安徽师大 分子生物学 第四章学生Word下载.docx
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singlecistron
5’-cap
3’-poly(A)
原核生物的多顺反子真核生物的单顺反子
2、什么是遗传密码子?
3、密码子的特点(Featuresofgeneticcodons):
⑴方向性(directivity):
5-3’
⑵连续性(continuity):
两个密码子之间没有任何核苷酸隔天,因此从起始码AUG开始,三个碱基代有一个氨基酸,这就构成了一个连续不断的读框,直至终止码。
如果在读框中间插入或缺失一个碱基就会造成移码突变,引起突变位点下游氨基排列的错误。
(3)简并性(degeneracy)
什么是密码子的简并性?
P113表4-3
一种氨基酸有几组密码子,或者几组密码子代表一种氨基酸的现象称为密码子的简并性,这种简并性主要是由于密码子的第三个碱基发生摆动现象形成的,也就是说密码子的专一性主要由前两个碱基决定,即使第三个碱基发生突变也能翻译出正确的氨基酸,这对于保证物种的稳定性有一定意义。
(4)通用性和特殊性(generality&particularity)
(5)密码子和反密码子(codon&anticodon)
(6)摆动性(wobble)
摆动配对(Wobblepairing)
摆动假说(Wobblehypothesis)
4.2tRNA
tRNA(transferRNA)是蛋白质合成中的
转接分子(adoptermolecules)。
——“第二遗传密码”
tRNA中含有10%~20%的稀有碱基,如:
甲基化的嘌呤mG、mA,双氢尿嘧啶(DHU)、次黄嘌呤等等。
此外,tRNA内还含有一些稀有核苷,如:
胸腺嘧啶核糖核苷,假尿嘧啶核苷(Ψ)等。
胸腺嘧啶一般存在于DNA中;
在假尿嘧啶核苷中,不是通常嘧啶环中1位氮原子,而是嘧啶环中的5位碳原子与戊糖的1′位碳原子之间形成糖苷键。
一种AA可以有几种相应的tRNA,但一种tRNA确只能转运一种AA。
1.tRNAstructure
(1)tRNA的二级结构(cloverleafstructure)
受体臂、TφC臂、反密码子臂、D臂、附加臂
关键部位:
受体臂和反密码子臂
(2)Extraarm
I类tRNA:
占3/4,附加臂3~5个核苷酸。
II类tRNA:
占1/4,附加臂13~21个核苷酸。
(3)tRNA的L形三级结构(tertiarystructure):
Upside-down“L”(倒L形)
维持结构力:
氢键
结构与生物学功能:
与AA-tRNA合成酶的识别有关;
受体臂和反密码子臂分别位于两条双螺旋的顶端。
酵母和大肠杆菌tRNA的三级结构都呈L形折叠式。
这种结构是靠氢键来维持的,形成三级结构氢键的碱基在二级结构中大多没有形成氢键。
tRNA的三级结构与AA-tRNA合成酶的识别有关。
tRNA的L形高级结构反映了其生物学功能,因为它上所运载的氨基酸必须靠近位于核糖体大亚基上的多肽合成位点,而它的反密码子必须与小亚基上的mRNA相配对,所以两个不同的功能基团最大限度分离。
2.tRNA的功能
①运输的工具,运载AA;
②解读mRNA的遗传信息。
3.tRNA的种类
(1)起始tRNA和延伸tRNA
能特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA,其他tRNA统称为延伸tRNA。
原核生物:
携带甲酰甲硫氨酸(fMet);
真核生物:
携带甲硫氨酸(Met)。
(2)同工tRNA(cognatetRNA)
什么是同工tRNA?
