生物化学实验9modifyWord文件下载.docx
- 文档编号:4454588
- 上传时间:2023-05-03
- 格式:DOCX
- 页数:36
- 大小:199.80KB
生物化学实验9modifyWord文件下载.docx
《生物化学实验9modifyWord文件下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《生物化学实验9modifyWord文件下载.docx(36页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
硫酸铜不能多加,否则将产生蓝色Cu(OH)2,防碍此颜色反应的观察。
3、黄蛋白反应
向一支盛有0.5ml5%蛋白质溶液的试管中加入浓硝酸4滴,并加热,观察有何现象出现?
然后再加入10%NaOH1ml,观察有何变化?
4、蛋白质中硫的鉴定
取头发几根或指甲少许,并加10%NaOH2ml于试管内,煮沸2分钟,冷却后加入3~4滴2%Pb(Ac)2溶液,观察其现象,说明头发或指甲中有什么样的结构存在。
5、盐析作用
取5%蛋白质溶液1ml于试管中,加入饱和硫酸铵溶液2ml,有何现象产生?
再向试管中加入6ml左右的蒸馏水,振荡后又有何变化?
6、有机溶剂的沉淀作用
取5%蛋白质溶液1ml于试管中,再加95%乙醇2ml,充分混合,观察有无沉淀析出。
7、生物碱试剂的沉淀作用
取2支试管,各加5%蛋白质溶液1ml,分别滴加10%鞣酸溶液5滴,饱和苦味酸5滴,有何现象产生?
8、重金属离子的沉淀作用
取2支试管,各加5%蛋白质溶液1ml,分别加入2%Pb(Ac)2,1%CuSO4各5滴,观察现象。
五、思考题
1、蛋白质和氨基酸共同具有哪种颜色反应?
为什么?
2、哪种颜色反应可以用来检验蛋白质是否完全水解?
实验二蛋白质的两性反应
了解蛋白质的两性性质。
蛋白质是由氨基酸所组成的,虽然绝大多数氨基酸的氨基与羧基已结合成为肽键,但是,总有一定数量的自由氨基与自由羧基,以及酚基、巯基、胍基和咪唑基等酸碱基团。
因此,蛋白质和氨基酸一样,是两性电解质,具有两性反应。
调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时,蛋白质分子所带的正电荷与负电荷相等,以兼性离子状态
(一)试剂:
1、0.5%酪蛋白溶液(以0.01mol·
L-1NaOH作溶剂)
2、0.04%溴甲酚绿指示剂,变色范围为pH3.8~5.4,酸式为黄色,碱式为兰色,中间式为绿色。
3、0.02mol·
L-1盐酸
4、0.02mol·
L-1NaOH溶液。
(二)器材:
1、试管
2、试管架
3、移液管1ml2ml5ml
1、取一支试管,加0.5%酪蛋白溶液1ml和0.04%溴甲酚绿指示剂5滴,混匀,溶液呈什么颜色?
2、用细滴管慢慢加入0.02mol·
L-1盐酸,随滴随摇,至有明显的大量沉淀产生时,这时溶液的pH值接近于酪蛋白的等电点,观察溶液颜色的变化。
3、继续滴加0.02mol·
L-1盐酸,有什么变化?
溶液颜色有什么变化?
说明什么?
4、再滴入0.02mol·
L-1的氢氧化钠将第3步加的盐酸中和时,为什么又会出现沉淀?
继续滴入0.02mol·
L-1氢氧化钠,又有什么变化?
溶液颜色又怎样变化?
说明了什么?
1、溴甲酚绿指示剂在实验中起什么作用?
实验三蛋白质的等电点测定
初步学会测定蛋白质等电点的方法。
COO-
NH
P
存在。
在电场中,该蛋白质既不向阴极移动,也不向阳极移动,此时溶液的pH值,称为该蛋白质的等电点(以pI表示)。
在等电点时,蛋白质溶解度最小(为什么?
