昆虫sf9细胞培养Word格式文档下载.docx
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细胞来源:
Sf9(货号B825-01)和Sf21(货号B821-01)细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系,源于美国农业部昆虫病理实验室。
此细胞系适用于InsectSelect系统。
这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系,来源于秋蝇蠕虫(草地夜蛾)蛹的卵巢组织。
(以上来自invitrogen)
细胞特点:
规则的带有颗粒球形。
贴壁紧。
标准条件的定义:
培养最低密度:
0.6×
106/ml(健康对数生长期细胞活率至少应不低于90%。
活率低于90%细胞不是在最佳条件下培养不能用于实验)1×
106/mL将出现对数生长状态
传代培养:
传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和最大活率。
贴壁培养:
贴壁细胞传代需在细胞长成单层(如下定义)然后1:
5(细胞体积:
最后培养基体积)稀释维持对数生长。
形成单层细胞可以传代培养
悬浮培养:
在细胞密度达到2.0×
106-2.5×
106细胞/mL后将密度调整至0.7×
106-1.0×
106细胞/mL进行悬浮传代。
确保传代细胞密度不高于4×
106个/mL或保持密度高于1×
106个/mL以达到对数生长状态。
Sf9悬浮培养所需要的细胞数
培养基:
sf-900ⅢSFM(添加2%的血清减小感染过程中蛋白水解量)
培养瓶与培养体积:
冻存:
一旦细胞系建立且倍增规律则可以进行冻存。
细胞需达到90%活率和80-90%融合的要求(如:
低代次)推荐冻存几管。
当融解细胞,它将会达到最佳使用状态。
1.用细胞计数板计数细胞。
需要足够的如上表所示密度的细胞冻存2-4管。
细胞可是悬浮或贴壁培养;
2.将无菌冻存管立于冰上,做好标记;
3.室温400-600×
g离心10min。
移除上清。
4.以给定的密度在冻存液中重悬细胞;
5.移取1mL细胞悬液置于无菌冻存管中;
6.置于-20℃1h,然后移至-80℃24-48h;
7.储存于液氮中。
转染的细胞:
需要的是对数期的细胞>95%发育能力,可以完成成功的转染。
载氧:
对于最优生长条件和蛋白的表达,昆虫细胞要求被动的通氧。
积极的通氧系统要求溶氧饱和在10%-50%
Sf900II和sf900Ⅲ的区别:
一般推荐Sf900II来大量表达蛋白
Sf900II含有表面活性剂(剪切力保护剂(保护细胞在转瓶中培养时不会受到剪切力伤害))
当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时,注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂,因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。
细胞培养的一般顺序:
复苏——传代——传代稳定——冻存
应当遵循的一般过程:
复苏——贴壁培养——悬浮——悬浮扩大培养(产生目标蛋白)
(也可不经过贴壁培养,直接悬浮培养)
贴壁时间:
45min
悬浮的转速:
80rpm
附:
离心机rcf与g的换算:
无血清培养基可以选择性加入一定的抑菌剂防止细菌或者真菌污染:
GIBCO-SFM900
加青霉素链霉素抑制细菌生长两性霉素B抑制真菌生长
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- 昆虫 sf9 细胞培养