基因工程期末习题.docx
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基因工程期末习题
基因工程期末复习整理
第一章
一.基因(gene):
从化学上来说,指的是一段DNA或RNA顺序,该顺序可以产生或影响某种表型(genotype,phenotype),可以由于突变生成等位基因变异体(体细胞父源和母源;正常和突变基因);从遗传学上来说,基因代表一个遗传单位,一个功能单位,一个突变单位。
二.基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用,包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术/狭义的基因工程);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
三.基因工程的基本过程:
1、从供体细胞中分离出基因组DNA,用限制性核酸内切酶分别将外源DNA(包括外源基因或目的基因)和载体分子切开(简称切);
2、用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上,形成DNA重组分子(简称接);
3、借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中(简称转);
4、短时间培养转化细胞,以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中(简称增);
5、筛选和鉴定转化细胞,获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞(简称检)。
基因工程的上游操作过程可简化为:
切、接、转、增、检。
4.基因工程诞生的理论基础
(一)理论准备
1、遗传因子
GregorMendel于1865年在“布隆自然历史学会”上宣读了他的《植物杂交实验》论文,并于1866年发表于该会的会议录上。
1909,丹麦W.Johannsen(约翰逊)为了强调“遗传因子”与生命的关系,他根据希腊“给予生命”之义的词“gene”(基因)创造性地用“gene”这个术语来代替“遗传因子”。
---基因术语的提出
2、DNA是遗传物质
a、肺炎双球菌转化实验
b、噬菌体转染实验
3、DNA双螺旋模型
1953年J.watson和F.Crick根据碱基配对规律和DNA分子的X射线衍射图谱等实验,提出了DNA分子的双螺旋结构。
(二)基因工程诞生的技术突破
1.限制性内切酶(“基因剪刀”)-基因工程技术诞生的第一个技术准备
载体(“交通工具车子”)-基因工程技术诞生的第二个技术准备
第二章
一.限制性核酸内切酶
1、定义:
指一类能够识别双链DNA分子中的某特种特定核苷酸序列(4—8bp),并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。
2、来源:
原核生物
3.性质:
内切酶,在核酸分子链的内部制造切口的酶。
4.功能:
自我保护作用(限制修饰系统存在的意义)
三.限制性内切酶的命名
1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。
大肠杆菌(Escherichiacoli)用Eco表示;
流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)用Hin表示。
2.用一个右下标的大写字母表示菌株或型。
如Ecok,EcoR(现在都写成平行,如EcoRI)。
3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统,用罗马字母表示。
如EcoRI,EcoRV。
4.限制酶前面要带上R(Restriction),修饰酶前面要带上M(Modification)。
(现已省略)。
四.影响限制性内切酶活性的因素
1.DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。
一般采取
①纯化DNA
②加大酶的用量1mgDNA用10U酶
③延长反应时间
④扩大反应体积(>20l)
2.DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒:
dam甲基化酶(修饰GATC中的A);
dcm甲基化酶(修饰CCA/TGG的C)。
3.温度
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。
大多数是37oC,少数要求40-65oC。
4.缓冲液(Buffer)
是影响限制酶活性的重要因素。
温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。
所以一般使用专一的反应缓冲液。
五.DNA连接酶(DNAligase)
1、定义
催化双链DNA片段靠在一起的3`-OH末端和5`-P末端形成3`,5`-磷酸二酯键,使两末端连接的一种核酸酶。
2、种类
依据来源可分为两类:
(1)大肠杆菌连接酶
只能连接粘性末端。
(2)T4噬菌体的连接酶
不但能连接粘性末端,
还能连接齐平末端。
3、DNA连接酶的基本性质
1)修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键。
2)修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键
3)连接多个平头双链DNA分子:
4.DNA连接酶发挥作用的影响因素:
连接条件
(1)必须是两条双链DNA。
不能催化两单链DNA分子连接;
只能连双链DNA分子的单链缺刻(nick);不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺(gap)。
(2)DNA3’端有游离的-OH,5’端有一个磷酸基团(P)。
(3)需要能量动物或噬菌体中:
ATP大肠杆菌中:
NAD+
连接反应的温度
最佳温度连接酶反应的最佳温度是37C。
实用温度在37℃下粘性末端的结合很不稳定。
所以一般采用4~16C
六、DNA聚合酶
常用的DNA聚合酶的特点
把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。
2.主要区别
持续合成能力和外切酶活性不同。
T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。
其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。
3.大肠杆菌DNA聚合酶I
(1)大肠杆菌DNA聚合酶I的性质
①一条单链多肽。
②5’3’DNA聚合酶活性。
③5’3’外切酶活性④3’5’外切酶活性
⑤5’3’外切酶活性位于N端。
6用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。
就成为Klenowfragment。
4.