)容易沉淀析出。
若配制体积相等的一系列不同pH值的缓冲溶液,在其中各加入等量的某蛋白质溶液,混匀后静置一段时间,观察并比较各管的混浊度,可知最混浊的那个试管中溶液pH即是该蛋白质的等电点。
1、0.5%酪蛋白的醋酸钠溶液,取纯酪蛋白0.25g置于50ml容量瓶中,加水约20ml及1mol·
L-1NaOH5ml,待酪蛋白完全溶解后,加入1mol·
L-1醋酸5ml,用水稀释到50ml,混匀,或将酪蛋白溶于0.1mol·
L-1NaAc溶液中。
2、0.10mol·
L-1HAc
3、0.01mol·
4、1.00mol·
1、取直径相似的干燥试管5支,按下表准确加入各种试剂:
试管编号
1
3
4
5
加入试剂
(ml)
蒸馏水
1.00mol·
0.10mol·
0.01mol·
酪蛋白醋酸钠溶液
2.4
1.6
1.0
-
4.0
3.0
1.5
2.5
3.4
0.6
溶液最终pH
3.5
4.1
4.7
5.3
5.9
混浊度
加毕摇匀,即配成不同氢离子浓度的缓冲液,各管内溶液的pH如表中所示。
静置约30分钟,观察各试管溶液的混浊度,以—、+、++、+++表示之。
注:
该实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确,实验中应严格按照定量分析的要求和操作进行。
根据实验观察结果,指出酪蛋白达到其等电点时溶液的pH值,并说明其原因。
1、在蛋白质两性反应及酪蛋白等电点测定这两个实验中所用的酪蛋白溶液是不同的,它们有何区别?
能否将它们对调使用?
实验四葡聚糖凝胶色谱
一、目的要求
掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶色谱的原理和方法。
凝胶色谱是以被分离物质的分子量差异为基础的一种色谱方法。
这种色谱的固定相是具有多孔、网状结构的颗粒状凝胶所吸附的液体,不同型号的色谱凝胶,其网孔的大小是不同的。
能分离的物质量范围也就不同,色谱时一般根据欲分离物质的大小及工作目的来选择一定孔径的凝胶装柱,于柱上端加待分离的混合物,然后用蒸馏水或其他稀溶液(即流动相,也叫洗脱剂)洗柱时,由于各物质分子大小和形状不一而得到分离,大分子物质先随洗脱剂流出柱,小分子物质最后流出色谱柱。
关于凝胶色谱的机理有许多假说和理论,目前为人们普通接受的理论是分子筛效应,如下图所示:
凝胶色谱的简单原理
甲:
待分离的混合液上柱,于色谱床表面,(○代表大分子物质,·
代表小分子物质,
代表凝胶。
)
乙:
当样品随溶剂沿色谱床往下移动时,大分子物质因位阻效应,随溶剂流动,而小分子物质渗入凝胶颗粒内。
丙:
大分子物质行程短,已流出色谱床,小分子物质尚在行进中。
由上图可以清楚地看出,分子量大的物质不能进入凝胶的网孔;
完全被排阻在凝胶颗粒之外而随洗脱液在凝胶颗粒之间流动,因此,流程短,移动速度快,最先流出色谱柱,分子量小的物质可自由进入网孔而渗入到凝胶颗粒内部,因此,流程长,移动速度慢,最后多色谱柱中流出,而分子大小介于上述二者之间的各物质都能不同程度地渗入凝胶颗粒,因此,它们在二者之间依次流出色谱法,由此就达到了分离的目的。
由于这一过程可以把大小分子分开,犹如过滤、过筛。
所以凝胶色谱又叫凝胶过滤,分子筛色谱。
由于物质在分离过程中的阻滞减速现象,凝胶色谱也称阻滞扩散色谱,排阻色谱等。
