不同油脂对体外培养瘤胃微生物转氨酶和脱氢酶的影响Word文档格式.docx
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可见,瘤胃发酵与瘤胃微生物在反刍动物消化中占有举足轻重的地位,如何通过营养调控使饲料在瘤胃内得到充分消化以及微生物蛋白合成效率最大化,是反刍动物营养学和饲料工业界研究的目标之一,以通过瘤胃调控而最终达到减少饲料能量和氮源的发酵的损失,提高宿主动物的生产力和饲料利用效率目的(卢德勋,1999)[1]。
综合国内外现有资料,瘤胃发酵可以采取调配日粮、改变饲喂方式、加工处理饲料及使用饲料添加剂等的方式进行调控。
研究表明油脂,尤其是不饱和的植物油脂对瘤胃微生物有一定的调控效应。
对于油脂与瘤胃微生物的相关研究,多以油脂对微生物的毒害作用、微生物量的变化、甲烷气的产量变化等常规研究为主(赵玉华和王加启,2006)[2],而本研究将创新性的以微生物的转氨酶、脱氢酶为主要研究的指标,探讨油脂对微生物细胞的破损程度和活力的影响情况,以研究油脂对瘤胃微生物细胞活力影响的规律与机制,而为瘤胃微生态调控的研究提供一些基础资料,同时也为反刍动物生产实践营养调控技术的研究提供指导。
1转氨酶
转氨酶是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶。
普遍存在于动物、植物组织和微生物中,心肌、脑、肝、肾等动物组织以及绿豆芽中含量较高。
转氨酶种类是有很多的。
催化氨基酸和a-氧代酸(a-酮酸)或醛酸之间的氨基转换反应,生成与原来的a-氧代酸或醛酸相应的a-氨基酸或ω-氨基酸,原来氨基酸转变成相应的氧代酸。
转氨酶催化的反应都是可逆的。
转氨酶种类可按底物的不同分成3大类。
L-a-氨基酸(酮酸转氨酶)、ω-氨基酸(酮酸转氨酶)和D-氨基酸转氨酶。
转氨酶的辅基是磷酸吡哆醛或磷酸吡哆胺,两者在转氨基反应中可互相变换。
转氨酶是高等生物代谢过程中必不可少的“催化剂”,主要存在于肝细胞内。
当肝细胞发生炎症、坏死、中毒等,造成肝细胞受损时,转氨酶便会释放到血液里,使血清转氨酶升高。
转氨酶参与氨基酸的分解和合成。
氨基酸转氨后生成的酮酸或醛酸可经氧化分解而供能,也可转变成糖类或脂肪酸。
相反,酮酸或醛酸也可经转氨酶的作用而生成非必需氨基酸。
某些氨基酸之间的互变也有转氨酶参与。
在高等动物各组织中,活力最高的转氨酶种类是谷氨酸:
草酰乙酸转氨酶(GOT)和谷氨酸:
丙酮酸转氨酶(GPT)。
1.1谷丙转氨酶
谷丙转氨酶(又名谷氨酸转氨酶,简称GPT、ALT)主要存在于肝细胞浆内,其正常参考值为0~45U/L(单位每升),细胞内浓度高于血清中1000-3000倍。
只要有1%的肝细胞坏死,就可以使血清酶增高一倍。
因此,GPT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。
但它并不具器官专一性,许多疾病都可以引起它的增高。
在肝细胞中,GPT把丙氨酸的氨基转移给a-酮戊二酸,把酮戊二酸的羰基转移给丙氨酸,这样丙氨酸成为丙酮酸,a--酮戊二酸成为谷氨酸。
1.2谷草转氨酶
谷草转氨酶又称门冬氨酸转氨酶,英文缩写AST或AOT,其正常参考值为0~40U/L(单位每升)。
谷草转氨酶是转氨酶中比较重要的一种,正常情况下,谷草转氨酶存在于组织细胞中,其中心肌细胞中含量最高,其次为肝脏,血清中含量极少。
谷草转氨酶主要存在于肝细胞线粒体内,当肝脏发生严重坏死或破坏时,才能引起谷草转氨酶在血清中浓度会偏高。
2脱氢酶
脱氢酶(dehydrogenases)是一类催化物质氧化还原反应的酶,在酶学分类中属于第一大类。
反应中被氧化的底物叫氢供体或电子供体,被还原的底物叫氢受体或电子受体。
当受体是O2时,催化该反应的酶称为氧化酶,其他情况下都称为脱氢酶。
不同的脱氢酶几乎都根据其底物的名称命名。
脱氢酶是已知酶中种类最多的一类,其中以催化供体中醇基团(—CHOH)、醛、酮基团(—HCO或—RCO)及烷基因(—CH2—CH2—)脱氢的为最常见。
天然受体主要有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)和细胞色素。
大多数脱氢酶的天然受体是NAD+或NADP+〔以下用NAD(P)+表示〕,例如苹果酸脱氢酶,异柠檬酸脱氢酶等。
脱氢酶的底物经这类脱氢酶的催化使NAD(P)+还原生成NAD(P)H。
