的光成像,水折射率为133,分辨率极限约为200nm。
12几种非远场荧光光学超分辨技术为了提高分辨率,科学家们发明了许多新颖的超分辨技术。
由Abbe分辨牢极限22n可以知道降低光波波长是提高分辨率最直接有效的方式,采用波长2rim的X射线作为激发光源。
实现了30nm的分辩率m5|。
但低于400nm的光通常会损伤活细胞邸,因此通常情况下X射线显微镜无法应用于活细胞观测。
电子显微镜则利用波粒二相性,以德布罗伊波长为10qnm的电子束照射样品,可以达到01nm的超高分辨率o,被广泛应用于细胞生物学,但由于生物样品无法存活于高真空环境,电子显微镜同样无法应用于活细胞。
原子力显微镜使用一个传感器尖端作为探针,利用尖端的原子与物质表面原子之间的范德华力(VanDerWaalsForce)来呈现样品的表面形貌。
分辨率可达原子尺度o10|。
相似地,扫描隧道显微镜利用量子力学中的隧道效应,通过测量探针与样品表面之间的隧穿电流来判断样品表面形貌,对粘附于表面的结构可以获得01nm横向和001nm纵向分辨率。
不幸的是它们仅限于样品表面成像,并且图像获取速度缓慢,实验装置复杂昂贵,可能对生物组织造成损坏,同样无法用于活细胞。
为了避免远场衍射带来的Abbe分辨率极限,1928年EHSynge等12”3提出近场扫描光学显微镜(Nearfield0pticalScanningMicroscopy,NOSM),NOSM使用一个尺度远小于波长量级的探针(如光纤)照明样品,使照明光场限定在50100nm范围内,收集距离样品表面几个波长量级附近的透射倏逝波来获取样品信息,因此不受远场衍射限制。
可获纳米量级的分辨率H41引,同时可以结合全内反射(TotalInternalReflection,TIRF)技术使用倏逝波照明样品17|。
然而它也只能观测样品近表面区域的信息,对样品的制备有极高的要求。
13远场荧光光学显微镜在生物成像中的优势与上述介绍的显微技术相比,町见光波段的远场光学显微镜具有非接触、无损伤、可探测样品内部的特点,这些特点是生物组织活细胞深层三维成像9期毛峥乐等:
超分辨远场生物荧光成像突破光学衍射极限的先决条件。
事实上,远场光学显微镜一直是生命科学研究中最主要的工具。
荧光光学显微镜是生物学研究中最常用的一种光学显微镜,利用荧光分子作为探针标记生物组织,通过探测受激荧光分子发射的荧光信号分布获取样品的空间信息。
荧光光学显微镜相比普通光学显微镜具有灵敏度高、可选择激发、高荧光对比度、信号光相对于激发光红移(有利于信号光与激发光的分离)等特点,这些独有的性质改善了光学显微镜的成像质量。
更重要的是荧光显微镜的成像不仅包含透射、折射、散射等几何光学过程,它还是一个光与物质、物质与物质相互作用的过程,这些丰富的物理过程为提高分辨率提供了一些新的途径。
本文将围绕着适用于生物样品观测的远场荧光光学显微镜,就现今常用的一些提高分辨率尤其是具有突破Abbe分辨率极限能力的显微技术展开详细讨论。
2远场荧光光学超分辨技术21光学显微镜分辨率点扩散函数(PointSpreadFunction,PSF)是一个无限小物点通过光学系统在像平面处的光强分布函数。
在一个线性不变的光学系统中,PSF不随物点位置的变化而改变,且像的光强与物的光强呈线性关系。
一般的光学成像系统都可近似为线性不变系统,如果认为物是无限小的点的集合,那么光学系统的成像过程就是物函数与PSF的卷积18|。
如图2所示引,当两个物点的PSF接近到重叠部分的最小值比最大值低2030时,LRayleighE20认为此时两个物点刚好可分辨,他以PSF的半峰全宽(FWHM)作为成像系统可分辨的最小尺度,据此给出瑞利判据,为横向分辨率d。
=等,(1a)j、01纵向分辨率d。
