RNA转录后的加工与修饰Word文档格式.docx
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真核生物mRNA的加工修饰,主要包含对5’端和3’端的修饰以及对中间部分进行剪接。
1.在5’端加帽
成熟的真核生物mRNA,其结构的5’端都有一个m7GPPNmN结构,该结构被称为甲基鸟苷的帽子。
如图179所示。
鸟苷通过5’5’焦磷酸键与初级转录物的5’端相连。
当鸟苷上第7位碳原子被甲基化形成m7GPPNmN时,此时形成的帽子被称为“帽0”,如果附m7GPPNmN外,这个核糖的第“2”号碳上也甲基化,形成m7GPPNm,称为“帽1”,如果5’末端N1和N2中的两个核糖均甲基化,成为m7GPPNmPNm2,称为“帽2”。
从真核生物帽子结构形成的复杂可以看出,生物进化程度越高,其帽子结构越复杂。
图179 PosttranscriptionalmodificationofmRNashowingthe7methylguanosinecapandpolyAtail.
真核生物mRNA5’端帽子结构的重要性在于它是mRNa做为翻译起始的需要的结构,对核糖体对mRNA的识别提供了信号,这种帽子结构还可能增加mRNA的稳定性,呵护mRNa免遭5’外切核酸酶的攻击。
2.在3’端加尾
大多数的真核mRNA都有3’端的多聚尾巴(A),多聚(A)尾巴大约为200bp。
多聚(A)屠巴不是由DNA编码的,而是转录后在核内加上去的。
受polyA聚合酶催化,该酶能识别,mRNa的游离3’OH端,并加上约200个A残基。
近年来已知,在大多数真核基因的3’一端有一个AATAA序列,这个序列是mRNa3’端加polyA尾的信号。
靠核酸酶在此信号下游1015碱基外切断磷酸二酯键,在polyA聚合酶催化下,在3’OH上逐一引入100200个A碱基。
关于polyA尾巴的功能问题尽管经过极其广泛的探索,但还不完全清楚。
有人推测polyA可能与mRNA从细胞核转送到细胞质有关,但是相当数量,的没有polyA屠巴的mRNA如组蛋白mRNA,也照样通过核膜进入细胞质。
还有人认为这种结构对真核mRNA的翻译效率具有某种作用,并能稳定mRNA结构,坚持一定的生物半衰期。
3.mRNA前体(hnRNA)的拼接
原核生物的结构基因是连续编码序列,而真核生物基因往往是断裂基因,即编码一个蛋白质分子的核苷酸序列被多个拔出片断所隔开,一个真核生物结构基因中内含子的数量,往往与这个基因的大小有关,例如胰岛素是一个很小的蛋白质,它结构基因只有两个内含子,而有些很大的蛋白质,它的结构基因中可以有几十个内含子。
经过复杂的过程后,切去内元,将有编码意义的核苷酸片段(Extron外元也叫外显子)连接起来(图1710)。
图1710 Primarypolymerase11transcriptofaeukaryotegeneshowing(a)intronsaftercappingandadditionofpolyAtail.(b)ExcisionofintronstoformthematuremRNAiscalledsplicing.
