NRC版2基本概念与方法Word文件下载.docx
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与禽类和小鼠(很多营养研究中的实验动物)相比,鱼虾由于遗传多样性,在营养试验中的特征和反应存在更宽的差异。
这种同物种内的差异主要由遗传和环境造成。
水生动物在相对较长时间内缺少驯养,是其与家畜或实验动物(鼠)之间最主要的区别。
试验养殖系统
养殖系统的设计是营养试验中提高试验结果可靠性的一个重要的因素。
养殖系统设计的最终目标,是使养殖动物通过有效的饲料利用,发挥并达到其生长潜能。
营养试验中使用的养殖系统主要有:
流水式、循环式、半循环式以及静水式。
每一种系统都有缺点,但是选择一种养殖系统的目的,是为试验动物提供适宜的生长环境,利于其正常生长。
使用没有连续水流的养殖系统时要求严格管理水质,以避免代谢物的积累而降低动物的生长及影响其他性能指标。
因此,静水养殖需要有规律的换水,它可以一定程度上中断对养殖动物生长性能的负影响。
循环养殖系统需要生物物理过滤系统,来阻止影响鱼类生长的代谢产物和微粒(间接细菌量的增加)的积累。
流水养殖系统也需要控制水质条件,使其不受时间和空间的影响。
理想的养殖系统需要将各重复处理间相互隔离,也就是说,一个处理组的水不能流入其他处理组。
这种设计可有效地避免一个试验组的代谢产物在水的流动过程中转移和积累,而影响其他处理组。
虽然这些代谢产物可能是短暂性的,但是小的积累仍会影响水中生物的生长。
因此,在营养试验中要禁止使用串行方式输送水的养殖系统。
每个试验组(如一缸鱼即为一个重复)的养殖容积十分重要,每一个处理组都必须要有足够大的容积,以避免是容积成为限制因素而不是营养水平差异造成的结果的出现。
D’Abramo等在对幼虾(Macrobrachiumrosenbergii)研究时发生过这种情况。
因此,养殖系统的容积设定应建立在预期的最终生物体的密度(生物量)之上。
足够的养殖容积以及适当的水流速度将会消除养殖容器对试验的误差。
单个试验系统,不管是水槽、容器还是玻璃缸,都是是方便观察、数据分析的代表单元。
进行方差分析或者其他数据分析时,前提假设都是每一个处理组都是相互独立的,包括水源。
分配到每个养殖单位内的生物数量,主要取决于所研究的动物种类。
每个处理组内实验动物的数量,一定要远小于能产生等级摄食行为和发生不平等性别比例的数量。
如果每个处理组内试验动物数量不止一个,应以处理组的整体参数用于数据分析。
在某些情况下,如果处理组内的试验动物可明显区别的,它们的个体参数也可以作为评价指标。
如果是两个处理组相比较,简单的t检验是首选的数据检验方法。
如果每个处理组内的每个试验动物在整个试验过程中不同时间段的重量(包括初始体重和末体重)都有记录,那么就可以计算出生长率指数。
以每个动物在不同时间段内的体重的对数做直线回归图,其斜率就是生长率指数。
然后将每一处理组的生长率指数作方差分析来确定各处理组间是否有显著差异。
然而,反复称量试验动物将产生应激导致死亡。
试验对象
鱼虾的来源、品系、生长阶段、以往营养史和环境都将影响营养试验的结果。
所研究的鱼虾的来源和遗传背景需要被了解和报道,否则后续将无法操作试验差异的比较,因为遗传背景影响动物的生长。
获得试验动物充足的生长率,对比较营养物质间的差异非常必要。
了解试验动物的年龄,可以避免一些由年龄引起的生长差异导致的不令人满意的结果。
根据试验目的,使用来自同一亲本或者几个亲本的试验对象有助于减小系统误差。
如果试验对象由多个卵子发育形成,按一定比列将其分配到各个处理组中,可以减少由不同亲本造成的系统误差。
试验日粮
为了确定营养需求量,我们需要设计几个特定营养素在营养水平和组成上有变化(上升、下降或者缺乏)的日粮。
研究人员通常采用由特定原料或化学物组成的基础日粮,即半纯化的日粮,这种日粮可以很好的控制试验日粮的营养组成(尤其是所研究的营养素)。
然而,对于很多动物来说,当饲用纯和日粮时,其饲料利用率和生长都显著低于其最适水平。
因此,可以采用由已知营养组份和被证明有助于目标鱼类的维持正常增重率的原料配制而成的日粮,来评估鱼类最终能达到的生长潜力。
基础日粮可由应用日粮原料(如,小麦和鱼粉)或者半纯化日粮原料(如,淀粉和酪蛋白)配制而成。
另外,一些实际日粮原料因某种营养素含量较高,会促使它在营养需求试验研究中的使用。
使用实际原料时应确保除了所研究的营养素之外的所有其他营养素应维持在同一营养水平上。