另一些脱氢酶以黄素为辅基,辅基在催化反应中进行氧化还原。
例如琥珀酸脱氢酶,还原型烟酰胺腺嘌岭二核苷酸(NADH)脱氢酶,胆碱脱氢酶等。
NADH以及一些直接以黄素为辅基的脱氢酶的底物通过脱氢酶的催化最后通过细胞色素系统而被氧氧化,此时释放出的能量供机体需要。
生物体中绝大多数氧化还原反应都是在脱氢酶及氧化酶的催化下进行。
物质经脱氢酶催化氧化,最后通过电子传递链而被氧氧化,此时通过氧化磷酸化作用生成腺苷三磷酸(ATP),是异养生物体取得能量的主要途径。
2.1乳酸脱氢酶
乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶,能催化乳酸脱氢生成丙酮酸。
乳酸脱氢酶存在于机体所有组织细胞的胞质内,其中以肾脏含量较高。
同功酶有五种形式,即LDH-1(H4)、LDH-2(H3M)、LDH-3(H2M2)、LDH-4(HM3)及LDH-5(M4),可用电泳方法将其分离。
LDH同功酶的分布有明显的组织特异性,所以可以根据其组织特异性来协用诊断疾病。
正常人血清中LDH2〉LDH1。
如有心肌酶释放入血则LDH1〉LDH2,利用此指标可以观察诊断心肌疾病。
3瘤胃微生物概述(冯仰廉,2004)[3]
反刍动物的复胃具有四个室,前三个室为瘤胃、网胃和瓣胃,总称前胃。
前胃的粘膜没有胃腺,食物在前胃内受到机械性消化和微生物消化,第四室皱胃的消化与单胃相似。
而瘤胃内存在的大量厌氧微生物包括原虫、细菌、真菌、噬菌体等,它们的种类及在瘤胃内的数量因饲料、动物年龄等因素而异。
微生物以原虫和细菌为主,占瘤胃生物量的90%以上。
瘤胃内的微生态环境相当复杂。
瘤胃内不仅存在大量的的微生物,而且具备厌氧微生物繁殖的良好环境条件:
①瘤胃内温度恒定为39~41℃;
②饲料发酵产生的大量酸可以被唾液HCO3中和,产生的挥发性脂肪酸可以被吸收入血,因此pH通常维持在5.5~7.5;
瘤胃内渗透压与血浆相近;
④瘤胃高度缺氧,即使随食物有少量氧进入瘤胃,也会很快被微生物利用而消耗,其背囊的气体主要是CO2、甲烷(CH4)以及少量的N2、H2、O2等气体;
⑤饲料和水相对稳定地进入瘤胃,瘤胃节律性地运动,使未消化的食物与微生物能够均匀混合,并不断把瘤胃内容物向前推送,为微生物繁殖提供营养物质。
因此,瘤胃是一个良好的发酵罐。
反刍动物独特的前胃发酵系统使其成为哺乳动物中最有效的粗饲料消化者,它们能够通过瘤胃微生物发酵劣质饲料获得营养。
原虫与细菌区系其量的高低水平和区系间的比例,直接关系到瘤胃代谢的类型和发酵的效果,从而影响到宿主的消化吸收和饲料的利用效率。
4油脂对瘤胃微生物的影响
报道认为,油脂的使用量超过一定的比例将尤其是不饱和的油脂降解后,其游离脂肪酸的不饱和键会毒害瘤胃原虫和部分细菌,而使微生物群体生物量减少与群体结构的改变,进而影响瘤胃微生物的代谢与瘤胃的发酵功能。
而如果借助油脂的这种负面效应,科学控制添加一定油脂而达到油脂在一定程度上毒害瘤胃原虫,使其群体生物量减少和吞噬力的细菌,即可能减少其对细菌的吞噬,而增加细菌的数量的效果,体系中表现为区系生物量的交替消长,和细菌与原虫区系比例、微生物生物总量的增长。
研究也表明,油脂无论其饱和与否都对没有体壁的原虫有影响,并且瘤胃各区系生物(细菌、原虫、真菌和甲烷菌)因各自特点而对不饱和的油脂的响应也不尽一致(Dijkstra等,2000)[4],因此,研究发现适量比例且适当结构的油脂对各个区系进行一定的控调,如降低原虫和甲烷菌、减少其吞噬细菌和自溶等微生物再循环量,增加部分细菌与真菌群体量、增强瘤胃内酶和微生物活性,最终实现提高饲料能量和N素的利用效率、提高反刍动物的生产力是可行的。
5本研究的意义
综上可见,对于瘤胃微生态规律与调控技术的深入研究,将有助于合理高效利用反刍动物微生态营养生理规律,从而提高宿主动物的生产力和饲料利用效率。
鉴于油脂在我们国家的广泛易得、经济实用和其对瘤胃微生物的调控功能,本试验拟选用菜油、豆油、花生油和玉米油等4种油脂,添加于人工瘤胃培养体系,测定培养液转氨酶、脱氢酶等的活性,以研究不同油脂对培养液瘤胃微生物活力影响的规律和机制,而为反刍动物瘤胃微生态调控技术的研究和实际生产中油脂的科学合理使用提供参考。
第二部分试验部分
1材料与方法
1.1试验动物
试验动物是来自扬州大学农牧场装有永久性瘤胃瘘管的3只徐淮白山羊,试验羊分单舍、以(玉米+豆粕)、羊草为日粮常规饲养,自由清洁饮水,用以采集瘤胃液。
1.2瘤胃液采集
