谈蛋白磷酸酶2A 的结构功能和活性调节Word文件下载.docx
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1 PP2A的结构
哺乳动物细胞中的PP2A以二聚体或三聚体形式存在,三聚体较为常见。
其核心酶部分是一个二聚体,由分子量为36~38kD的催化亚基(PP2Ac)和65kD的结构亚基(PR65/A)组成;
另有分子量为50~130kD不等的调节亚基(B亚基)和核心酶结合形成三聚体。
至今已发现B亚基有四种形式,分别命名为B、B′、B″、B″′。
不同形式的B亚基和核心酶的结合具有相互排它性。
1.1 催化亚基(PP2Ac)
PP2A酶催化亚基PP2Ac是一个含Zn2+和Fe2+的金属酶,结构在进化过程中保持高度的稳定,是已知酶中最保守的。
PP4和PP6的催化亚基与其相近,同源性分__别达到66%和59%。
序列分析表明PP2Ac有α和β两种同工型,一致性达97%。
1.2 结构亚基(PR65/A)
结构亚基PR65/A是PP2Ac和B亚基结合的支架,和PP2Ac紧密结合。
该亚基也有α和β两种同工型,同源性为86%。
其中PR65/Aβ可能和肿瘤发生有关[。
在15%肺和直肠来源的肿瘤细胞系中,编码PR65/Aβ蛋白的基因发生突变,突变区域位于催化亚基结合部位。
最近也在人黑色素瘤、乳腺癌和肺癌病例中发现PR65/Aα蛋白的基因突变,但突变频率显著低于PR65/Aβ。
PR65/A的结构特殊:
由15个重复子串联,每个重复子由富含亮氨酸残基的39个氨基酸组成(序列不完全相同),其二级结构相似,由两个反平行的α螺旋组成,这种串联结构称为HEAT模体(motif)。
整个A亚基看上去像由食指和拇指组成的钩形体,具有疏水内表面,包括了PR65/A蛋白保守残基,可能是PP2Ac和不同调节亚基的结合位点。
在酿酒酵母(S.cerevisiae)中的研究发现,一种B淋巴细胞受体成分α4蛋白和PP2Ac形成α4-PP2Ac二聚体,是PP2A的同源类似物,又称为Sit4、Pph21和Pph22。
在酵母菌中α4蛋白同源物称为Tap42,被纳巴霉素靶(targetofrapamycin,TOR)激酶磷酸化后也能和PP2Ac形成二聚物。
后来发现植物和哺乳动物中都存在二聚体α4/Tap42-PP2Ac,但这种二聚体和PR65/A-PP2Ac二聚体之间能否互相转换尚需实验确定。
PR65/A亚基只能和PP2Ac特异性结合,而α4蛋白还能与其他催化亚基如PP4c和PP6c等结合。
1.3 调节亚基(B亚基)
调节亚基令人吃惊的特点是多样性,即使识别A亚基的位点类似,但其编码基因几乎没有同源性。
它们调节PP2A全酶活性、细胞内定位和对底物的专一性。
(1)PR55/B家族
哺乳动物细胞内存在四种PR55/B亚基:
PR55/Bα、PR55/Bβ、PR55/Bγ和PR55/Bδ,表达具有组织特异性。
PR55/Bα和PR55/Bδ分布广泛;
而PR55/Bβ和PR55/Bγ主要表达于脑组织,其表达与脑的发育相关,出生后PR55/Bβ表达降低,而PR55/Bγ迅速升高。
PP2Ac和A亚基表达无组织特异性,B亚基决定了PP2A全酶的细胞内定位、组织特异性以及发育阶段的存在形式。
(2)PR61/B′家族
B′家族至少包括五种不同的基因产物,分别命名为PR61α、PR61β、PR61γ、PR61δ和PR61ε。
人的PR61β亚基有两种同工型(β1和β2)。
PR61γ至少有三种剪接体(γ1、γ2、γ3)。
所有的B′亚基都包含一个高度保守的中心区(80%同源),而羧基和氨基末端则表现出高度的多样性,提示保守区域可能和A亚基及PP2Ac的结合有关,而多变的末端则赋予B′亚基多种功能,如决定底物的特异性和细胞内定位。
PR61α、PR61β和PR61ε位于胞质,PR61γ主要位于核内,而PR61δ在胞质和核内都存在。
同时,PR61/B′的同工型表达也有组织特异性。