代表同一种氨基酸的tRNA称为同工tRNA,同工tRNA既要有不同的反密码子以识别该氨基酸的各种同义密码,又要有某种结构上的共同性,在一个同工tRNA组内,所有tRNA均专一于相同的氨基酰-tRNA合成酶
特点:
具有不同的反密码子
具结构上的共同性;
均专一于相同的氨基酰-tRNA合成酶。
(3)校正tRNA
:
改变结合位点的反密码子,但不改变结合的AA。
4.AA-tRNA合成酶(AA-tRNAsynthetase,aaRS)
AA-tRNA合成酶是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶,具有高度专一性。
E.coli分离出的AA-tRNA合成酶具有三个典型结构域:
催化域:
ATP和氨基酸结合位点,有2-3个相同的短的AA序列(称“署名序列”)
tRNA受体螺旋结合域:
与tRNA接触
tRNA反密码子结合域:
与tRNA反密码子结合
氨基酰-tRNA的写法:
Arg-tRNAArg
原核:
fMet-tRNAfMet--起始AUG;
Met-tRNAmMet--内部AUG;
真核:
Met-tRNAiMet--起始AUG;
Met-tRNAmMet--内部AUG
蛋白质合成的真实性如何体现?
▪反密码子与密码子的正确配对;
▪AA-tRNA合成酶和tRNA参与的校正作用,AA-tRNA合成酶对tRNA和氨基酸均具有高度的特异性;
▪密码子的简并性和专一性。
4.3核糖体
核糖核蛋白体,简称核糖体(ribosome)
细胞的主要成份之一;
所有类型的细胞的蛋白质“加工厂”。
由RNA和蛋白质组成。
•所处位置:
真核细胞中核糖体与细胞骨架或内质网相连。
原核细胞中固定在核基因组上,与mRNA相互作用。
2009年10月7日,瑞典皇家科学院在斯德哥尔摩宣布,英国剑桥大学科学家文卡特拉曼·
拉马克里希南(左)、美国科学家托马斯·
施泰茨(中)和以色列科学家阿达·
约纳特因“对核糖体结构和功能的研究”而共同获得2009年诺贝尔化学奖。
(新华网)
1.核糖体的基本类型与成份
基本类型
附着核糖体(Membrane-boundribosome)
游离核糖体(Freeribosome)
70S的核糖体(Prokaryotes)
80S的核糖体(Eukaryotes,cytoplasm)
主要成分
rRNA:
3/5(真核),2/3(原核),核糖体内部
r蛋白质:
2/5(真核),1/3(原核),核糖体表面
rRNA的基本特点:
(1)rRNA是单链RNA;
(2)G-C碱基对与A-U碱基对的总量不等;
(3)单股rRNA链可自行折叠,形成螺旋区和环区,所有螺旋区的碱基都是保守的;
(4)所有来源rRNA均能形成4个结构域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ),每个结构域均含许多茎(螺旋段)和环,它们通过无距离碱基对的相互反应彼此靠近;
(5)绝大多数的rRNA碱基的特异功能尚不清楚。
据说rRNA中不配对的碱基(环区或单股区)涉及到rRNA与其它RNA的结合,如16S的3'
端不配对的碱基与mRNA的起始部位(SD顺序)形成碱基配对。
核糖体蛋白:
与rRNA或核糖体亚基结合的蛋白质有二类。
:
一类与rRNA或核糖体亚基紧密连接,需高浓度盐和强解离剂(如3mol/LLiCl或4mol/L尿素)才能将其分离,这类蛋白质称为"
真"
核糖体蛋白质("
real-ribosomalproteins"
)或简称为核糖体蛋白质。
如E.coli30S亚基上的21种蛋白质及50S亚基上的34种蛋白质(共54种,因为小亚基上的S20与大亚基上的L26是相同);
或者在真核细胞40S亚基上的30种蛋白质及60S亚基上的45-50种蛋白质(共约80种),即属此类。
而另一类蛋白质则为与有功能的核糖体亚基疏松缔合,能被0.5mol/L单价阳离子(如K+,NH4+)从亚基上洗脱,并对核糖体循环发挥调节作用的蛋白质,如起始因子(IF或eIF)和延长因子(EF)等,称为核糖体相关蛋白质(proteinsassociatedwithribosome,PAR)。