通过严格控制实际原料成分的质量和数量,可以确定所要研究的营养素的合适的水平范围。
对一些种类来说,活饵日粮可以作为参考,它为试验动物和养殖系统在试验中的充分表现提供了重要的基础信息。
该参考日粮可以在数据分析中与其他试验日粮进行比较。
但是,来源于参考日粮的数据不能用于采用化合物组成的日粮评定营养需求量的试验中。
无论是使用半纯化日粮还是实际日粮,为了确保所需的物理特性得到控制,必须做充分的日粮准备。
饲料中的原料必须来源一致。
混合完全后,所有原料必须粉碎到统一粒径,接着再次混合确保其均匀性。
饲料制粒成型后应尽快被试验动物饲用耗尽,尽可能地避免由于温度过高降低营养素(尤其是所研究的营养素)的生物利用率。
在试验过程中应低温保存(通常冷冻)饲料以确保其新鲜性(营养完整)。
少量的饲料在饲喂前可储存在4℃环境下。
养殖试验开始前,必须检测日粮以确定所研究的实际营养水平是否和理论值一致。
养殖试验的结果必须以日粮中的实际营养水平为基础进行分析。
如果没有检测日粮营养水平,可能导致错误的结果出现。
准确确定营养需求量需要足够多的包含营养素不同水平的处理组,并且日粮中其他营养素能够满足试验动物的需求量。
不添加目标营养素的基础日粮为反应变量的估计提供了基础水平。
其他试验日粮应包含从缺乏到超过其预期需求量的所有营养水平。
营养需求量的试验设计通常先以较大范围的间隔水平来初步预测反应。
再通过试验结果选择适当小的范围来精确估计需求量。
一般来说,在选定范围内应该设定至少五个营养水平。
饲养管理和试验周期
试验动物通常需要饱食投喂来确保其最大生长,以便各组饲料之间如果存在差异的话,就使其能表现出来。
可通过合适次数的饱食投喂和提供略微大于试验动物在特定生长时期所消耗的饲料量,来达到其最大生长。
提高饲料利用率,主要侧重于减少未吃食饲料量、回收未食饲料和减去未食饲料量。
投喂频率是试验设计中一个重要的考虑因素,不同种类和不同生长阶段应采用不同的投喂频率。
对幼年快速生长阶段的动物每天投喂数次并逐渐调整,将有助于其生长。
当试验饲料改变时,很多鱼类在短时间内会降低饲料摄入量。
在进行试验前,应使用饲料驯化鱼虾一段时间,使其适应养殖环境及饲料。
一般情况下,驯化饲料的营养成分和组成应与试验饲料相接近。
这样就可确保每个处理组的试验动物在试验开始时都处于同样的营养状态。
幼年阶段动物的生长速度快于成年动物,因此其对营养物质不同水平的反应更灵敏。
当选择增重率作为评价指标时,应着重考虑试验结束时其值能否达到足够高的水平来反应各处理组间的差异。
对于生长速度快的动物,其增重率应高于1000%(初始体重的10倍);
但是对于较大的鱼类以及虾,增重率达到200%-300%便可接受,通常以增重率达到300%(比初始体重大两倍)为标准。
前面提到的增重率只是参考,由于试验目的和试验动物生长阶段的不同其实际增重率会偏低。
试验周期由水温和营养素的反应时间决定。
当各处理组间出现差异,可提前结束试验。
但是,如果提前结束试验,各营养水平间的潜在的重要差异反应就可能无法观察到。
有人建议养殖周期应为8-12周,但是随意指定一个特定的时间周期是不合适的(Cowey,1992)。
如果进行剂量效应试验,较大的增重率可以作为重要的剂量效应关系的评价指标。
增重率是最常见的评价指标,但是不一定是最合适的(Baker,1986)。
试验设计的重复性
需求量的判定通常以回归试验设计为基础。
各处理组内重复的数量,由试验动物反应的差异所决定。
试验中鱼虾的反应,是由处理组和实验生物差异共同作用的结果。
各处理组间的差异,应高于由各重复间养殖系统造成的实验生物差异。
当试验重复不多且有较大的系统误差时,将会导致处理组间的显著差异无法产生。
试验处理的重复数量由试验设计、种类、鱼虾的品系和试验目的所决定。
有力的数据分析可以决定重复数量,从而使统计结果更准确和可靠(BausellandLi,2002)。
建议一种能从无效的假设中获得充分原因的能力非常重要。
样本大小的分析与计算为试验设计的合理性提供了基础。
评价指标
营养平衡的饲料应能满足养殖动物的生长和生理需求。
饲料成分包含对生长有促进、抑制或者无影响的化合物。
研究者在设计试验时应考虑哪些生理指标可以准确反映养殖动物对其所研究的营养物质、添加剂和代谢调节剂的整体利用效果。
增重
生长即新组织的沉积,是评价饲料中某种营养素价值而普遍使用的指标。