PR61α和PR61γ广泛分布,在心和骨骼肌中特别丰富;
PR61β和PR61δ主要表达于脑。
在维甲酸诱导神经母细胞瘤分化过程中,PR61β和PR61δ的表达显著升高,而其他同工型仅轻微升高或不升高,提示PR61β和PR61δ的表达与脑组织的发育相关。
(3)PR72/B″家族
至今已发现四种PR72/B”亚基(PR72、PR130、PR59和PR48)。
PR72和PR130可能是同一基因的不同剪接体。
PR72仅表达于心肌和骨骼肌;
PR130分布广泛,但在心肌中高度表达。
PR59在骨骼肌中不表达,可与视网膜母细胞瘤相关蛋白质p107结合。
过量表达PR59可阻滞细胞周期于G1期,可能是PR59和p107共表达时,低磷酸化p107蛋白的数量增加的缘故。
PR48位于核内,与DNA复制起始蛋白质CDC6结合,CDC6似乎是含PR48的PP2A全酶的特异性底物。
PP2A使CDC6保持去磷酸化状态,这是CDC6结合DNA复制起始点的必需条件。
PR48的过度表达也可导致在G1期阻滞细胞周期。
(4)PR93/PR110/B″
家族 PR110(striatin)和S/G2核自身抗原(SG2NA、PR93)含有WD-40重复子,和PP2A核心酶结合。
两种蛋白质都以钙依赖方式和钙调蛋白结合。
含这两种蛋白质的PP2A全酶还包括其他未知蛋白质,提示PR110和PR93可能是参与钙信号转导的支架蛋白质。
2 PP2A的功能
PP2A结构复杂性是其功能广泛的基础。
PP2A拥有众多亚基,可以组成多种PP2A全酶,这些组成不同的全酶功能和活性不一,任何一种PP2A全酶的缺失都会引起细胞的恶化或凋亡,细胞内定位和所针对的底物也各不相同。
PP2A已被证明参与细胞周期、DNA复制、信号转导、分化和细胞恶性转化等多种细胞生物学事件。
2.1 PP2A和细胞周期
细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependentproteinkinases,CDKs)控制细胞周期的进程,而其本身活性受可逆蛋白磷酸化调节。
越来越多的证据表明PP2A通过使CDKs去磷酸化调控其活性,从而参与细胞周期的调节。
PP2A可阻滞G2期细胞进入M期和G1期细胞进入S期,后者主要和B″亚基PR59、PR48有关。
CDC2-细胞周期蛋白B(cyclinB)复合体调控G2期细胞进入M期。
Thr161的磷酸化激活CDC2激酶,而Thr14和Tyr15的磷酸化灭活CDC2激酶。
PP2A既可直接使Thr161去磷酸化,还可间接通过激活WEE1激酶、灭活CDC25磷酸酶来维持Thr14和Tyr15的磷酸化状态,抑制CDC2活性,从而阻滞细胞周期于G2期。
2.2 PP2A和DNA复制
SV40大T抗原的功能之一是起始病毒DNA复制,大T抗原上多个丝/苏氨酸位点的可逆磷酸化参与这一过程的调节。
小剂量的冈田酸(okadaicacid,OA)既可完全抑制大T抗原的去磷酸化,又可抑制SV40DNA的复制。
在无细胞体系的SV40复制系统中加入纯化的PP2Ac,可直接造成大T抗原多个抑制性丝氨酸位点的去磷酸化,促使DNA复制。
PP2A最近也被证明和染色体DNA复制有关。
在蟾蜍卵提取物中免疫沉淀去除PP2A后,DNA复制的起始被完全抑制。
PR48是这一作用的调节亚基,它能和DNA复制起始的必需蛋白质CDC6相互作用。
2.3 PP2A和基因转录
转录因子的可逆磷酸化能够调节转录因子的转录活性、与DNA结合能力和细胞内定位。
cAMP效应元件结合蛋白(cAMPresponseelementbindingprotein,CREB)的活化和Ser133的磷酸化有关,而PP2A使Ser133去磷酸化,CREB灭活。
PP2A使c-JunSer63去磷酸化,激活c-Jun。
PP2A能够逆转CDK5-cyclinD1激酶磷酸化p107作用而间接灭活E2F。
PR65/A-PP2Ac二聚体和含有PR55/B三聚体都能使Sp1去磷酸化。