PAR不是构成核糖体的固有成分。
2.核糖体的结构
v在电镜下,核糖体具有一定的三维形态,且每一核糖体均由大、小两个亚单位构成。
v大亚单位略呈半圆形,直径约为23纳米,在一侧伸出三个突起,中央为一凹陷;
v小亚单位呈长条形,在约1/3长度处有一细的缢痕,将小亚单位分为大小两个区域。
v当大小亚单位结合在一起成核糖体时,其凹陷部位彼此对应,从而形成一个隧道,为蛋白质翻译时mRNA的穿行通路。
v两亚单位常常游离于细胞质溶质中,当小亚单位与mRNA结合后,大亚单位才与小亚单位结合成完整的核糖体。
肽链翻译结束后,大小亚单位解离,重新游离于细胞质溶质中。
两亚单位的结合与分离受Mg2+的影响。
大肠杆菌核糖体三维结构模型
小亚基貌似一个动物胚胎,由头部、基部和平台组成,平台与头部之间有一个裂隙;
大亚基很像一个沙发,有一个柄、一个中央凸出部和一个脊;
二者组装成核糖体时,小亚基头部与大亚基凸出部之间形成一个隧道,在蛋白质合成中mRNA很可能从这里通过。
3.核糖体的功能
核糖体上具有多个活性中心:
(1)A位:
(Aminoacylsite,氨酰基位点);
(2)P位:
(Peptidylsite,肽酰基位点);
(3)E位:
(Exitsite,空载tRNA排出位点);
(4)与mRNA的结合位点;
(5)肽酰转移酶的催化位点;
核糖体中最主要的活性部位
(6)多种蛋白质合成因子结合位点;
核糖体的基本功能依赖于其中的rRNA,核糖体蛋白质起着加强rRNA功能的作用。
核糖体最初由rRNA构建,在进化过程中一些蛋白质加在其上。
在体内外的实验均证明了缺乏某些蛋白质的核糖仍有生物活性;
此外,rRNA基因(rDNA)突变及甲基化等均可引起对抗菌素(如红霉素、氯霉素)的抵抗。
过去一直认为在核糖体中一定有某种或某类蛋白质在催化蛋白质合成中起重要作用。
但目前认为,在核糖体中rRNA是起主要作用的结构成分,主要功能为:
(1)具有肽酰转移酶活性;
(2)为tRNA提供结合位点(A位点、P位点和E位点);
(3)为多种蛋白质合成因子提供结合位点;
(4)在蛋白质合成起始时参与同mRNA选择性地结合以及肽链延伸时与mRNA结合。
对核糖体蛋白的功能有多种推测:
(1)对rRNA折叠成有功能的三维结构十分重要;
对500多个不同种生物的研究表明,rRNA是高度保守的,有些序列是完全一致的。
尽管不同种的rRNA一级结构可能有所不同,但它们都折叠成相似的二级结构(由多个臂环组成的结构)。
(2)对核糖体的构象变化起到微调作用;
(3)在核糖体的结合位点及催化位点上与rRNA共同作用。
4.mRNA上核糖体结合位点(Ribosomebindingsite(RBS)onmRNA)
(1)原核生物中位于mRNA5’端起始密码子(AUG)上游有一段3~9个nt的富含嘌呤的共同序列(核心一般为5’-AGGA-3’),称为Shine-Dalgarnosequence(SD序列)。
作用:
它可与30S小亚基的16SrRNA3’端的
一段嘧啶丰富区5’-ACCUCCUU-3’互补配对,
使得起始tRNA正确识别并定位于mRNA上
起始密码子“AUG”位点。
(2)在真核生物中,核糖体结合到mRNA的5′帽子上形成起始复合物。
“第一AUG规律”:
当5′端具有数个AUG时,其中只有一个AUG为主要开放阅读框的翻译起始点。
起始AUG序列具有二个特点:
1、AUG上游的-3经常是嘌呤(Pu),常常是A;
2、紧跟AUG的+4常常是G。
起始AUG邻近序列中以ANNAUGGN的利用率为高,若-3不是A,则+4的G对于有效的翻译起始作用是必要的。
对真核mRNA起始位点的旁侧进行更广泛的统计分析,不仅证实-3位点的普遍规律,而且展示了-4、-2、-1位点的保守性,通常为A或C。
而无起始功能的AUG则无此规律。
先导序列长度对翻译的影响:
先导序列长度对mRNA的翻译活性也有影响。
如果起始AUG与帽子结构之间距离太短(小于12个核苷酸),就不能有效地利用这个AUG,会从下游适当的AUG起始翻译。
当距离在17-80核苷酸之间时,离体翻译效率与距离成正比。
先导序列的长度会影响起始效率和准确性
第二节蛋白质生物合成过程