(1)Klenowfragment的性质
具有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性。
(失去了5’3’外切酶活性)。
(2)主要用途
①3’端补平
补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。
②DNA3’末端标记
在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。
5.
(1)T4DNA聚合酶的性质
①来源
从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。
由噬菌体基因43编码。
②酶活性
有5’3’聚合酶活性和3’5’外切酶活性(约为Klenow片段活性的200倍)。
③T4DNA聚合酶特点
当没有dNTP时,T4DNA聚合酶行使3’5’外切酶功能,制造出3’隐蔽端。
如果只有一种dNTP,则外切至该dNTP互补核苷酸暴露时停止。
在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位。
T4DNA聚合酶的用途
1补平3’隐蔽末端②DNA3’末端标记标记末端(取代合成法)
6.逆转录酶
(1)来源最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒(avianmyeloblastosisvirus,AMV)
(2)禽源反转录酶的性质由和两条多肽链组成。
①链有反转录活性和RNaseH活性。
②链RNA-DNA杂交双链中5’3’DNA外切酶活性。
逆转录酶的用途
①合成cDNA
②合成DNA探针
2RT-PCR用的模板
7.载体(Vector):
是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。
载体的功能:
(1)为外源基因提供进入受体细胞的转移能力
(2)为外源基因提供复制能力或整合能力
(3)为外源基因提供在受体细胞中的扩增或表达能力
一个理想的载体至少应具备下列几个条件
(1)具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)
(2)具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点
(3)具有较高的外源DNA的载装能力
(4)具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点
(5)具有合适的筛选标记
8.质粒(Plasmid):
是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子即cccDNA,能自主复制,并在细胞分裂时遗传给子代细胞。
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
质粒DNA的分子量范围:
1-100kb
质粒的基本特征
1、质粒的自主复制性
2、可扩增性
质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系,根据在每个细胞中的分子数(拷贝数)多寡,质粒可分为两大复制类型:
严紧型复制1-3拷贝stringentplasmid
松弛型复制30-50拷贝relaxedplasmid
3、可转移性
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类:
接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞(接合作用),如F、Col、R质粒等。
非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员。
值得注意的是,某些非接合型质粒(ColE1)在接合型质粒的存在和协助下,也能发生DNA转移,这个过程依赖于mob基因产物与其他蛋白因子的相互作用。
4、质粒的不相容性
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒,不能同时存在于一个细胞中,这种现象称为质粒的不相容性。
5、携带特殊的遗传标记
•野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因,这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状,包括:
•物质抗性抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物
•物质合成抗生素、细菌毒素、有机碱
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
质粒的改造与构建的指导思想:
1.尽量缩小相对分子质量(3∽10kb);
2.灭活某些质粒的编码基因,如mob基因;
3.具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入;
4.具有插入失活筛选标志,便于从平板上直接筛选阳性重组子;
5.根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件或用于表达产物亲和层析分离的标签编码序列。
作为载体的质粒一般具有以下特点:
●分子相对较小(3∽10kb);
●具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入;
●具有插入失活筛选标志,便于从平板上直接
筛选阳性重组子;
●质粒能携带的外源DNA片段一般较小(<15kb)
pBR322
●p:
代表质粒
●BR:
代表研究质粒的研究者(Bolivar&Rogigerus)
●322:
与科学家有关的数字
元件来源
①复制起点ori
pMB1系列(来源于ColE1)的高拷贝型复制起点
②AmpR基因
pSF2124质粒的AmpR基因
③TetR基因
pSC101的TetR基因。
蓝白斑选择原理:
①Xgal
(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside即5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)
②-半乳糖苷酶Xgal显色反应:
-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。
3.IPTG的诱导作用
IPTG是乳糖的类似物。
能诱导lac操纵子的启动转录,使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’肽都表达。