用装有40目尼龙滤网的真空负压装置于饲喂后3h在3只瘘管羊瘤胃共采集450mL,装入内部预温瓶迅速带回实验室,经双层纱布滤过后通CO2气体39℃待用
1.3试验底物设计
选用纤维素、酪蛋白、淀粉等为培养底物,分别添加4%的菜油、豆油、花生油和玉米油等为A、B、C、D四组,各两重复。
具体见表1,另外设一空白对照。
表1四组培养底物的配方
(g)
项目
A
B
C
D
碘价(实测值)
淀粉
0.37
酪蛋白
0.20
纤维素
1.34
花生油
0.08
94.1
菜油
0.08
114.5
玉米油
131.3
豆油
143.7
合计
2
1.4体外发酵装置
使用250mL锥形瓶作为培养瓶,瓶塞采用设有三个通路的橡皮塞,一个持续供应CO2,一个进行气体交换,一个取样通路。
1.5人工唾液盐配制
按照Menke和Steingass(1988)[5]的方法配制。
1.5.1缓冲试剂和常量元素溶液——A液称取K2HPO4·
3H2O382.51mg,KH2PO4292mg,(NH4)2SO4480mg,NaCl200mg,MgSO4·
7H2O100mg和Na2CO34000mg。
将上述试剂溶解混合后加入蒸馏水定容至1000mL。
该溶液在使用前一天配制待用。
1.5.2微量元素溶液——B液准确称取Na4·
EDTA500mg,FeSO4·
7H2O200mg,MnCl4·
4H2O200mg,ZnSO4·
7H2O10mg,H3BO330mg,CoCl2·
6H2O20mg,CuCl2·
2H2O1mg,NiCl2·
6H2O2mg和NaMoO43mg。
将上述试剂溶解混合后加蒸馏水定容至1000mL。
持续通入CO218个小时后,盖严瓶口,至于冰箱备用。
1.5.3还原剂溶液——C液称取25gNa2S·
9H2O,加80mL蒸馏水溶解后在100mL容量瓶中定容至100mL,持续充入CO220分钟后,盖严瓶口,现配现用。
1.5.4维生素溶液——D液称取硫胺素20mg,泛酸钙20mg,烟酸胺20mg,核黄素20mg,吡哆醇20mg生物素0.2mg,对氨基苯甲酸1mg,叶酸0.125mg,四氢叶酸0.125mg,将上述试剂溶解混合后加蒸馏水定容至1000mL。
1.5.5唾液盐制备准确量取782.4mLA液,8mLB液,经充分混和后持续通入CO218小时,并于培养前1小时加入1.6mLC液,以及D液8mL,充分混合,持续通入CO2气体10分钟,盖严瓶口,置于恒温水浴中预热至39℃待用。
1.5.6供试培养液配制以2:
1的比例先后加入人工唾液盐和瘤胃液配制成培养液,充CO2待用,培养液在培养开始前4h配制。
1.6体外培养与取样设计
体外培养按照Menke和Steingass(1988)[5]方法在称有底物的培养瓶中分别加入80mL人工唾液盐,通CO2至饱和,于39℃水浴备用,再加入混合瘤胃液40mL。
塞好皮塞,通CO2,39℃恒温水浴培养。
分别在培养后0、4、8、12、16、24h取样,每次取约10mL培养液,分别装入3只5mL的离心管中,其中1只立即离心并送上清到苏北医院测定酶活、1只立即离心测定总脱氢酶酶活、另外1只立即-20℃冷冻保存,待分离微生物与微生物DNA的测定。
培养结束后,取20mL培养液分装两个离心管,用于分离微生物及测定其他指标,剩余的于-20℃冷冻保存备用。
1.7测定指标及方法
1.7.1谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶测定离心后区上清送苏北医院,采用生化自动测定仪测定。
1.7.2总脱氢酶测定取100目尼龙布过滤的新鲜瘤胃液2ml于试管中,加入0.2ml1.5%的氯化三苯四氮唑(TTC)反应,而对照管先加入5ml异丙醇抑制酶反应。
在厌氧条件下恒温水浴(38-39℃)10分钟。
处理组加入5ml异丙醇终止反应后,以4000rpm离心10分钟。
上清液稀释15倍,于分光光度计在485nm处比色。
定义在38.5℃、pH6.8条件下,每分钟引起测定液吸光度上升0.1的酶量定义为1个酶活单位。
活力单位(U/ml)=(样品A485nm/min-对照A485nm/min)*15。
1.7.3微生物分离与其DNA的测定微生物的分离具体步骤参考Czerkawshi(1976),Brandt等(1981),Martí
n-Orú
e和Balcells(1998),欧宇(2003)等的方法。
(1)原虫:
取瘤胃液加等体积生理盐水置于恒温(39℃)水浴锅中震荡(125r/min)水浴孵育60min,并辅以搅拌;
再经4层纱布过滤,滤液离心(150g,10min),收集沉淀为原虫,用生理盐水洗涤两次后用生理盐水悬浮,-20℃贮存待测。
(2)细菌:
收集
(1)离心后上清,再高速离心(22,000g,15min),收集沉淀为细菌,其余处理同
(1)。
微生物DNA测定具体步骤标准溶液:
取小牛胸腺DNA钠盐以0.01M氢氧化钠溶液配成200µ
g/ml的DNA标准溶液。
二苯胺试剂:
称取1g重结晶二苯胺,溶于100ml冰乙酸(AR)中,再加入10ml过氯酸(60%以上),混匀待用,临用前加入1ml1.6%乙醛溶液。
标准曲线:
分别取DNA标准溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0ml置于试管中(两个平行),加入去离子水补到2ml,分别加入二苯胺试剂4ml,混匀,60℃水浴60min,冷却,混匀,595nm比色。
以各管中的DNA量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。
样品测定:
样品2ml,加二苯胺试剂4ml,反应与检测同上。
以样品的光密度值从标准曲线上查出相对应DNA含量。
1.8统计分析
Excel整理数据和作图,用SPSSv16.0中comparemean的One-way-ANOVA方差分析和LSD多重比较。
2结果与分析
2.1对培养液乳酸脱氢酶等酶动态变化的影响
由表2、图1可见,培养液乳酸脱氢酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶等随时间培养时间的延长不断提高,其中以菜籽油组变化幅度最大、豆油次之,玉米油与花生油组与对照组接近,变化幅度不大。
各个时间点比较,其中谷草转氨酶、谷丙转氨酶随时间变化的幅度较大,同一处理的各个时间点间有显著变化(p<
0.05);
而乳酸脱氢酶随时间变化的幅度不大,同一处理的各个时间点间没有显著差异(p>
表2培养液乳酸脱氢酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性
组别
0h
4h
8h
16h
24h
SEM
p
乳酸脱氢酶(LDH:
IU/L)
对照
0.007±
0.006
0.003±
0.000±
0.000
0.013±
0.015
0.256
A花生油
0.010±
0.010
0.023±
0.068
B菜籽油
0.030±
0.002
0.033±
0.060±
0.009
0.011
C玉米油
0.017±
0.012
0.008
0.507
D豆油
0.027±
0.020±
0.509
谷草转氨酶(GOT:
9.67±
0.58b
8.67±
0.58b
10.33±
1.15b
12.33±
0.58a
0.596
0.001
14.33±
15.33±
14.00±
1.00b
16.33±
0.58ab
18.67±
1.15a
0.760
107.00±
2.65c
108.67±
2.31c
107.33±
4.62c
123.33±
5.86b
142.67±
4.51a
3.432
26.67±
1.53b
29.33±
27.67±
35.00±
2.00a
37.67±
2.08a
1.333
58.67±
2.08c
66.33±
3.51b
64.00±
1.73bc
65.33±
1.52b
72.33±
1.764
谷丙转氨酶(GPT:
16.00±
1.00b
18.33±
0.58ab
17.00±
1.00ab
0.789
0.017
24.00±
1.73b
24.67±
25.33±
29.67±
1.53a
1.095
147.67±
7.02c
175.00±
7.00b
176.67±
4.93b
188.67±
4.51ab
201.33±
8.08a
5.270
47.33±
51.00±
4.00b
49.33±
53.33±
64.67±
3.79a
2.201
82.67±
3.79c
95.00±
2.00b
90.33±
3.51bc
93.67±
2.08b
102.00±
2.64a
2.366
注:
同行肩标字母相同,表示不显著(p>
0.
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