一寿鲁,(1b)l、式中NA为物镜的数值孔径,定义为nsin0,it和0分别为物镜的折射率和最大接收半角。
在PSF中仅有一个主峰。
或旁瓣(PSF光强次极大)非常小时,使用瑞利判据描述光学系统的分辨率非常准确。
随着旁瓣强度的增加,照明PSF的旁瓣在像平面产生赝像,不太严重的情况下,可以通过去卷积技术有效去除心1|,但是当旁瓣的强度达到主瓣强度的一半时,去卷积技术等图像处理方式失效。
2223|,图像质量严重下降。
此时PSF的傅里叶变looo-800-6UU-4U【)一2【)Uo2004006008()olooo1200xnm图2瑞利判据规定光强叠加处最小值低于最大值处的2030oA时刚好被分辨Fig2Rayleighcriteriondefinesthattwoobjectsaredistinguishableonlywhentheminimumofsumintensityisatleast200A30lowerthanthemaximum(NA=1,A=500nm)换对光学传递函数(OpticalTransferFunction,OTF)更加适合用来评价光学系统的分辨能力2引。
当荧光分子被激发后,荧光各向同性发射,换言之以各种空间频率传播,光学显微镜中有限光瞳相当于一个低通滤波器,阻挡了高空间频率荧光信号的通过,而高空间频季对应物体的精细结构,由此造成分辨率的限制。
考察光学成像系统的0TF即可获得该成像系统高频信号获取能力,对应实际空间中的分辨率。
在PSF旁瓣较大的情形下,OTF比PSF更加准确地反映光学系统的实际分辨本领。
22荧光光学超分辨技术简介原则上说,所有的光学超分辨技术都是围绕着如何得到一个尺度更小的PSF或者尺度更宽的OTF,科学家们提出大量的方法来实现这一目标,可以归纳为4点思路:
1)采用调制光照明样品;
2)利用干涉照明和(或)成像;
3)引入非线性效应;
4)利用荧光分子激发过程中的物理机制。
第一个概念利用空间调制光照明样品,将物场高空间频率信息编码,再通过计算提取高频率信息,横向分辨率提高1倍比5|。
4Pi共焦扫描显微镜利用第二个概念,在样品两侧各放置一个物镜,使激发光干涉照明,信号光干涉成像,将轴向分辨率提高57倍26。
在调制光照明中结合非线性饱和激发,即利用第三个概念,相对线性激发的情形可以获得更高空间频率信息,实现50nm的横向分辨率2。
受激发射损耗显微镜则利用饱和受激发射的非线性特性突破了Abbe分辨率极限,三维分辨率达302O8642OOOOOO1I二掣岳一1286中国激光3j卷50n“28|,理论上不受Abbe分辨率极限限制。
第四个概念利用荧光光学显微镜巾荧光分子激发过程的物理机制,例如:
利用荧光分子对在相距110nm内会发牛荧光共振能鼍转移,荧光共振能量转移屁微镜2虬具有纳米级的分辨本领。
在实际应用中。
各种超分辨思想和技术不足孤立存在的,为了最大程度地提高分辨率或同时获得横向和纵向的高分辨率,需要多种超分辨技术的优化组合。
例如4Pi共焦扫描显微镜具有提高纵向分辨本领的能力,结合受激发射损耗技术。
横向和纵向分辨率都达到50nm以下。
”,4Pi共焦扣描显微镜采用双光子激发方式,则兼具良好的组织穿透能力和轴向超分辨本领_h。
还有许多其他组合方案,本文只选择介绍一些成熟的组合方案,重点在于说明各种超分辨技术的基本原理。
23共焦扫描荧光显微镜传统宽场光学显微镜一般使用面探测器如电荷耦合器(CCD)接收信号,主要的不足足纵向分辨率低,另外由于背景噪声得不到有效抑制,图像的信噪比和对比度不高。
1960年前后,MMinsky321提出共焦扫描光学显微镜(ConfocalScanningFluorescenceMicroscopy,CSFM)的概念,大大增强了光学显微镜的轴向分辨能力,但苴到1970年后随着激光和数字化数据采集技术的应用,CSFM才得以实现,并很快成为生物医学研究领域的蓖要工具3335|。