从而互补。
IPTG诱导的结果:
MCS无插入时,互补,蓝菌斑。
MCS有插入时,不互补,白菌斑。
(四)质粒DNA的分离纯化
•氯化铯密度梯度离心法
质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染
•沸水浴法
质粒DNA纯度底、快速、操作简便
•碱溶法
质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间
提取质粒dna的原理和方法
碱溶法
实验原理
在pH12-12.5时,线性DNA被彻底变性,但共价闭环质粒DNA虽然H键也发生断裂,但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。
当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时,溶液恢复中性,质粒DNA迅速复性,染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕,不能复性,从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。
实验步骤
接种含某质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/mlAmp抗生素的LB液体培养基
37℃摇培过夜(10~12h)
12000rpm,3min
弃去上清液,倒立于滤纸之上,尽量去净上清。
加100μlⅠ液,涡旋震荡,充分混匀
配制适量的Ⅱ液
加200μlⅡ液,迅速轻轻混匀(以颠倒EP管5-10次为宜),
冰浴,5-10min,此时应有丝状物出现。
加150μlⅢ液,轻轻混匀,冰浴,5min以上
此时应有絮状物出现。
↓12000rpm,5min
取上清液,加等体积的酚-氯仿-异戊醇,涡旋振荡,使溶液呈现乳白色,5min
↓12000rpm,10min
取上清液,加2倍体积的冷乙醇,混匀,-20℃,30min
↓12000rpm,10min
弃去上清液,用70%乙醇清洗沉淀
↓干燥
加20μlTE溶解,4℃保存
噬菌体的一般特性
噬菌体是一类细菌病毒(Bacteriophage)。
结构;蛋白质外壳内包裹着DNA(双链、单链、线性、环状等)。
噬菌体载体的构建原理
(1)删除噬菌体的非必需区,留出插入空间。
(2)删除多余限制位点
(3)灭活某些与裂解周期有关的基因,避免生物污染。
(4)引入合适的筛选标记基因,便于重组噬菌体的检测。
人工构建的噬菌体载体有两种类型:
①插入型载体(insertionvectors):
②替换型载体(substitutionvectors)
Cosmid的结构
Ø含有抗药性标记和质粒复制起始位点
Ø一个或多个单一限制酶切位点;
Øcohesiveend;
Ø分子小(4-6kb),可容纳大到40-50kb的外源DNA片段,因此适于构建真核生物基因组DNA文库。
Ø选择方法:
抗生素抗性筛选
Cosmid的特点
1、具有λ噬菌体的特性
柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA,并在体外被包装成噬菌体颗粒之后,可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
2、具有质粒载体的特性
柯斯质粒载体具有质粒复制子,因此在寄主细胞内能够像质粒DNA一样进行复制,并且在氯霉素作用下,同样也会获得进一步的扩增。
此外,柯斯质粒载体通常也都具有抗菌素抗性基因,可供作重组体分子表型选择标记。
3、具有高容量的克隆能力
柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点,一两个选择记号和COS位点等三个组成部分,其分子量较小,一般只有5~7kb左右。
因此,柯斯质粒载体的克隆极限可达45kb左右。
4、具有与同源序列的质粒进行重组的能力
一旦柯斯质粒与一种带有同源序列的质粒共存在同一个寄主细胞当中时,它们之间便会形成共合体。
YAC(YeastartificialChromosome)
ØCentromere(着丝粒)CEN
ØAutonomouslyreplicatingsequence(自主复制序列)ARS
ARS:
最初指那些酵母自主转化效率大大提高的DNA序列;这些序列在酵母中也是染色体上的复制起始位点。
ØTelomere(端粒)TEL
YAC的特点:
Ø它可携带长达200-1000kb的DNA片段,
Ø用YAC克隆DNA的过程与λphage相似
Ø将DNA大片段与载体的两臂相联,然后将连接混合物转化进酵母细胞中,
Ø选择方法:
Ampicillin,TRP1andURA3
目的基因的获取
(1)通过建立基因文库分离目的基因
(2)化学合成法制备DNA片段
(3)聚合酶链反应法扩增基因片段(PCR)
1.基因文库(genelibrary)
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段,并将所有这些片段都与适当的载体连接,引入相应的宿主细胞中保存和扩增。
理论上讲,这些重组载体上带有了该生物体的全部基因,称为基因文库。
2。
cDNA文库:
利用某种生物的总mRNA合成cDNA,再将这些cDNA与载体连接,转入细菌细胞中进行保存和扩增,称cDNA文库。
3.Library质量的评价:
(1)文库的代表性(Representativegenelibraries)
(2)Gene片段的完整性
文库的代表性:
指genelibrary中包含的DNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性,它是体现文库质量的最重要指标。
4.构建cDNA文库的一般步骤
(1)总RNA(totalRNA)提取提取总RNA有商业化的试剂盒(kit)。
(2)mRNA的分离纯化①原理
利用mRNA都含有一段polyA尾巴,将mRNA从总RNA(rRNA、tRNA等)中分离纯化。
mRNA只占总RNA的1%-2%。
②mRNA的分离纯化
Column(柱)
分离mRNA用商业化的OligodT纤维柱。
(3)cDNA的合成
①cDNA第一链合成
逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。
用OligodT(或随机引物)作引物,合成cDNA的第一链。
③cDNA第二链合成
剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构(机理不明),可成为合成第二条cDNA链的引物。
用DNA聚合酶合成第二链DNA.。
④去掉发卡结构
用核酸酶S1可以切掉发卡结构(但这会导致cDNA中有用的序列被切掉!