目前常用的凝胶有葡聚糖凝胶(商品名称为Sephadex)、聚丙烯酰胶凝胶(商品名称为Biogel)以及琼脂糖凝胶(商品名称为Sepharose)。
此外尚有这些凝胶的各类衍生物。
葡聚糖凝胶是色谱凝胶中应用最广泛的一种,是由一定平均分子量的葡聚糖(以α-1,6糖苷键连接的右旋糖苷)与甘油基以醚桥()
形成相互交联形成三维空间的网状结构,成为水不溶性物质,交联度的大小可在合成时控制交联剂(一般为环氧氯丙烷)和葡聚糖的比例及反应条件来掌握,交联度大的则“网眼”小,反之,则“网眼大”。
“网眼”的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。
葡聚糖凝胶的基本结构
葡聚糖凝胶的理化性质可概括为五性,即多孔性、亲水性、不溶性、稳定性和电中性。
目前市售的葡聚糖凝胶都是珠状的,不同型号的葡聚糖凝胶用G表示(如G-25、G-200等),G后面的数字为凝胶的吸水量(毫升水/克干胶乘以10得到的数),如G-25即表示此型号凝胶的吸水量是2.5毫升/克干胶。
即标号=持水量×
10,标号大说明交联度小、吸水量大,也就是说凝胶的“网眼”大。
凝胶色谱可分离的分子量范围从几百到数十万不等。
进行工作时一般根据欲分离物质的分子大小及工作目的来选择合适的葡聚糖凝胶装色谱柱。
三、实验器材与试剂
1.实验器材
色谱柱(1.2×
20cm)(×
1),吸量管1ml(×
1),刻度离心管(×
4),小试管(1×
7.5cm)(×
20),烧杯50毫升(×
1)、100毫升(×
2),灯泡瓶(×
1),滴管,葡聚糖凝胶G-50(SephadexG-50)。
2.试剂
兰色葡聚糖2000(分子量200万以上,兰色),铬酸钾(分子量194,黄色),洗脱剂为蒸馏水。
四、方法与步骤
1.凝胶溶胀
称取3克SephadexG-50加入到50毫升蒸馏水内,室温溶胀6小时或沸水溶胀2小时,一般常用后一种方法。
沸水浴溶胀不但节约时间,而且可以消毒,还能除去凝胶中污染的细胞和排除凝胶内的气泡,溶胀应该彻底,否则会影响色谱的均匀性,凝胶溶胀后用倾泌法除去凝胶上层水及细小颗粒,反复以蒸馏水洗涤直至无细小颗粒止(细小颗粒的存在会影响色谱的流速),然后将浸泡后的凝胶抽干,用10倍量的洗脱剂平衡约一个小时,再放在灯泡瓶内抽气,除去气泡,处理好的凝胶保存在洗脱剂内备用。
本实验采用已经处理好的SephadexG-50。
2.装柱
将洗净的色谱柱垂直装好,自柱底端出口处向管内通入洗脱剂,以去除管内和砂芯底部的气泡,待气泡排除后,使洗脱剂留在柱内3~5cm高即行关闭下部出口。
将处理好的凝胶在烧杯内用一倍的洗脱剂调成悬浮液,自柱顶部沿着这内壁缓缓加入柱中,待底部凝胶沉积至1~2cm高时,缓缓打开底部出口,调节流速0.3毫升/分。
随之继续添加凝胶悬浮液直至凝胶在柱内沉积至约15cm高度为止,在装柱过程中应避免柱表面的液体流干,也就是说柱床表面应始终保持有洗脱剂,装好的柱体应该没有纹路、没有节痕、没有气泡和柱顶表面平整而均匀方可投入使用,否则要重装。
3.加样
(1)样液的配制
称取兰色葡聚糖20002.5毫克,铬酸钾1.5毫克,溶于0.5毫升洗脱剂中。
(2)加样
用滴管吸去凝胶床顶部大部分液体,稍稍打开出口使洗脱剂恰流到与床表面一致(不能露出床面),关闭出口,小心地用吸量管把0.4ml上述混合样品贴近床面沿着柱内壁轻轻地慢慢加入。
注意,切勿搅动床表面!
