急性胰腺炎病情与肠屏障功能损害相关性的实验研究.docx
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急性胰腺炎病情与肠屏障功能损害相关性的实验研究
急性胰腺炎病情与肠屏障功能损害相关性的实验研究
【摘要】目的:
探讨急性胰腺炎病情与肠屏障功能(IBF)损害的相关性及干预治疗后肠屏障功能损伤程度的改善情况。
方法:
日本大耳白兔36只,随机分为对照组A,轻型胰腺炎组B,重型胰腺炎组C,重型胰腺炎干预组D,后3组采用胰管结扎联合胆汁注射的方法制成兔SAP模型。
造模后3、6、12小时、第1、3、7天取血测定淀粉酶的含量及测血清肿瘤坏死因子及白介素6水平及其变化。
实验第7天处死动物收集胰腺、肝脏、肺、小肠组织,观察其组织病理学并行胰腺,小肠病理评分,制备小肠组织匀浆测定TNF-α、IL-6、丙二醛水平。
结果:
B组、C组、D组实验前、后淀粉酶有显着差异;A组实验前、后淀粉酶差异无统计学意义。
C组与B组、D组之间比较,淀粉酶、TNF-α、IL-6、小肠匀浆中TNF-α、IL-6、MDA差异有统计学意义()。
B组、D组之间比较差异无统计学意义。
胰腺、肺、肝,小肠的病理学改变以C组为甚,光镜下观察小肠黏膜损伤严重,D组比C组病理损害明显减轻,B组仅轻度损伤。
结论:
重型胰腺炎肠道黏膜损伤及IBF障碍较轻型胰腺炎明显,重型胰腺炎给予药物干预后肠道黏膜损伤程度及胰腺炎病情明显低于重型胰腺炎,说明早期治疗干预能改善IBF,有助于胰腺炎的治疗。
【关键词】急性胰腺炎;肠屏障功能;肿瘤坏死因子-α;白细胞介素-6;丙二醛
[Abstract]Objective:
Toinvestigatethecorrelationbetweentheconditionofacutepancreatitisandtheintestinalmucosalbarrierdysfunctionandtheimprovementintheintestinalinjurydegreeafterinterventiontherapy.Methods:
Thirty-sixexperimentalrabbitswererandomlydividedintofourgroups,sham-operation(A)group,mildacutepancreatitis(B)group,severeacutepancreatitis(C)group,andinterventiononsevereacutepancreatitis(D)group.APmodelwasinducedbyligatingpancreaticductandinjectingbile.Thechangesofserumconcentrationofamylase,TNF-αandIL-6ofacutepancreatitiswereobservedafter3,6,12hourand1,3,7day.Specimensoftissuesfrompancreas,liver,lungandintestineweretakenatthe7thday,andpathologicalchangesofthesetissueswereobserved.Thepancreasandintestinewereevaluatedpathologically.ThelevelesofTNF-α、IL-6、andMDAinintestineweredetermined.Results:
Thecontentofamylase,TNF-αandIL-6inserumandTNF-αandMDAinintestinehadsignificantdifferencesingroupB,C,andDbeforeandafterexperiment.ThereweresignificantdifferencesamonggroupCandgroupsBandD,butTherewasnodistinctdifferencebetweengroupBandgroupD,whileAgroupshowednodistinctdifference.Pathologicalchangesofpancreas,liver,lungandintestineingroupCweremuchgreaterthaningroupsA,BandC.TheinjuryofintestinalmucousmembraneingroupCwasserious,theinjuryingroupDwaslessthaningroupCandgroupBwasonlymildlyinjured.Conclusion:
Theinjuryofintestinalmucousmembraneandintestinalbarrierdysfunctioninsevereacutepancreatitiswasmoreobviousthaninmildacutepancreatitis.Afterinterventiontheinjuryofintestinalmucousmembraneandillnessdecreasedsignificantlythanbeforeintervention.Thisshowedthatearlierintervention,improvingintestinalfunction,wasbeneficialforthetreatmentofpancreatitis.