)。
5.载体与基因组DNA大片段的连接:
①粘性末端直接连接
②人工接头法(adapter)
③同聚物加尾
6.基因工程的操作过程
ADNA的体外重组(切、接)
B重组DNA分子的转化和扩增(转、增)
C转化子的筛选和鉴定(检)
7.PCR克隆目的基因的基本程序
由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中,其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基,而且这个碱基几乎总是A,因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。
由于该突出碱基的存在,克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接,也可以使用专门的T载体克隆。
8.重组率的定义
重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数
在常规实验条件下,重组率一般为25-75%
重组率是衡量连接反应效率的重要指标,较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。
8.转化(transformation):
指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
9.转化率的定义
转化率是衡量转化效率的重要指标,其定义为:
每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。
由于在一般的转化实验规模下,每个受体细胞最多只能接受一个载体分子,因此转化率的定义也可以表征为:
每微克载体DNA转化后,受体细胞接纳DNA的个数,即克隆数(在筛选时,未接纳载体或重组子的受体细胞不长)
10.转化率的影响因素
1)载体及DNA重组分子方面:
载体本身的性质:
不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同。
载体的空间构象:
质粒的超螺旋构象转化率最高,经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复,其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级。
插入片段的大小:
对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低。
2)受体细胞方面:
受体细胞必须与载体相匹配,例如:
pBR322转化大肠杆菌JM83株,转化率很低;但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高。
3)转化方法方面:
受体细胞的预处理:
影响最大
供受体的比例:
Ca2+诱导转化0.1ml感受态细胞50ngDNA
转化方法:
电穿孔转化108-109/mgDNA
Ca2+诱导转化107-108/mgDNA
l-DNA转染107-108/mgDNA
11.转化子的筛选和鉴定(检)
载体遗传标记检测
克隆DNA序列检测
外源基因产物检测
由于重组率和转化率不可能达到理想极限,因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。
1、抗药性筛选法
基本原理:
抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。
将外源DNA片段插在EcoRI位点:
非重组子呈Apr、Tcr
重组子呈Apr、Tcr
将外源DNA片段插在BamHI位点:
非重组子呈Apr、Tcr
重组子呈Apr、Tcs
2、显色筛选法
1)显色筛选法的基本原理:
显色筛选法可以区分转化子与非转化子,也可区分重组子与非重组子。
其原理是:
载体分子上携带某种显色酶基因,其表达产物能使细胞产生颜色反应,从而易于辨认和挑选,如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因(蓝色反应)。
2)显色筛选法的基本操作:
将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部,使之灭活,此时重组子呈Apr、lacZ-,淡黄色菌落;而非重组子则呈Apr、lacZ+,蓝色菌落。
3、营养缺陷型筛选法
1)营养缺陷型筛选法的基本原理:
载体分子上携带某种营养组份的合成基因,而受体细胞本身不能合成这一营养组份,将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上,长出的便是转化子。
营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子,一般不能区分重组子与非重组子。
2)常见的营养缺陷型筛选标记:
用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+
用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk,相应的受体细胞则选择tk-缺陷型。
第三章
一.大肠杆菌表达外源基因的优势
(1)全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架
(2)基因克隆表达系统成熟完善
(3)繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定
(4)被美国FDA(食品和药物管理局)批准为安全的基因工程受体生物
二.大肠杆菌表达外源基因的劣势
(1)缺乏对真核生物蛋白质的复性功能
(2)缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统
(3)内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白
(4)细胞周质内含有种类繁多的内毒素
三.基因表达(Geneexpression):
基因通过DNA的转录和RNA的翻译过程,将其所携带的遗传信息转变成蛋白质的过程叫geneexpression。
四.启动子(promoter):
位于基因上游的一段具有特殊功能DNA序列,RNA聚合酶正在通过与它的结合作用而启动基因的转录。
五.报告基因(Reportergene):
特指其编码产物能够被快速检测,常用来判断外源基因是否己经成功地导入寄主细胞,器官或组织一类特殊基因。
一般试验中,报告基因编码区在目的基因的下游位置,并共用目的基因的启动子。
因此,报告基因实际上起到判断目的基因是否表达的标记基因的作用。
六.终止子(terminator):
转录起始以后,RNA聚合酶沿着DNA链一直向下移动,同时合成RNA链,延伸直至到达一个特定的终止序列或终止结构时就停止,这一特定的结构称为终止子(terminator)。
七.可调控强启动子的基因表达
持续地、高水平地表达某一目的基因对宿主细胞是有害,其原因:
Ø过分消耗宿主细胞的营养和能量;
Ø经过几个组合分裂周期以后,表达基因的质粒可能会部分或全部丢失;
Ø需要可调控的强启动子
使目的基因只在宿主细胞生活的某一个特定阶段表达、且只表达一段时间。
八.五种可调控的启动子
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