231单物镜的CSFM共焦点探测是CSFM最显著的特点。
如图3所示=36:
。
点探测装置由一个中心与焦点位置共轭的dqL滤波器和光电倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)组成,4qL的尺度一般小于像平面的爱里斑图3共焦显微镜结构示意图Fig3Principleofeonfocaldetection尺度。
仪使来自物场焦点中心区域发射的荧光光子通过d,4L被探测器收集,mi焦点周围以及轴向前后的光(背景噪声)被遮挡一3738,数学上可以通过光强概率函数束描述这一过程h。
,。
fh。
h扪,
(2)式中h。
haet和h。
f分别表示照明光、小孑L滤波器以及总的光强概率分布。
式
(2)显示了小孔滤波器对离焦背景光的抑制作用。
由此横向分辨率提高l。
4倍”,经过数据优化处理甚至可以达到2倍“。
更蘑要的是由于小孔抑制焦点轴向离焦的光信号,使CSFM的轴向分辨能力大人增强。
点探测器每次采集簟点的信号,扫描整个样品获取单个焦平面图像。
再改变样品轴向佗置逐层扫描成像,最终将各层图像组合(重构)得剑样品二维图像41J。
然而生物组织存在散射。
焦点中心处发射的信号光子到达像平面时可能会偏离小孔滤波器的中心被阻挡,加之荧光信号本身就比较微弱,探测器采用量子效率较低的PMT(低于CCD),滤波器的孔径过小会使信号强度和信噪比迅速下降。
4。
可见CSFM的分辨率与信噪比是一对矛盾,由于信噪比决定了光学系统获取图像的能力。
3。
,实际应用中,往往不得不增大孔径使信噪比高于可观测的水平,这种情况下CSFM相对于宽场显微镜分辨率在横向没有太大的提高。
尤其对于较厚的样品,深层激发的荧光信号光子受到的散射更加严重,小孑L滤波器的孔径超过爱罩斑,甚至是爱里斑大小的数倍,此时CSFM对横向分辨率几乎没有任何提高,主要用来抑制噪声。
42i。
CSFM横向和纵向分辨率的典型值约为200nm和500nm3。
由此町见,CSFM相对于宽场光学显微镜的改进主要在于轴向分辨能力的增强,并能有效抑制背景噪声,发挥了光学显微镜无损伤、非侵入的优势,适用于生物活细胞内部的三维成像。
凭借简单的物理原理和良好的可操作性,迄今为止,CSFM仍然是生物活细胞组织研究中最常用的工具之一L44“。
232Theta共焦显微镜如图4所示24|,CSFM由于采用单物镜照明样品和收集信号,只能产生和收集球面波的一部分,造成PSF在纵向和横向不对称,纵向分辨率劣于横向分辨率34倍。
针对这个问题,Theta显微镜:
埔“7:
采用光轴正交的(更一般地,成0角)两个透镜分别照明样品和采集荧光,此时探测PSF的纵向对应照明PSF的横向,由式
(2)町知。
照明样品的PSF纵向将被压缩,提高轴向分辨宰,改善总的9期毛峥乐等:
超分辨远场生物荧光成像突破光学衍射极限1287PSF的不对称性4引。
实际应用中,大数值孑L径的物镜工作距离很短,光轴正交的两个物镜将会在空间上重合。
因此Theta显微镜只能选用数值孑L径较小的物镜,典型值为07546|,仅为共焦显微镜的一半,可见Theta显微镜轴向分辨率的提高是以牺牲横向分辨率为代价的_川。
另外,由于照明光和接收信号的方向正交,样品需要在两个方向上具有一定的对称性,样品一般制成棒状,增加了样品制备和实验装置的复杂性。
图4单物镜聚焦形成的椭球形焦点Fig4Ellipsoidfocalspotproducedbysinglelens文献E48报道了利用BRichard和Ewolf的矢量场理论修正激发光和探测光的PSF
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