[Keywords]Acutepancreatitis;Intestinalbarrierfunction;Tumornecrosisfactoralpha;Interleukin-6;Malondialdehyde急性胰腺炎是一种消化系统常见疾病,发生率为4/10万,近年有增加趋势[1]。
重症急性胰腺炎起病急、发展迅速、并发症多,早期即可发生全身炎症反应综合征、多器官功能衰竭。
虽然现在对SAP的治疗较以前有了很大的进展,但病死率仍高达10%~30%[2~4]。
已知SAP时存在有IBF损伤,但IBF障碍对SAP是促发因素还是病程发展的结果,SAP的病情严重程度与IBF损伤的相关性,以及如何检测IBF的损伤尚有一些不明确之处。
本实验目的在于探讨IBF与胰腺炎的病情相关性,从而有助于早期预防及尽早和尽可能保护肠屏障,减轻SAP的病情,缩短病程,减低死亡率。
1材料及方法
实验动物日本大耳白兔36只,雄性,体重~kg,南通大学实验动物中心提供,其中造模27只,对照9只。
实验材料和设备戊巴比妥由南通大学提供,用蒸溜水配成3%的浓度。
日本OlympusBX50光学显微镜及北航图像处理系统;电脑微量输液泵YBS-Ⅱ购自上海电表厂。
实验动物分组及模型的制作36只大耳白兔随机分为4组:
空白对照组,轻型胰腺炎(MAP)组,重型胰腺炎(SAP)组,重型胰腺炎干预组,每组各9只。
实验前兔禁食12~14小时,但不禁水。
以3%戊巴比妥经耳缘静脉麻醉。
可控性SAP模型制作方法参照本院实验组的操作规范执行。
B组胰胆管结扎留置导管引流,动脉夹夹闭胰胆管引流管,术后5分钟后松夹引流,制成轻症胰腺炎模型;C组用2ml注射器从胆总管引流管抽取胆汁(ml/kg)注入胰胆管引流管,动脉夹夹闭胰胆管引流管,术后30分钟后松夹引流,制成重症胰腺炎模型;D组造模的方法基本同C组;A组打开腹腔翻动胰十二指肠后关腹。
术后处理B、C、D组于成模后第1天经中央静脉注入肠外营养液,每日补液量为100ml/kg,分2次给予。
D组于成模后3小时给予空肠营养,9小时后注入肠毒清,,后每日间隔9小时分别注入百普利、肠毒清各1次。
A组术后禁食6小时后正常喂养。
检测方法
标本采集经耳缘静脉,分别于造模前,造模后3小时、6小时、12小时、第1天、第3天、第7天、采血2ml,在离心机上以3000r/min离心10分钟,取上清液。
-20℃冰箱保存待检测血淀粉酶、用ELISA法测定TNF-α、IL-6水平。
死亡或成活1周后处死,无菌条件下取胰腺、肺、肝及小肠,5%甲醛固定后做常规病理切片,经HE染色观察其组织病理学改变,并行胰腺病理评分,小肠Chiu氏评分。
取距回盲10cm处小肠制备组织匀浆用放射免疫法及硫代巴比妥法测定小肠匀浆中TNF-α、IL-6及丙二醛。
肠组织匀浆的制备冰浴下将切取的小肠纵行剖开,在预冷的mol/LPBS中漂洗,滤纸吸干,准确称取1g小肠组织,放入10ml的小烧杯,加入预冷的匀浆介质6ml,用眼科小剪尽快剪碎组织后倒入玻璃匀浆器,再用3ml匀浆介质冲洗残留在烧杯中的碎组织,一起倒入匀浆管中,充分研碎,以制成10%组织匀浆,在低温时以3000r/min离心15分钟,取上清液待测。
考马斯亮蓝蛋白定量。
四组肠组织匀浆中TNF-α、IL-6含量的测定采用放射免疫法测定,试剂盒购自北京北方生物技术研究所。
四组肠组织匀浆中MDA含量的测定采用硫代巴比妥法,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
统计学方法所有实验数据■±s表示。
应用统计软件对所有实验数据进行统计学分析,示差异有统计学意义。
2结果
一般情况实验组和A组兔手术当天精神萎靡,呼吸浅快,存活兔2天后好转,生命体征平稳。
成模后实验动物术后共死亡3例,于术后12~72h内死亡,其中C组2例,D组1例,A、B组无死亡。
血淀粉酶的变化见表1。