真核生物的结构的基因中具有可表达活性的外显子,也含有无表达活性的内含子,但内含子序列下是无意义的,越来越多的实验证明有许多基因中的内含子介入基因表达调控,在转录时,外显子及内含子均转录到hnRNA中。
在细胞核中hnRNA进行剪接作用,首先在核酸内切酶作用下剪切掉内含子;
然后在连接酶作用下,将外显子各部分连接起来,而变成成熟的mRNA,这就是剪接作用,也有少数基因的hnRNA不需进行剪接作用,例如α干扰素基因,图1711以卵清蛋白基因为例,介绍一个典型的转录及加工过程。
图1711 卵清蛋白基因转录及加工过程
图中外显示以1、2、3、4……暗示,内含子以A、B、C、D…暗示
mRNA的拼接,需要在拼接部位有供拼接识此外守旧性强的一致顺序,通过对100多种真核细胞基因的分析,发现外元和内元拼接部位部分碱基顺序有一定的规律(见表174)。
表17-4 含有内元的转录产品其拼接处的碱基顺序
基因区域
Exon
Intron
卵清蛋白内元2
UAAGGUGA
~~~~~~~
ACAGGUUG
卵清蛋白内元3
UCAGGUAC
UCAGUCUG
β珠蛋白内元1
GCAGGUUG
UCAGGCUG
β珠蛋白内元2
CAGGGUGA
ACAGUCUC
Igλ内含子1
UCAGGUCA
GCAGGGGC
SV40病毒早期T抗原
UAAGGUAA
UUAGAUUC
表中划线的碱基对拼接识别有重要作用,如将兔的β珠蛋白的拼接部位的GT改为AT后,拼接反应即受到影响。
mRNA前体拼机制
图1712 TheRNAsplicingmechanism.RNAsplicingiscatalyzedbyaspliceosomeformedfromtheassemblyofU1,U2,U5,andsnRNPs(shownasgreencircles)plusothercomponents(notshown).Afterassemblyofthespliceosome,thereactionoccuresintwospeps:
instep1thebranchpointAnucleotideintheintronsequence,whichislocatedcolsetothe3'
splicesite,attacksthe5'
splicesiteandcleavesit;
thecut5'
endoftheintronsequencetherebybecomescovalentlylinkedtothisAnucleotide,formingthebranchednucleotideshowninFigure855.Instep2the3'
OHendofthefirstexonsequence,whichwascreatedinthefirststep,addstothebeginningofthesecondexonsequence,cleqvingtheRNAmoleculeatthe3'
splicesite;
thetwoexonsequencesaretherebyjoinedtoeachotherandtheintronsequenceisreleasedadaribosone.ThesesplicingreactionsoccurimthenucleusandgengeratemRNamoleculesfromprimaryRNAtranscripts(mRNAprecursormolecules).
mRNA拼接反应需要有核内小分子RNA介入它们与蛋白质形成的复合物称为小核糖核蛋白颗粒,SnRNA分别被命名为U1,U2,U3,U4,U5,和U6RNA。
SnRNA中的U2RNA由与内元右端拼接部位附近的UACUAA顺序高度互补,形成一个环状结构,由特定的酶来识别切除该环状结构,完成拼接过程,如图1712所示。
图1713 MechanimofmRNasplicing.Notethat,forclarity,theprocessisshownintwostages;
energyisnotrequiredfortheprocesssincetransesterificationreactionsareinvolved.
真核生物mRNA前体在剪接过程中,还可以形成套索样的结构,在内含子序列中常有一个分支部位的腺苷酸残基,它的2’OH可以自动攻击内含子5’端与外显子1连接的磷酸二酯键,切开了外噗子1,而腺苷酸原来已有3’,5’磷酸二酯键相连的两个相邻的核苷酸残基,加上此3’,5’磷酸二酯键连接后,在腺苷酸处出现了一个套索,已被切下的外显子1的3’OH攻击内含子3’末端与外显子2之间的3’,5’磷酸二酯键,键断裂后,内含子以套索的形式被节下来,此时外显子1和外显子2可以连接起来(图1713)。
