蛋白质银染原理与方法Word文件下载.docx
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蛋白质银染原理与方法Word文件下载.docx
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SilveringSolution(银染液)。
室温振荡保温20min。
⑦彻底弃去银染液,加入25mL
Developing
Solution(显色液),室温振荡保温1~10min。
注意观察目的条带。
如果目的条带出现了,可以考虑终止显色。
显色时间不要过长,否则本底较深。
⑧彻底弃去显色液,
加入25mLStoppingSolution(终止液),室温振荡保温10min。
⑨彻底弃去Stopping
Solution(终止液),用50mL去离子水洗3次,每次5min。
弃去洗涤的水,加入25mLPreserving
Solution(保护液),室温振荡保温20min。
银染PAGE胶可以拍照保存,也可以室温玻璃纸干燥。
今天第一次银染,结果出来啥也没有,凝胶就像一块海带一样。
能不能提供详细的银染步骤呢好像有好几种版本,哪位大侠有经验的希望能点拨一下
hotstoewrote:
1.取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.
2.%硝酸银染色10分钟.
3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.
4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.
显色液配方:
10克氢氧化钠+克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.
这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.
我的经验是:
1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次,
3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟(换2次去离子水)
4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来,要求越高可能导致背景就深,
5.染色后要用固定液(冰乙酸)终止染色,
6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍(整个试验比较费去离子水)。
多谢各位的指导!
我现在是在12%的凝胶里加入丙三醇优化.
现在的问题是背景和条带都很浅.仍能分辨读出条带数,但是拍摄出来的还是不清楚.
请问有必要提高硝酸银的浓度吗(我现在用的是%的硝酸银)
向各位请教几个关于TRAP-银染的问题,多谢各位指教。
我用的是鼎国的试剂盒做的TRAP,用的是8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后是银染,但是结果很令人失望,电泳的胶取下来的时候竟然破成了好几片,染色后也看不出什么结果,我想问的是TRAP-银染,这个实验成功的关键步骤在哪里,哪一步最容易出问题银染后理想的结果应该是什么样子的请说的具体点好吗,谢谢。
背景是什么样的比较好,还有条带应该是什么颜色,有多深,什么样的。
谢谢了!
我的做法是这样的,染色效果还可以
10%的乙醇固定10分钟,ddH2O洗一次,2分钟。
1%的硝酸脱色4分钟,ddH2O洗两次,每次1分钟。
%AgNO3染色20分钟,ddH2O洗三次,每次1分钟。
NaCO3-甲醛显色至条带出现。
我的感觉是乙醇和硝酸重复使用的次数不要太多,这样效果不好,NaCO3-甲醛得质量很关键,我们有一次换了试剂,效果非常差。
1)10%乙醇,5min;
2)双蒸水过水2次(短暂);
3)1%硝酸,5min;
4)双蒸水过水;
5)%硝酸银,在摇床摇动10min;
6)双蒸水过水(不超过5sec);
7)显影液显影,边晃动边显影,至显影满意为止;
8)10%冰乙酸固定,至无气泡;
9)40℃烘箱,3天;
10)剥离,保存。
Notes:
显影液的配制:
无水碳酸钠
甲醛100ul
硫代硫酸钠(1%)10ul