造模后A组与B、C、D组淀粉酶差异有统计学意义;B、C、D组实验前、后淀粉酶差异有统计学意义,实验后6小时达高峰,A组实验前、后淀粉酶差异无统计学意义。
不同时间中血TNF-α浓度见表2。
不同时间中血IL-6浓度见表3。
各组兔肠组织病理学改变及TNF-α、IL-6、MDA的变化见表4,图1。
兔胰腺、肺、肝组织病理变化造模7天后剖腹,腹腔内可见血性腹水,肠管淤张,胰腺与周围组织轻度有黏连,胰腺水肿明显,色泽差,胰腺及网膜组织多处皂化斑。
光镜观察,可见胰腺实质明显水肿、炎症细胞浸润、间质出血和灶性甚至片状腺泡坏死,并有胰腺组织腺体萎缩;肺腔内明显渗出、肺间质散在瘀血斑。
光镜下可见肺泡间隔增宽,大量炎性细胞浸润,肺泡腔内出现渗出液,部分肺泡腔塌陷;肝脏可见有不同程度的坏死及炎症细胞浸润,毛细血管扩张。
胰腺、肺及肝的病理学改变以C组重,B、D组相对程度减轻。
而A组胰腺、肺、组织光镜观察基本正常。
胰腺组织病理学评分分别为:
B组±;C组±;D组±,B组与C、D组比较差异有统计学意义。
3讨论
目前评价肠屏障功能障碍的方法较少,本实验通过测定小肠组织匀浆中MDA、TNF-α、IL-6的含量及对小肠组织行病理评分来评估肠屏障损害情况。
实验结果发现:
小肠组织中MDA、TNF-α、IL-6的含量增高的同时小肠组织病理改变及病理评分也相应升高,表明了我们的检测指标可以反映肠屏障功能障碍的轻重程度。
本实验发现在AP造模后TNF-α、IL-6浓度持续升高,AP组TNF-α、IL-6浓度较假手术组在各时间点均明显升高;SAP组较MAP组升高明显,干预组较SAP组有所下降,说明AP组有不同程度的炎症损伤,且SAP损伤程度大于MAP,病情较MAP重,干预组病情明显轻于SAP。
结果表明,SAP组小肠组织中MDA、TNF-α、IL-6的含量较MAP组明显升高,且组织病理可见小肠损伤程度重于MAP,说明SAP时肠黏膜受损程度明显高于MAP;TNF-α、IL-6浓度在SAP组增高明显,而MAP组升高明显低于SAP组,即SAP的病情明显重于MAP组。
从而表明:
SAP时肠黏膜损伤较MAP时严重,而且代表IBF的相关指标也有明确的改变。
证明SAP时IBF与肠黏膜损伤呈同步的变化,AP的病情轻重程度与肠屏障功能损害成正相关。
本组实验结果提示给予肠道营养及中药制剂干预治疗后小肠组织中MDA、TNF-α、IL-6的含量较SAP组下降,且组织病理可见小肠损伤程度轻于SAP,证明SAP时肠黏膜受损后,空肠营养及中药干预治疗后肠黏膜及IBF损伤有所减轻。
已有文献报道对肠道营养干预治疗对肠黏膜微结构有保护作用,经过肠道营养干预治疗后IBF障碍有所改善。
空肠营养液可以直接向肠黏膜提供营养物质,阻止肠黏膜的氧化损伤,避免肠道屏障功能的破坏和菌群易位,改善肠道的通透性还可增加机体的免疫功能,降低了感染并发症的发生。
而本院制剂以大黄为主要成分的肠毒清已广泛使用于严重感染急性中毒等引发的SIRS、MODS合并肠功能衰竭等疾病。
本实验使用该制剂作为IBF保护剂,结果证明该制剂可以调整肠道局部微生态,有助于控制全身炎症反应和多器官功能衰竭。
本研究采用胰管结扎联合胆汁注射的方法制成可控性兔急性胰腺炎模型,根据注入胆汁的剂量及速度的不同制作成轻型急性胰腺炎,重症急性胰腺炎模型。
造模后,血中淀粉酶水平,以及TNF-α和IL-6的水平迅速升高,且SAP较MAP升高明显。
病理观察可见胰腺、小肠、肺脏、肝脏组织损伤明显。
腹腔内可见腹水及肠管扩张。
结果表明,胰管结扎联合胆汁注射加大剂量可以明显加重急性胰腺炎时各脏器病理学改变,而诱发SIRS甚至MODS的形成。
此模型有助于对重症急性胰腺炎发展过程中病理生理变化的研究。
本实验结果表明在该SAP模型的平台上进行的IBF监测及给予治疗的研究取得较好的结果。
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