TheProcessofProteinBiosynthesis
4.4蛋白质的合成过程:
翻译过程从阅读框架的5´
-AUG开始,按mRNA模板三联体密码的顺序延长肽链,直至终止密码出现。
蛋白质肽链的合成是从N‐端开始向C‐端延长。
这个过程中主要包快以下几个阶段:
▪氨基酸的活化(Aminoacidactivation)
▪翻译的起始(initiation)
▪翻译的延长(elongation)
▪翻译的终止(termination)
4.4.1氨基酸的活化
●氨基酸的活化——蛋白质合成过程中的关键步骤(AA能否以及能否正确的运送到核糖体上进行多肽链的聚合,其中关键的一步依赖于活化)
(一)氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetase)
第一步反应
氨基酸+ATP-E—→氨基酰-AMP-E+AMP+PPi
第二步反应
氨基酰-AMP-E+tRNA——氨基酰-tRNA+AMP+E
羧基与3’-OH缩水-----二酯键
•氨基酰-tRNA合成酶对底物氨基酸和tRNA都有高度特异性。
•氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性(proofreadingactivity)。
•氨基酰-tRNA的表示方法:
Ala-tRNAAlaMet-tRNAMet
(二)起始肽链合成的氨基酰-tRNA
Met-tRNAiMet
fMet-tRNAifMet
4.4.2肽链合成起始
指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物。
起始因子(IF)
原核生物:
IF–1、IF–2、IF–3
eIF–1、eIF–2、eIF–3、eIF–4、eIF–5、eIF–6。
原核、真核生物各种起始因子的生物功能
起始因子
生物功能
原核
IF–1
占据A位防止结合其他tRNA
IF–2
促进起始tRNA与小亚基结合
IF–3
促进大小亚基分离,提高P位对结合起始tRNA敏感性
真核
eIF–2
eIF–2B,
eIF–3
最先结合小亚基,促进大小亚基分离
eIF–4A
eIF–4F复合物成分,有解螺旋酶活性,促进mRNA结合小亚基
eIF–4B
结合mRNA,促进mRNA扫描定位起始AUG
eIF–4E
eIF–4F复合物成分,结合mRNA5′帽子
eIF–4G
eIF–4F复合物成分,结合eIF–4E和PAB
eIF–5
促进各种起始因子从小亚基解离,进而结合大亚基
eIF–6
促进核蛋白体分离成大小亚基
(一)原核生物翻译起始复合物形成
•翻译起始需要如下7种成分:
(P130)
①30S;
②50S;
③mRNA;
④fMet–tRNAfMet;
⑤IF–1、IF–2、IF–3;
⑥GTP;
⑦Mg2+
•翻译起始又可被分成以下几步:
核蛋白体大小亚基分离;
mRNA在小亚基定位结合;
起始氨基酰-tRNA的结合;
核蛋白体大亚基结合。
1.核蛋白体大小亚基分离
非功能性的70S核糖体在IF–1、IF–3的作用下发生解离,
生成IF–1·
IF–3·
30S复合物和游离的50S大亚基。
2.mRNA在小亚基定位结合
IF–1·
30S复合物与mRNA模板相结合,在此过程中IF–1占据A位防止结合其他tRNA,IF–3则可阻止50S大亚基过早结合,帮助mRNA的SD序列与16SrRNA3’‐端相结合,使mRNA正确定位,并在翻译启动区形成使起始信号易被fMet–tRNAfMet识别的高级结构(A、P位点各占一个密码子)
3.起始氨基酰tRNA(fMet-tRNAimet)结合到小亚基
在IF–2、GTP的帮助下,fMet–tRNAfMet进入小亚基的P位,tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对,只有起始氨基酰tRNA可以直接进入P位点,其它……,此时GTP不水解,只需GTP的结合
4.核蛋白体大亚基结合,起始复合物形成
甲酰甲硫氨酰tRNA就位后,起始因子IF–3就脱离小亚基,随着IF–3的脱落,核蛋白体50S大亚基与小亚基结合成70S起始复合物,甲酰甲硫氨酰tRNA占据P位,与此同时GTP水解成GDP(一个高能磷酸键),IF–1和IF–2脱离起始复合物。