PP2A使STAT3的Ser去磷酸化,降低STAT3转录活性。
PP2A和PP1在调节癌基因HOX11的转录活性及与DNA的亲和力中也发挥重要作用,但是作用机制目前尚不完全清楚。
受PP2A调节的转录因子Sp1和NF-κB是许多人类病毒(HIV-1、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒和乳头状瘤病毒等)转录的重要调节因子。
通过调节HIV-1的基因表达和病毒复制,PP2A可能和AIDS的病理生理有密切关系。
最近还发现PP2A的活性和寄生虫传播疾病如疟疾相关。
2.4 PP2A和信号转导
(1)翻译的起始和终止——TOR信号 TOR和PI-3激酶、DNA依赖蛋白激酶相关,在营养因子刺激细胞蛋白质合成信号通路中发挥作用,是调节蛋白质合成起始的蛋白激酶。
在酿酒酵母中PP2A同工酶作为TOR下游信号因子转导TOR信号通路。
如前1.2节所述,TOR直接磷酸化Tap42,活化的Tap42-PP2A和Tap42-SIT4可磷酸化核糖体S6激酶和真核起始因子4E结合蛋白1(eIF-4BP),促进蛋白质合成的起始。
Tap42-PP2A复合体在营养缺乏或纳巴霉素(rapamycin)处理时受到破坏,导致TOR信号转导途径的抑制,蛋白质合成受抑,细胞生长停滞。
小鼠体内Tap42的同源蛋白质是B细胞受体复合物的组成蛋白质α4。
和Tap42一样,α4也和PP2Ac直接结合,并且同样对纳巴霉素敏感。
PP2Ac和翻译终止因子(eukaryoticreleasefactor1,eRF1)结合可能导致蛋白质合成的终止。
eRF1和PP2Ac的末端氨基结合,但似乎并不改变PP2A的活性。
然而,如果在COS细胞中使eRF1过度表达,同时会伴随核糖体中PP2A的数量显著增加,提示eRF1具有募集PP2A并促使其与相关底物相互作用的功能。
(2)Wnt信号 Wnt信号调节胚胎早期轴索形成。
多种上皮来源的肿瘤如直肠癌、皮肤癌和肝癌都与Wnt信号途径的失调有关。
Wnt信号途径的主要效应之一是增强由异二聚体β-链蛋白/TCF转录因子介导的转录,控制上皮与间质之间的转换。
该信号转导途径通过一个由多种蛋白质组成的信号体介导。
这个信号体由支架蛋白质结肠息肉腺瘤蛋白(APC)、β连环蛋白(β-catenin)、axin、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)和PP2A(AB′Cβ)组成。
GSK-3β具有组成型活性,它使APC、β连环蛋白和axin磷酸化。
在Wnt信号缺乏时,这种磷酸化造成β连环蛋白的不稳定,由其介导的转录受到抑制。
Wnt信号存在时,GSK-3β活性受到抑制,β连环蛋白稳定并转移到核内,激活由其介导的转录。
PP2A对Wnt信号途径的调节是多位点和多靶点的:
PP2Ac使GSK-3β去磷酸化,保持其活化状态;
PP2A的B′亚基抑制PP2Ac的作用,对GSK-3β起负性调控作用;
此外,PP2A还参与了Wnt介导的axin去磷酸化,axin去磷酸化后,其与β连环蛋白的亲和力降低,增强β连环蛋白的稳定性;
PP2Ac可能对β连环蛋白的核内转移和其介导的转录也起重要的作用。
(3)MAP信号通路 在正常细胞中,MAP(mitogenactivatedprotein)信号通路仅仅在瞬时发生,以保持细胞正常增殖,若持续活化则诱导细胞产生癌变恶化。
MAP信号通路包括Ras、Raf、MAPKK(MAPkinasekinase)、MAPK(MAPkinase)。
Raf-1作为MAP信号通路的上游因子,起MAP3K(MAPkinasekinasekinase,MAPKKK,MAP3K)作用。
PP2A能够使Raf-1Ser259去磷酸化,活化Raf-1;
同时抑制MAPK和MAPKK的活性。
一定剂量的OA或者微囊藻素(microcystin,MC)抑制PP2A酶活性,使MAP信号通路持续活化,提高c-fos和c-jun的转录水平,促进细胞增殖和抑制细胞凋亡,诱导细胞癌变。
