luminex操作步骤.docx
- 文档编号:4794095
- 上传时间:2023-05-07
- 格式:DOCX
- 页数:9
- 大小:19.59KB
luminex操作步骤.docx
《luminex操作步骤.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《luminex操作步骤.docx(9页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
luminex操作步骤
luminex操作步骤
未提供的所需材料
试剂
1、Luminex鞘液(Luminex编号#40-5000)
仪器/材料
1、25ul-1000ul可调移液器
2、5ul-50ul或25ul-200ul排枪
3、试剂管
4、EP管
5、橡皮圈
6、吸水纸
7、实验室用振荡器
8、超声波破碎仪(Branson#B200型超声清洗器或类似仪器)
9、专用摇床(Lab-Line#4625型或类似仪器)
10、真空过滤单元((Millipore编号#MSVMHTS00多孔真空装置或Millipore编号#WP6111560真空泵或类似仪器)
11、Luminex100?
IS,200?
或Luminex公司产HTS
12、板架(Millipore编号#MX-STAND,可用洁净96孔板代替)
安全注意事项
1、所有血液制品及生物制剂都具有潜在危险性。
在运输和处理传染原时须严格遵守疾病防控中心和职业卫生安全署所制定的防护措施。
2、叠氮化钠或Proclin可作为防腐剂加入某些试剂中。
虽然其浓度很低,但是叠氮化钠或Proclin可与铅和铜反应形成具有高爆炸性的金属叠氮化合物,可用大量水冲洗以防止叠氮化合物的形成。
技术指南
为获得可靠的和可重复的实验结果,在开始实验操作前,操作者必须仔细研读整个指南并完全理解每一步实验操作的各个方面。
在实验开始前,应复习回顾并理解以下要点。
1、本产品只可用于实验,不可用于诊断。
2、过期后请勿使用。
3、不可与其他来源的试剂混合或用其他试剂代替本试剂。
4、抗体标记微球对光敏感,必须避光保存。
在孵育期时,需用不透光板覆盖试剂板或用铝
箔包裹。
5、试剂在使用前须复温至室温(20-25摄氏度)。
6、在实验开始后或孵育期间,任何物体不能直接接触实验滴定板的底部。
为保证板子悬空
放置,可使用洁净96孔板放置于实验板下部,并使用胶带固定。
7、清洗不净可对结果产生不利影响。
所有清洗都必须用WashBuffer。
8、清洗之后用滤纸吸干实验滴定板底部以保证其清洁,防止因毛细现象引起的渗漏。
9、在板上使用真空吸引器时尽可能低流量,推荐每移除200ul缓冲液的时间?
5s(相当于
<100mmHg)。
10、在用双蒸水溶解后,所有的标准品及对照品都必须移至EP管中。
11、配制的系列稀释标准品必须在1小时内使用。
弃用剩余的稀释标准品。
标准品原液可以在-20摄氏度保存1月,在-80摄氏度可保存1月以上。
12、如果样品处在本试剂的浓度范围之外,请适当稀释样品并重复本过程。
13、已混合但未使用的抗体标记微球可置于混合瓶中保存,在2-8摄氏度条件下最多可保存1月。
14、在标准曲线的制备过程中,请确保先混合高浓度再配制低浓度,每一个浓度配置时请更换新的移液器枪头。
15、配液完成后请立即读数,如不能立即读数,请用铝箔或不透明盖封闭板子,在2-8摄氏度条件下保存至多24小时。
读数前,室温下将板子置于摇床上晃动10分钟,推迟读数可造成对某些细胞因子和炎症趋化因子的敏感性降低。
16、摇床速度应设定在不使液体溅出的条件下的最大转速,对于推荐使用的摇床而言,速度设定在5-7,大约500-800rmp。
17、确保针状探头清洁,其有可能碰到超声破碎仪或酒精流。
在含量测定读数之前,根据Luminex推荐的方案调节枪头的长度,用配套的3个校对盘进行调整。
18、对细胞培养的上清液和组织提取液而言,在背景孔、标准品孔及质量控制孔中,应使用细胞培养或组织提取液作为基质溶液。
如果样品经过AssayBuffer稀释,则使用该缓冲液作为基质溶液。
19、对于血浆/血清样品,应使用配套的血清基质。
20、对细胞/组织匀浆,应保证最终的匀浆在缓冲液中有中性的Ph,最小量的洗涤剂或强变性洗涤剂,符合生理浓度的离子浓度。
避免组织残渣、脂类、细胞/组织的聚集。
使用前离心样品。
21、在加入板子之前,所有试剂应混匀。
样品收集及保存
A、血清样品的制备:
1、让血液凝固至少30分钟以上,1000g离心10分钟,移出血清后立即进行测定,或
分装后在?