双蒸水100ml
银染法分以下几个程序:
1、固定
2、敏化
3、银育
4、显影
5、停显
此外,其间还有数步的漂洗程序。
在你的银染方法中没有敏化过程,不过也中可以的,只是灵敏度会下降。
银染法还可分为碱性银染和酸性银染法,你的方法为酸性银染法。
为何称为酸法是指硝酸银这一强酸弱碱盐溶液因水解呈酸性而得名
何为二胺类银染法俺知道有银铵法,即在硝酸银溶液中加入氢氧化钠,银离子在氢氧化钠的作用下生成氢氧化银沉淀,后加入过量氨水,形成可溶的银铵络和物,而后者经甲醛还原为单质银颗粒。
二胺法可是指此络和物为二铵盐您这里的“胺”应为“铵”。
至于敏化作用,众说纷纭,且银染的灵敏度相当高,对常规分子生物学实验已是牛刀小用,敏化俺认为还是不用的好,因为对背景不利。
对于银染的研究在80年代的electrophoresis杂志中多有报道。
小经验:
为便于控制显影速度,得到最佳的信噪比,银染的显影液温度不要过高,以10度左右为宜,高则易显影过度,背景深,低则显影时间长。
考染后银染我做过不少次,银染的效果还是不错的。
无需把考染的蛋白条带全部脱色,只要本底脱差不多就可以了。
银染的固定步骤也可以省略,因为在考染前已经固定过了。
只需要用%乙酸钠+%戊二醛+30%乙醇+%硫代硫酸钠浸泡30min,去离子水清洗3次,每次5min,%硝酸银染色20min,去离子水清洗膜两面,就可以用碳酸钠+甲醛的显色液显色了,直到自己满意为止,再用5%乙酸终止显色。
效果还是很好的。
1,--原理:
蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团(如琉基、碳基等)与银的结合,检测极限是2~/蛋白条带。
2,材料及注意;
固定和脱色液
10%(/)戊二醛(用50%贮液现用现配,Kodak)
硝酸银溶液(含氨)
洗印显影液
Kodak快速定影液A
【注】全过程需穿戴手套,以免指纹污染。
3,步骤:
步骤:
l)将聚丙烯酰胺凝胶放在塑料容器并以5倍体积的固定液覆盖,在旋转摇床中缓慢摇
动30min以上。
2)倾去固定液,加5倍凝胶体积的脱色液,缓慢摇动60min以上。
3)倾去脱色液,加5倍凝胶体积的10%戊二醛,在道凤橱中缓慢摇动30min。
小心:
带手套并仅在通风泅中进行。
4)倾去戊二醛溶液,用水洗凝胶4次以上,每次30min以上,最后一次洗涤以过夜为
佳。
缓慢摇动。
5)倾去水,将凝胶置于约5倍凝胶体积的硝酸银榕液中平衡(完全盖没凝胶),剧烈振荡
15mln。
小心:
由于氨银溶液干燥会发主爆炸.应马上用大量水冲洗
6)将凝胶移至另一塑料盒,用去离子水洗5次。
每次精确5min,缓慢摇动。
7)用500mL水稀释25mL显影液,将凝胶移至另一塑料盒,加人足够的稀释显影液盖
没凝胶,并剧烈摇动至条带达到需要的强度。
如果显影液变成傣色。
须换新鲜的显影
液。
8)换Kodak快速定影液,定影5mln,必要时,用湿润了的棉花搽去凝胶表面沉积的残
余银沉积物。
倾去定影液,用水彻底冲洗凝胶(4~5min)。
9)凝胶拍照
这是我经常用的步骤,经过检验n次了,希望能帮助你。
蛋白银染步骤
步骤溶液时间
固定甲醇100ml
冰醋酸25ml
加双蒸水至250ml30min
冲洗双蒸水3次
敏化甲醇75ml
戊二醛(25%w/)
硫代硫酸钠(5%w/)10ml
醋酸钠(17g)
银反应硝酸银溶液%w/)25ml
甲醛(37%w/)
加双蒸水至250ml20min
冲洗双蒸水2次
显色碳酸钠
加双蒸水至250ml
2-5min
终止EDTA-Na22H2O
加双蒸水至250ml10min
我室固定的蛋白银染方法,效果很不错,也很简单,步骤如下:
1)PAGE胶切下后用50%乙醇(100ml左右)洗三次,每次20分钟
2)2%硫代乙醇酸钠稀释50倍作用1分钟,双蒸水洗3次,每次20秒
3)2%硝酸银稀释10倍作用20分钟,双蒸水洗3次,每次20秒
4)6%碳酸钠溶液显色,直到条带清晰为止,一般几分钟,大量水冲洗
5)加中止液10%乙酸中止即可
siliawrote:
大家好,我看了此贴,有一点不太明白,
硫代乙醇酸钠,是什么药品,是不是作者写错啦望大虾指点。
急,盼复。
另外,其后的洗20秒还是20分呀
我推荐使用graymatter的protocol,基本上和我们用的一致,应该很稳定的,其中稍稍有一些经验,如:
1.固定这步是可以过夜的。
2.加银染液后一定要避光!