PP2A还能使ERK2Thr183去磷酸化,下调ERK2活性,抑制ERK信号通路活性。
2.5 PP2A和细胞骨架
PP2Ac的两种同工型都在脑中高度表达,而且PP2A的B和B′亚基在脑中也有特异表达的同工型,提示PP2A在神经细胞内有独特的功能。
其中令人瞩目的是PP2A对微管相关蛋白(microtubule-associatedproteins,MAPs)磷酸化状态的调节。
神经特异性的微管相关蛋白包括tau(τ)蛋白和MAP-2,磷酸化程度过高将导致它们与微管分离,使微管丧失稳定性。
微管相关蛋白在神经元内的堆积是包括阿尔茨海默(Alzheimer)病在内的神经退行性疾病的特征之一。
ABαC形式的PP2A和tau(τ)蛋白结合,是主要的tau(τ)蛋白磷酸酶。
抑制脑内PP2A活性可促进tau(τ)蛋白磷酸化,微管不稳定,突触结构改变和神经元退行性改变。
阿尔茨海默病人的神经元PP2A活性显著降低,且PP2A依赖的PI-3激酶信号转导对神经元的存活起重要的作用,因此,脑组织PP2A功能的破坏是神经退行性疾病的原因之一。
2.6 PP2A和凋亡
PP2A和多种凋亡蛋白质相互作用,如胱天蛋白酶-3(caspase-3)、Bcl-2和腺病毒E4Orf4蛋白。
PP2A的PR65/A已被证明是胱冬肽酶-3的底物。
Jurkat细胞凋亡过程中胱冬肽酶-3激活,并切割PR65/A,造成PP2Ac活性升高。
Bcl-2的抗凋亡活性需要Ser70的磷酸化,这种磷酸化可被对OA敏感的PP2A类磷酸酶逆转。
神经酰胺(ceramide)可激活PP2A,通过和PP2AB56α亚基作用将含有B56α的PP2A定位到细胞线粒体膜上;
B56α和线粒体膜上Bcl2作用使PP2Ac催化Bcl2Ser70去磷酸化而诱导细胞凋亡。
E4Orf4蛋白与Bα结合后诱导凋亡,已经证明不能和PP2A结合的E4Orf4突变蛋白不能诱导凋亡。
2.7 PP2A和肿瘤生成
PP2A可能有抑制肿瘤细胞生长的作用。
首先,PP2A抑制剂OA是一个促癌剂,提示PP2A和其他磷酸酶很有可能具有抑癌功能。
癌基因产物可持续激活与细胞生长相关的激酶,而磷酸酶可通过去磷酸化使其回复到正常水平,阻止细胞的恶性转化。
其次,病毒诱导的细胞转化必须和PP2A结合并改变其活性;
Wnt信号途径的失调也是肿瘤发生的关键步骤。
另外,在人乳腺癌、肺癌、直肠癌和黑色素瘤细胞系中发现编码PR65/A的基因有不同程度的突变,也进一步提示PP2A的降低与肿瘤发生有关。
在B16黑色素瘤细胞中发现PP2AB56γ在迁移细胞中高表达,而在感染初期无迁移性的黑素瘤细胞或者正常黑色素细胞中低表达,提示B56突变促进细胞的侵袭和恶性转化过程,与肿瘤细胞迁移相关。
最后,PP2A可下调人乳腺癌细胞端粒酶活性,降低肿瘤的发展速率。
PP2A不仅有抑制肿瘤细胞生长的作用,在某些方面也和细胞增殖有密切联系。
有报道发现去除编码PP2Ac的基因可导致酵母和小鼠的死亡。
由此说明PP2A的功能非常复杂,不能把它简单地归类于与p53或RB类似的抑癌因子,而可称之为一类多功能酶系统,这和其结构的多样性、在组织细胞中不同定位以及对底物的选择特异性都相关。
3 PP2A活性的调节
PP2A酶催化活性、底物特异性和细胞内定位受到许多因素的调节,如调节亚基、翻译后修饰、抑制性蛋白质、第二信使和酶抑制剂等;
还有多种病毒能制造某些蛋白质和不同形式的B亚基竞争性结合PP2A核心酶,改变PP2A活性。
3.1 全酶及其调节亚基
从现在已知的PP2A亚基数目推测,至少存在75种不同的PP2A二聚体和三聚体。
这种复杂的全酶组成形式为PP2A活性的调节提供了多种可能方式。
首先,调节亚基的组织分布和细胞内定位决定了不同组成全酶的分布。
例如,ABαC是含量最丰富、表达最广泛的PP2A全酶,而ABβC仅仅表达于脑组织。
在一些特定的细胞生物学事件中,也仅表达特定的PP2A。