水生动物的生长由其生长阶段、遗传品系、环境条件和营养素摄取等决定。
生长可以由生物体在重量和长度上的变化来表示,而增重在水生动物营养研究中应用最广泛。
如果选择相同重量的试验动物,其增重就可反映不同饲料组间的试验效果。
相关生长率指标的计算方法如下:
平均重量=总的实验动物重量/试验动物数量
增重=末体重-初始体重
增重率=(末体重-初始体重)×
100/初始体重
瞬时生长率=初始体重×
(1+α/100)×
时间
其中α=(Ln(Wt)-Ln(W0))×
100/t
生物处于不同生长阶段时应选用不同的生长指标来表示(Dumasetal.,2010)。
动物生长不是几何性的。
例如,幼年阶段的生长大部分是指数型增长,因此瞬时生长率(IGR)是合适的评价指标。
然而,采用指数生长模型描述鱼类其他生长阶段的生长轨迹是不合适的,即使有相关不正确的报道(Dumasetal.2010)。
另外,瞬时生长率极容易受初始体重和不可避免的系统误差的影响。
虽然IGR仍被作为生长率的计算公式在使用,但是因为它不能广泛代表鱼类的生长趋势而具有严重的局限性,并且在整个试验过程中不具有可比性,因此这个数学模型是不恰当的而应停止使用。
单位热生长系数是以体重的1/3次方为基础用来预测鱼类生长和温度间的关系(IwamaandTautz,1981)。
单位热生长系数(TGC)=(FBW1/3-IBW1/3)/Σ(T×
D)×
100
预测末体重=(IBW1/3+Σ(TGC/100×
T×
D))3
其中IBW为初始体重(g/fish),FBW为末体重(g/fish),D是养殖天数,T是水温(℃)。
在对虹鳟、湖红点鲑、斑鳟、大鳞大麻哈鱼、大西洋鲑等研究中发现,该模型方程可以在很大温度范围内拟合鱼类的实际生长曲线。
单位热生长系数模型被广泛应用于水产相关文献中(e.g.,Einenetal.,1995;
Kaushik,1998;
Willoughby,1999;
SteadandLaird,2000;
Hardyandbarrows,2002)。
Lupatsch等(2003)使用了一种与TGC类似的生长模型,但采用了不同的体重参数来描述鲷鱼、黑鲈和石斑鱼的生长趋势。
生长率和热生长系数受试验动物的种类、种群、营养、环境、饲养管理和其他因素的影响。
因此,在特定养殖条件下,热生长系数可以以过去的生长数据或者相似物种和饲养条件下的生长数据为基础计算得到。
这一模型最近已被应用在虹鳟整个生命期的不同生长阶段(Dumasetal.,2007),并可以在较广的时间范围内预测虹鳟的生长。
尽管热生长系数模型使用方便,但是当温度与试验动物最适生长温度相差太大时会造成系统误差(Krogh,1914;
Hayes,1949;
Ricker,1979;
Jobling,2003)。
饲料利用
动物新组织的沉积反映了营养成分的保留,但由于受饲料组成、饵料消耗和生理状态的影响,因此并不是一个常数。
饵料系数(FCR,摄食量/体增重量)和饲料效率(FE,体增重/摄食量*100)常被用来描述饲料与增重间的转化率。
这些指标只是转化率的部分量化描述方式,因为体组织和饲料中的营养成分都可能变化。
因此,这些指标主要是用来评估经济实用性,而为动物的营养物质利用只提供了有限的描述性信息。
要准确的评定转化效率,只有通过准确估计未吃完的饲料和高存活率来完成。
其他物种相关研究的评价指标常被借鉴采用,但并不适于所有情况。
例如,用从小鼠的研究中借鉴而来的蛋白质效率来评价蛋白质量,当饲料蛋白水平和日采食量确定并在需要量以下时,定义为体重增加量与蛋白质摄取量之比。
这种方法适用于在一个独立试验中各处理组间的对比,但是不同试验条件下的试验之间无法进行对比。
更多的评价试验动物对不同饲料反应的指标,通常需要确定增加的体重的组成。
体组织成分
由蛋白质而不是脂肪沉积而成的瘦肉组织,是水生动物主要的增重方式。
因此,在大多数营养试验中,需要测定试验前后的全鱼体组成营养成分(蛋白、脂肪、灰分和水分),然后计算得到总能。
饲料蛋白、脂肪和能量保留率计算公式如下:
保留率%=((末体重×
末营养组成)-(初始体重×
初始营养组成)×
100)/摄取的营养物质量
动物需要足够量的营养平衡的食物来满足其由基因决定的生长需求(Oldhametal,.1997),如最大蛋白质合成量、相关胴体的瘦肉组织的生长率决定的营养需求量和生长组成(SchinkelanddeLange,1996)。