!
3.在固定、银染这几步最好放在摇动托盘上!
这样随着的液体的晃动作用比较均匀。
4.显色这步很关键,需要一些摸索,新手经常会显过了,整个gel黑糊糊的!
5.显色对光线没有太大要求,室内可见光就行。
6.接触gel时有条件一定要带一次性手套,要不然可以染出来一个大手印的!
前面几位说的很好,而且看来非常富有经验
不过,咱也贡献一把吧,只是一点注意事项:
1,最好全部用去离子水,电阻>
=18兆欧
2,如果想要充分显色,可以适当提高温度,比如37度温箱
3,最好戴手套处理全过程
ptotocol是这样的,请看哪里不妥:
建议使用silia的方法!
简单,快!
本人的银染方法:
1.固定:
100mlMeOH,24mlHAc,56ml%HCHO,20mlddH2O,洗三次,每次>
=20分钟;
2.50%EtOH洗PAGE胶三次,每次20分钟;
3.预处理:
%Na2S2O3处理一分钟;
4.水洗:
ddH2O漂洗三次,每次20秒;
5.染色:
20%AgNO3+72ml%HCHO处理PAGE胶20分钟;
6.水洗:
同上;
7.显色:
25ml12%Na2CO3,24ml%HCHO,1ml%Na2S2O3,漂洗10-15分钟;
8.水洗:
9.终止:
50%MeOH,12%HAc,10分钟。
以上步骤从中科院生化所学来,过程和silia的基本一致,不知道是否有出入,请大家指正。
谢谢!
1银染液1(1000ml):
甲醇50%乙酸12%
甲醇500ml冰醋酸120ml
2银染液2(1000ml):
甲醇30%,乙酸钠,戊二醛%,硫代硫酸钠%,(含乙酸1-2ml)
甲醇300ml乙酸钠戊二醛10ml硫代硫酸钠1g乙酸1-2ml
3显色液(1000ml)无水碳酸钠%甲醛%
无水碳酸钠25g,甲醛
4硝酸银(100ml):
20%硝酸银(过滤后待用)
染色步骤:
1银染液1洗2次,每次5分钟
2银染液2洗1次,每次30分钟
3超纯水洗2次,每次1分钟
4%硝酸银洗30分钟
5超纯水洗5次,每次1分钟(关键步骤,共计5分钟)显色液显色
6看到各条带,则倾去显色液,1%乙酸中止
我感觉浸银后、显色前的水洗非常关键,时间不能太长,次数不能太多,否则可能会染不上颜色。
但水洗不充分又可能导致背景较深。
我个人一般是用水洗三遍,每次半分钟左右。
固定液:
50%乙醇,10%冰醋酸,40%水
浸泡液:
30%乙醇,%NaAc,50%戊二醛,%NaS2O35H2O
银染液:
%AgNO3,%甲醛
显色液:
%Na2CO3,%甲醛
终止液:
%EDTA-2Na2H2O
银染方法:
参照phamacia公司提供的银染方法。
凝胶-固定液30分钟-浸泡液30分中-水洗5分钟,2次--银染液20分钟---显色液2-10分钟--终止液10分钟。
完毕!
像海带是什么意思,都染黑了吗,首选确定是不是有蛋白,如果这个没问题那就是染色时间过长了,注意银染几分钟条带就出来了,一定要看着它着色,一旦觉得是最佳效果,要立刻换终止液终止反应
上面是我以前查的别人以及自己的经验,你可以参照着总结一下,大致步骤都差不多的
谢谢DF1。
蛋白现在还不能确定有没有。
但是MARKER也没有看到。
染色时间可能是太长了。
我再试试。
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