如HL-60细胞分化过程中AB′C表达上升;
组织发育过程中B亚基表达不同的同工型。
第二,调节亚基决定全酶的活性和底物特异性。
不同组成的全酶的活性、代谢特点以及对刺激信号的敏感度各不相同。
PP2A在一些特定环境下还具有酪氨酸磷酸酶活性,B亚基可抑制这种活性[31]。
B亚基的一个独特的性质是不同的B亚基和核心酶竞争性结合,交换或互相取代,例如,Bα可取代Bβ,但不能取代B′,而B′可取代两者。
B′的过度表达可调节PP2A活性,说明改变全酶的组成亦可调节全酶活性。
3.2 翻译后修饰
PP2Ac的羧基末端高度保守,包含两个磷酸化位点(Thr304,Tyr307)和一个甲基化位点(Leu309)。
Thr和Tyr残基的磷酸化与PP2A的灭活有关。
Tyr307是p60v-src、p56lck、上皮生长因子和胰岛素受体的分子靶点;
Thr304通过“自身磷酸化活化激酶”磷酸化。
PP2A也可通过自身去磷酸化重新活化。
Leu309的甲基化是一个可逆过程,甲基化对PP2A活性的影响还不确定。
由于三聚体的甲基化程度远高于二聚体,说明甲基化在从二聚体转换为三聚体的过程中有重要作用。
3.3 抑制性蛋白质
PP2A的胞内抑制蛋白质IPP2A1和IPP2A2具有特异性、非竞争性和热稳定性。
在接近生理浓度的Mn2+的环境下,IPP2A1和IPP2A2显著激活PP1,但并不影响两者对PP2A的抑制活性,提示细胞可利用IPP2A1和IPP2A2对不同磷酸酶进行协调调节。
根据氨基酸顺序,IPP2A1被鉴定是PHAP-1(putativehistocampatibilityleucocyteantigenclassII-associatedprotein-1),IPP2A2是PHAP-1在胞质内的切割体,称为SET(Suvar3-9,enhancerofzeste,trithorax)或TAF-1β(templateactivatingfactor-1β)。
已经发现在急性非淋巴性粒性白血病中,SET和CAN核孔蛋白(nucleoporinNup214)通过染色体移位形成融合蛋白质,这种融合蛋白质破坏PP2A活性的正常调节,导致白血病的发生。
另外一种白血病融合蛋白质HRX和SET结合并能与PP2A免疫共沉淀,提示HRX也可能通过影响PP2A的活性导致细胞生长失调。
在肝细胞癌变和肝细胞增殖过程中都观察到IPP2A2/SET基因表达上调,PP2A活性抑制。
3.4 第二信使神经酰胺
在许多信号转导途径中,对细胞外刺激的胞内早期反应之一是第二信使神经酰胺的产生。
根据所在的细胞类型,神经酰胺可以诱导细胞分化、增殖、生长停滞、炎症或凋亡。
已经鉴定了胞内神经酰胺的直接作用靶点包括神经酰胺激活的蛋白激酶、蛋白磷酸酶(CAPP)和蛋白激酶Cζ(PKCζ)。
CAPP包括PP1和PP2A。
来源于大鼠的CAPP主要是ABC和AB′C形式,也有AC二聚体形式。
神经酰胺能激活PP2A核心酶和游离的催化亚基,不需要B亚基的参与。
哺乳动物细胞内CAPP的下游靶点包括c-Myc,Bcl-2和c-Jun。
HL-60细胞TNFα受体活化诱导神经酰胺的产生、c-Myc下调和细胞凋亡。
由于OA可抑制这些效应,提示CAPP是神经酰胺信号转导途径中的重要分子。
神经酰胺还可激活线粒体PP2A,后者迅速导致Bcl-2的去磷酸化和灭活。
在TNFα处理的A431细胞中,鞘磷脂的迅速水解伴随c-Jun的去磷酸化,OA可抑制这些效应。
此外,部分纯化的CAPP可在体外诱导c-Jun的去磷酸化,提示c-Jun是胞内CAPP的直接靶分子。
3.5 病毒
由于PP2A功能的广泛性,就不会奇怪为什么许多病毒以不同的方式利用PP2A来达到同一个目的:
改变控制细胞生长和存活的信号机制,促进病毒DNA复制。
许多病毒蛋白质能直接与PP2A结合,从而改变其活性、底物
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