已知IF–2对于30S起始复合物与50S亚基的连接是必需的,而IF–1则在70S起始复合物生成后促进IF–2的释放,从而完成蛋白质合成的起始过程。
(二)真核生物翻译起始复合物形成
•绝大多数真核mRNA内部没有核糖体结合位点。
•在一般情况下,翻译前起始复合物首先结合在mRNA的5´
–末端,然后沿着序列进行扫描,直到找到起始密码子,最后与核糖体的大亚基结合形成起始复合物。
•起始复合物的形成可分为三个步骤:
前起始复合物的形成;
48S复合物的形成;
起始复合物的形成。
(1)前起始复合物的形成
•首先eIF–3与40S小亚基结合,然后在结合了GTP的eIF–2的帮助下,Met–tRNAMet结合到该小亚基上形成43S的前起始复合物。
(2)48S复合物的形成
前起始复合物结合于mRNA的5′–末端,这一步需要eIF–4E复合物(又称帽子结合复合物)的帮助。
其中,eIF–4E结合于帽子化的mRNA,eIF–4G作为接头蛋白连接eIF–4E和eIF–3。
mRNA的polyA尾巴与Pab1p结合,Pab1p也结合于eIF–4G上,形成48S的复合物。
•帽子结构和polyA尾巴能协同刺激翻译起始。
•在eIF–4B的帮助下,Met–tRNAMet能沿着mRNA分子扫描寻找合适的起始密码子(符合第一AUG上下文的那个AUG作为其实密码子)。
•真核生物mRNA的引导区可达数十或数百个核苷酸,并且常含发夹结构和其他的碱基配对结构,具解旋酶活性的eIF–4A能打开引导区的碱基对。
(3)起始复合物的形成
一旦48S复合物定位于起始密码子,eIF–5帮助60S大亚基就与其结合形成翻译的起始复合物。
而且eIF–5水解与eIF–2结合的GTP,这一反应导致已结合在48S复合物上的起始因子的释放。
起始步骤在生物合成过程中一般都是非常复杂的过程!
二、肽链合成延长
指根据mRNA密码序列的指导,次序添加氨基酸从N端向C端延伸肽链,直到合成终止的过程。
肽链延长在核蛋白体上连续性循环式进行,又称为核蛋白体循环(ribosomalcycle),每次循环增加一个氨基酸,包括以下三步:
–进位(entrance)
–成肽(peptidebondformation)
–转位(translocation)
延伸过程所需蛋白因子称为延长因子(elongationfactor,EF)
EF-T(EF-Tu,EF-Ts)
EF-G
EF-1、EF-2
肽链合成的延长因子
EF-Tu
促进氨基酰-tRNA进入A位,结合分解GTP
EF-1-α
EF-Ts
调节亚基
EF-1-βγ
EFG
有转位酶活性,促进mRNA-肽酰-tRNA由A位前移到P位,促进卸载tRNA释放
EF-2
(一)进位
又称注册(registration)
起始复合物形成以后,第二个AA–tRNA在延伸因子EF-Tu及GTP的作用下,生成AA–tRNA·
EF-Tu·
GTP复合物,然后结合到核糖体的A位上,同时GTP被水解成GDP和Pi
EF‐Ts催化GDP‐GTP交换,使EF‐Tu·
GDP变成EF‐Tu·
GTP才能重新参与下一轮反应(原核生物)
(二)成肽
在肽基转移酶的催化下,P位上的fMet–tRNAfMet活化的羧基从相应的tRNA上解离下来,并转移到A位氨酰–tRNA的氨基酸的氨基上形成肽键,产生肽酰–tRNA,把无负荷的tRNA留在P位
(三)转位
延长因子EF-G有转位酶(translocase)活性,可结合并水解1分子GTP,促进核蛋白体向mRNA的3'
侧移动。
在EF-G(移位酶)的作用下,核糖体沿mRNA5’→3’的方向移动,每次移位距离为3个核苷酸,结果使肽酰-tRNA从A位移到P位,原来在P位的无负荷tRNA随即从E位点离开核糖体,同时一个新的密码子进入空着的A位
(四)真核生物延长过程
真核生物肽链合成的延长过程与原核基本相似,但有不同的反应体系和延长因子。
另外,真核细胞核蛋白体没有E位,转
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