因此,Rodehutscordetal.(1997),Susenbethetal.(1999),和HaulerandCarter(2001)等提出蛋白质沉积由氨基酸的需求量来决定的,而氨基酸的需求水平主要与蛋白质和赖氨酸的保留率有关。
营养需求的估计量受评价指标选择的显著影响。
例如,以最大蛋白增加量为评价指标得到的需求量,要明显高于以最大增重量为评价指标得到的值(BureauandEncamagao,2006)。
在微量元素(如矿物质)的营养需求研究中,增重率和蛋白质保留率不能作为评价指标。
WilsonandEINaggar(1992)指出斑点叉尾鮰的增重率不能评价其饲料中钾的供给量,而应该以全鱼体组织中钾的沉积量为评价指标。
罗非鱼的钾(ShiauandHsieh,2001)、钠(ShiauandLu,2004)和锰(Linetal.,2008a)以及石斑鱼的硒(LinandShiau,2005)和铜(Linetal.,2008a)的需求量研究中都以体组织中矿物质沉积量为评价指标。
对于其他的营养素如维生素,以酶活、组织中该营养素含量或者代谢产物作为评价指标,比以增重率为指标更合适。
但是在长期研究中,生长数据仍是评定微量元素的需求量的一个重要指标。
因此,在微量元素研究中,要同时考虑生长、摄食和组织中的相关指标。
除了生长指标,矿物质和维生素营养需求量的研究中常采用组织中酶活活性指标,因为其可以反映这些特殊营养物质在动物体内的营养状态(Cowey,1976)。
然而,以维生素的关键酶活性为指标来确定需求量的方法是不成功的(Yenetal.,1976;
Andersonetal.,1978)。
Baker(1986)也质疑了该方法,他认为处于生长状态的动物其最大酶活活性是不可测定的。
尽管如此,酶活活性常被作为早期缺乏症状的指示指标。
最近的研究表明,饲料营养素可以影响基因表达的产物,这方面的研究为营养需求量的确定提供了依据。
维生素以及其他营养素(如磷脂类)的缺乏或者过量都会影响骨骼发育的基因表达。
营养需求量的评价方法
方差分析均值、非线性回归和各种线性动力模型等统计方法常被应用在水生动物的营养需求的数据分析过程中。
在单因素浓度梯度法研究中,方差分析均值比较不是很好的分析方法。
这种方法不能准确估计动物达到最佳生长状态时的被试营养物质的最低水平。
如果营养水平存在显著差异时,相对于均值比较,回归分析和拟合反应曲线成为估计营养量的最佳方法。
而拟合反应曲线如非线性模型和线性模型(折线模型)已被广泛应用。
Shearer(2000)指出,一些已报道的营养需求量应该需要再检查其试验设计和复核数据分析。
通过回归分析,他发现已报道的、通过方差分析和折线模型拟合得到的、相关鱼的营养需求量偏低,这种差异主要是因为选择了不恰当的数据分析模型所致。
折线模型
折线模型在水生动物营养需求的剂量效应研究中被广泛应用。
该模型采用两条直线来模拟剂量效应关系(Robbinsetal.,1979)。
动物的生长性能随着添加物的增加呈线性上升趋势,当到达最适需求量时,生长性能不再变化,且维持在一定水平上,或呈负增长。
这种情形便可采用折线模型来描述(图2-1A)。
这个折点就是动物达到最大生长性能时的最低营养水平或营养需求量。
折线模型方程为:
Y=f+0.5g(x-h-|x-h|)
其中Y是用于估计需要量的评价指标(如体增重,克),x是自变量(饲料的营养水平,克/千克日粮),f是折点的纵坐标,h是折点的横坐标,g是x<
h时直线的斜率。
取几个x值采用最小二乘法计算f和g的最小二乘值。
能使模型的方差总和达到最大时的h值即为最大可能估计值(Robbins等,1979)。
对于一些氨基酸来说,其摄食量和增重率有很明显的线性相关性。
由于折线模型比较直观和方便的指出两条直线的交点即为需求量而成为营养需求的选择模型,因此本方法更加简单地表现了效应曲线。
然而,现在普遍认为折线模型拟合得到的需求估计量低于其他模型拟合得到的值。
因为在进行回归分析时,所有处理组的每一个重复的数据点都必须使用而不是像折线模型数据统计那样采用每个处理组的平均值。
图2-1A
非线性模型
非线性模型是解决那些数据不适合拟合折线模型而使用的。
在这些情况下,动物的增重率达到最大值后显著下降。
非线性模型是基于生物学原理“收益递减规律”而形成的。
在所有的非线性模型中,指数模型和S形曲线模型已被广泛应用于水生动物的需求量研究中(如图2-B和C)。
这些模型的缺陷是随意分配0.95的变异为最大效应?