-20摄氏度条件下保存。
2、避免多次冻融(>2)。
3、对于冰冻样品,在使用前应充分融解,混匀后离心。
4、在测定前,推荐3000g离心样品5分钟。
5、大鼠血清应使用血清基质稀释5倍以作为样品稀释液。
每1份大鼠血清混入4份血
清基质(例如12ul大鼠血清加入48ul血清基质中作为平行双样)。
或者在?
部分的
第8步,免疫测定阶段,在每个样品孔中加入20ul血清基质、5ul未稀释的血清样
品。
为测量某些血清样品中的预计的高浓度RANTES和GRO/KC,可能需要进一步稀
释(例如1:
20)。
B、血浆样品的制备
1、血浆收集时推荐使用EDTA作为抗凝剂。
对30分钟内收集的血液标本1000g离心10
分钟。
移出血浆后立即进行含量测定,或分装后在?
-20摄氏度条件下保存。
2、避免多次冻融(>2)。
3、对于冰冻样品,在使用前应充分融解,混匀后离心。
4、制备大鼠血浆样品时推荐使用EDTA作为抗凝剂。
5、在含量测定前,推荐3000g离心样品5分钟。
6、大鼠血浆应使用血清基质稀释5倍以作为样品稀释液。
每1份大鼠血浆混入4份血
清基质(例如12ul大鼠血浆加入48ul血清基质中作为平行双样)。
或者在?
部分的
第8步,免疫测定阶段,在每个样品孔中加入20ul血清基质、5ul未稀释的血浆样
品。
为测量某些血浆样品中的预计的高浓度RANTES和GRO/KC,可能需要进一步稀
释(例如1:
20)。
C、组织培养上清液的制备
1、离心样品,去除沉淀后立即进行含量测定,或分装后在?
-20摄氏度条件下保存。
2、避免多次冻融(>2)。
3、在含量测定前,组织培养上清液可能要用合适的培养基进行稀释。
4、组织/细胞提取应在中性缓冲液中进行,其溶液及条件对含量分析应无影响。
过高浓
度的洗涤剂、盐类、变性剂,过高或过低ph等都会对结果产生消极影响。
应避免使
用有机溶剂。
组织/细胞提取样品应当不含细胞/组织碎片等颗粒。
注意
1、每个孔的最大加样量为25ul,稀释的血清、血浆、组织培养液等均可加入。
2、所有样品都必须保存在EP管中,不可将样品放置于玻璃容器中保存。
3、在使用严重溶血或高血脂的样品时,应避免其中含有组织碎片、脂类、细胞等。
免疫测定试剂的制备
A、抗体标记微球的制备
如果使用预混合微球,使用前先用超声破碎仪处理预混合微球30s,振荡器振荡1分钟。
对于单独分装的微球瓶,在超声波破碎仪上处理30s,振荡器振荡1分钟。
从每个抗体
微球瓶中吸取60ul液体加入混合瓶,加微球稀释液至3ml,振荡混合液,未用部分可在
2-8摄氏度保存至多1月。
示例1:
使用7种细胞因子抗体标记微球时,从每种微球中分别吸取60ul至混合瓶中,
然后加入2.58ml微球稀释液。
示例2:
使用20种细胞因子抗体标记微球时,从每种微球中分别吸取60ul至混合瓶中,
然后加入1.8ml微球稀释液。
B、质量控制组的制备
在使用前,各用250ul去离子水构建质量控制组1和质量控制组2。
多次翻转瓶子以充
分混合,静置5-10分钟,将控制组转移至有适当标记的EP管中,未使用部分在?
-20
摄氏度条件下至多保存1月。
C、清洗缓冲液(WashBuffer)的制备
取10×WashBuffer在室温下混合,使所有盐类溶解,用270ml去离子水稀释30ml10
×WashBuffer,未用部分可在2-8摄氏度保存至多1月。
D、血清基质的制备
此步骤仅在血清/血浆样品时需要。
将1ml去离子水和4mlAssayBuffer加入含有冻干血清基质的瓶中,充分混合,等待10
分钟以上以使其充分溶解。
剩余的血清基质在?