不管拼接过程如何,拼接必须极为精确,否则会导致遗传信息传递障碍,合成的蛋白质可能丧失其正常的功能。
我国南方广大地区是β地中海贫血的高发区,这是由于β珠蛋白链的合成受到部分或完全抑制所引起的一种血红蛋白病。
实验标明β珠蛋白基因元1中核苷酸的点突变改变了正常拼接部位的碱基顺序,结果造成错误部位的拼接。
加工成熟的mRNA虽能翻译,但产品不是正常的β珠蛋白,结果引起血红蛋白级结构和功能的改变。
(二)rRNA转录后加工
原核生物rRNA转录后加工,包含以下几方面:
①rRNA前体被大肠杆菌RNaseⅢ,RNaseE等剪切成一定链长的rRNA分子;
②rRNA在修饰酶催化下进行碱基修饰;
③rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基(见图1714)
图1714 大肠杆菌rRNA前体的加工
真核生物rRNA前体比原核生物大,哺乳动物的初级转录产品为45s,低等真核生物的rRNA前体为38s,真核生物5sRNA前体独立于其他三种rRNA的基因转录(图1715)。
图1715 真核生物rRNA前体的加工
真核生物rRNA前体中含有拔出顺序,rRNA前体要形成成熟的rRNA,需要经过拼接反应。
例如,四膜虫的rRNA前体的拼接是一种无酶催化的自动拼接过程。
四膜虫基因组内,26srRNA编码的区域内有413bp的拔出顺序。
该插放序列可以不必耗能量从rRNA前体中被除掉。
用SDS煮沸和用蛋白酶外理等破坏酶活性法子,都不克不及破坏拼接活性,但反应中Mg2+和鸟嘌呤核苷酸是必在的。
用32PGTP进行追踪实验标明,起始过程是GTP在拔出顺序5’端发生亲核反应,同时GMP与5’端切点的切除段形成磷酸二酯键并使原RNA断开。
第二步是5’切点的外元3’OH与3’切点的外元5’P共价连接,获得成熟的rRNA,被切除部分最后环化,形成一个环状结构,同时从5’端去掉一个15核苷酸啐片。
剩余部分连接成399核苷酸的环状产品,再经过几步,最后切下一个19个核苷酸的线性内含子序列即L19,它具有催化活性,上面的剪接作用,是由内含子自己的催化性质决定的(图1716)。
图1716 四膜虫rRNA前体的自我剪接
这种rRNA的自身剪接反应给人们一个提示:
即RNA分子也有酶的催化活性。
这向酶的化学实质是蛋白质这一传统概念提出了挑战。
这种有酶催化活性的RNA分子命名为Ribozyme。
T.Cech和S.Altman各自分别发现RNA具有催化作用,他们的发现对于了解生命进行过程有重要意义。
很可能在原始生命中,RNA所催化的断裂一连接反应是最早出现的催化过程。
为此,他们共同获得了1989年Nobel化学奖。
从大多数Ribozymw的结构中发现一些特征,例如:
锤头状结构的RNA分子有13个守旧的核苷酸序列,如果它们中的碱基改变会使这种催化活性失去作用。
根据这种特片,科学家们在体外没计并人工合成这种RNA分子,用于抗肿瘤及抗病毒的实验中(图1717)。
图1717 锤头结构模式图
(三)tRNA转录后的加工修饰
原核生物和真核生物刚转录生成的tRNA前体一般无生物活性,需要进行①剪切和拼接②碱基修饰③3’OH连接ACC结构(图1718)。
图1718 tRNA前体的加工
①tRNA前体在tRNA剪切酶的作用下,切成一定在小的tRNA分子。
大肠杆菌RNaseP可特异剪切tRNA前体的5’旁顺序,因此,该酶被称为tRNA5’成熟酶。
除了RNaseP外,tRNA前体的剪切尚需要一个3’核酸内切酶,这可将tRNA前体3’端的一段核苷酸序列切下来。
此外RNaseD是tRNA3’端成熟酶。
近年来的研究标明大肠杆菌RNaseP是一种非常特殊的酶分子,它是由RNA和蛋白质组成,最近发现RNAaseP分子中的RNA部分在某些条件下,可以单独地催化tRNA前体的加工成熟,这个发现和四膜虫tRNA能自我拼接被认为是近十年来生化领域内最令人鼓舞的发现之一。
说明RNA分子确具有酶的催化活性。
经过剪切后的tRNA分子还要在拼接酶作用下,将成熟tRNA分子所需的片段拼起来。
②成熟的tRNA分子中有许多的稀有碱基,因此tRNA在甲基转移酶催化下,某些嘌呤生成甲基嘌呤如A→mA,G→mA。
有些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶。
尿嘧啶核苷转变不假尿嘧啶核苷。
某些腺苷酸脱氨基为成为次黄嘌呤核苷酸(Ⅰ)
③3’末端加上CCA:
在核苷酸转移酶作用下,3’末端除去个别碱基后,换上tRNA分子统一的CCAOH末端,完成tRNA分子中的氨基酸臂结构。
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