?
。
对于指数曲线模型(图2-B),随着营养物质的摄取,其效应变化趋势不是线性的,而是当饲料中营养物质的添加量接近其获得最大生长的需要量时,其增加率将会趋于不变或下降(Gahletal.,1991)。
指数曲线模型方程为(Rodehutscordetal.1995):
Y=Ymax(1-e-b(x-c))
其中Ymax为曲线平稳阶段的渐近线与Y轴的交点,b为曲线最大斜率的值,c为当x与y同时为0时的值。
当饲料中营养水平显著缺乏时,评价指标随着饲料中营养物质的添加量的上升呈显著上升趋势(线性趋势),当进一步添加时,其增加率逐渐降低,表现在曲线斜率极剧下降,直到没有进一步的增加。
当营养水平使其增重率、蛋白沉积和成活率达到95%变异时的值即为其需求量。
S形曲线模型由4个参数来描述。
它定义了营养效应曲线为起始、缺乏、适宜和最适四个阶段。
饱和动力学模型的发展包含了其抑制常数。
S型曲线模型方程(Gahltat.1991)为:
1+me-kx
Y=
其中Ymax是曲线平稳阶段的渐近线与Y轴的交点,d是y轴的截距,k是x的换算参数,m是位于转折点的形状参数。
非线性模型被认为是最适当的描述生物学效应的模型(Merceretal.,1989;
Gahletal.,1991;
NRC,1993;
Cowey,1994;
RodehutscordandPack,1999)。
选择模型进行分析时,试验设计和需要营养水平范围是主要考虑的因素。
如果饲料成分从缺乏到正常值之间的范围很广,饱和动力学模型(SKM)是最适合的方法。
然而,现在很多已报道的关于营养需求的研究中,其试验设计中的营养物质的水平范围都不大。
当饲料中营养水平从缺乏到最适水平间的浓度差异较大时,S型曲线模型比指数曲线模型更适合,因为它更好得描述了效应曲线的上升阶段的线性或者接近线性部分(RodehutscordandPack1999)。
然而,如果饲料营养水平在一个严格的范围内被估计,采用指数模型是可行的(RodehutscordandPack1999)。
这种方法非常适合饲料配方中严重缺乏某种营养物质的研究。
在虹鳟对必需氨基酸需求量的研究中,分别采用了指数模型(Rodehutscordetal.,1995),S型曲线模型(Gahletal.,1991)、SKM(Merceretal.,1989)和折线模型(Robbinsetal.,1979)。
由于评价模型选择的不同而导致需求量存在很大差异(RodehutscordandPack1999)。
通过折线模型拟合得到的必需氨基酸需求量最低,而指数模型得到的需求量最高。
Encarnacao等也发现通过折线模型拟合得到的赖氨酸需求量(1.8%ofdiet)低于通过指数模型和S型曲线模型得到的需求量(2.3%ofdiet)。
需求量为2.3%这一结果与Rodehutscord等(1997)采用同样饲料和数据分析模型得到的结果是一致的。
将前面的研究结果进行对比分析后发现,通过折线模型拟合得到的并由NRC(1993)推荐的虹鳟赖氨酸需求量为1.8%,显著低于其达到最大增重率时的值。
两条折线的交点明显低于当增重率达到最大值的赖氨酸水平,因此不能准确反映该动物对其氨基酸的利用率。
析因模型
析因模型是由Shearer(1995)应用到鱼类营养需求量的研究中的。
这个模型综合考虑了饲料中营养物质的生物利用率、水体中营养物质的利用率、新组织合成时的需求量和内源性损失等因素。
该方法是基于通
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