-20摄氏度条件下至多保存1月。
E、大鼠细胞因子标准品的制备
1、使用前,用250ul去离子水溶解大鼠细胞因子标准品,使标准品浓度达到20,000
pg/mL,此可用作除Leptin外所有被测物的标准品,Leptin溶解后浓度可达到100,000
pg/mL。
多次翻转瓶子以充分混合,振荡器振荡10s,静置5-10分钟,将标准品转移
至有适当标记的EP管中。
这可用作为原始标准品,未使用部分在?
-20摄氏度条件
下至多保存1月。
2、工作标准品的制备
分别标记6个EP管1:
4,1:
16,1:
64,1:
256,1:
1024,1:
4096,每管中分别加入
120ulAssayBuffer。
连续稀释,取40ul原始标准品加入1:
4管中,充分混合,从1:
4
管中吸取40ul加入至1:
16管中,充分混合,从1:
16管中吸取40ul加入至1:
64管中,
充分混合,从1:
64管中吸取40ul加入至1:
256管中,充分混合,从1:
256管中吸取
40ul加入至1:
1024管中,充分混合,从1:
1024管中吸取40ul加入至1:
4096管中,
充分混合。
0pg/mL标准品(背景)用AssayBuffer。
鉴于不同需要,使用者可能要对标准曲线进行3×或5×连续稀释。
免疫测定操作过程
在开始测定之前,必须完整阅读此部分内容并充分理解技术指南。
试剂在使用前须复温至室温(20-25摄氏度)。
在孔板上垂直设定标准品(0,1:
4096,1:
1024,1:
256,1:
64,1:
16,1:
4,标准品原液)、质量控制组1和2、样品的位置(注意:
大多数仪器只在垂直方向上读取96孔板)。
推荐测试时使用复孔。
在配置试液及孵育时请保证实验滴定板底部不接触任何界面。
1、在实验滴定板的每一孔中加入200ulAssayBuffer用以预湿,封闭后在室温下置于摇床上
震荡10分钟。
2、用真空泵移除AssayBuffer(注意:
不要将板子倒置)。
用吸水垫或滤纸吸干板子底部的
残留液体。
3、在适当位置的孔中加入标准品组或质量控制组,每一个浓度加25ul,用AssayBuffer作
为0pg/mL标准品(背景)。
4、在样品孔中加入25ulAssayBuffer。
5、在背景孔、标准品孔、质量控制组孔中加入合适的基质液。
测定血清或血浆时,使用配
套提供的血清基质。
测定组织培养液时,使用相同的培养液作为基质溶液。
测定组织/
细胞培养提取液时,应使用相同的提取液缓冲液作为基质溶液。
6、在合适的孔中加入25ul稀释的样品。
7、晃动混合瓶,在每个孔中加入25ul混合或预混合微球(注意:
在加入过程中,间歇震荡
瓶子以防止微球沉降)。
8、用专用塑料膜封闭板子,盖紧盖子,板夹用橡皮圈包裹,在4摄氏度条件下摇床上过夜
(18-20小时)。
9、用真空泵轻轻吸走残留液体(注意:
不要将板子倒置)。
10、每孔加入200ulWashBuffer进行清洗,洗涤2次,每次洗涤中间用真空过滤去除Wash
Buffer,用吸水垫或滤纸吸干板子底部的残留液体。
11、每孔中加入25ul二抗(注意:
二抗在加入前应复温至室温)。
12、封闭、盖盖,室温下(20-25摄氏度)摇床上孵育2小时。
孵育后不要使用真空泵。
13、在含二抗的孔中加入25ulStreptavidin-Phycoerythrin。
14、封闭、盖盖,室温下(20-25摄氏度)摇床上孵育30分钟。
15、用真空泵移除板内所有内容物(注意:
不要将板子倒置)。
16、每孔加入200ulWashBuffer进行清洗,洗涤2次,每次洗涤中间用真空过滤去除Wash
Buffer,用丝布擦掉板子底部多余液体。
17、所有孔中加入150ul鞘液,摇床上震荡5分钟使微球呈悬浮状态。
18、将板子置入Luminex100?
IS,,200?
或HTS内。
19、保存并分析MFI结果,计算样品中的细胞因子/炎症趋化因子浓度(weighted5or
4-parameterlogistic或splinecurve-fittingmethod)。
计算出样品浓度后请乘以稀释倍数以计算原始样品浓度。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- luminex 操作 步骤