打开出口,使样品液渗入凝胶内(不能使床面露出),同时开始收集计量,然后用0.5~1毫升洗脱剂沿柱内壁洗凝胶床面二次,尽量做到不稀释样品液同时又使样品液均匀渗入凝胶,当液面至床表面时,小心加入洗脱剂2~3cm高。
4.洗脱与收集
调节洗脱液流速0.3毫升/分。
仔细观察样品在色谱柱内的分离现象,收集并量取洗脱流出液体积,当达到4毫升时,开始用刻度离心管每隔1.5毫升收集一管,目测并以-、++、+++符号记录两种物质洗脱流出液的颜色深浅程度。
5.绘制洗脱曲线
以洗脱管数为横坐标,洗脱液的颜色强度(-、+、++、+++)为纵坐标(相对指示出洗脱流出液内物质浓度变化),在坐标纸上作图,即得洗脱曲线。
洗脱曲线
1.什么叫“分子筛”效应,本实验的分子筛作用与盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子筛作用有什么不同?
2.葡聚糖凝胶标号大小与凝胶交联度大小、吸水量大小、凝胶的“网眼”大小及适宜分离的物质分子量大小有何关系?
3.凝胶装柱时,水和胶的比例要适当,加胶最好一次完成。
若几次加胶可能会产生不良的影响,如何避免这一不良影响?
实验五 蛋白质浓度测定
考马斯亮蓝显色法
一、目的和要求
1、学习和掌握考马斯亮蓝显色法测定蛋白质浓度的原理和操作方法。
2、进一步熟悉和掌握721分光光度计使用方法。
二、基本原理
考马斯亮蓝显色法是Bradford于1976年建立起来的一种蛋白质浓度的测定方法。
因此又称为Bradford方法,该方法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250定量结合。
当考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后,其对可见光的最大吸收峰从465nm变为595nm。
在考马斯亮蓝G-250过量且浓度恒定的情况下,当溶液中的蛋白质浓度不同时,就会有不同量的考马斯亮蓝G-250从吸收峰为465nm的形式转变成吸收峰为595nm的形式,而且这种转变有一定的数量关系。
一般情况,当溶液中的蛋白质浓度增加时,显色液在595nm处的吸光度基本能保持线性增加,因此可以用考马斯亮蓝G-250显色法来测定溶液中蛋白质的含量。
长期以来,人们一直习惯用Lowry法来测定蛋白质浓度,但近年来,越来越多的人开始用考马斯亮蓝G-250显色法来测定蛋白质浓度,与Lowry法相比,该方法具有下列优点:
①方法简单,只需一种显色液。
②反应迅速,只需一步反应,显色可在5min之内完成。
③干扰少,许多被认为对Lorwy法有干扰的物质(如糖、缓冲液、还原剂和络合剂)不影响该方法。
尽管该方法有如此多的优点,但在实际应用中也有其缺点,如线性关系不很好,因此使用该方法测定蛋白质浓度时应特别注意。
(一)、实验器材
1、试管:
15×
1.5cm13支
2、移液管:
0.5ml1支1ml3支5ml1支
3、721分光光度计
(二)、试剂及其配制
1、标准蛋白质溶液:
牛血清白蛋白溶解于蒸馏水,配成浓度为250mg/L。
2、考马斯亮蓝显色液的配制:
0.12克考马斯亮蓝G-250溶解在100ml95%的乙醇中,加少量蒸馏水后加100ml85%的磷酸,然后用蒸馏水定容至1升,即为显色液。
1、标准曲线的制作
取6支洁净干燥的试管按下表顺加入试剂
管号
加入H2O的量(ml)
加入标准蛋白溶液的量(ml)
试管中的蛋白质总量(μg)
考马斯亮蓝显色液(ml)
Abs595nm
0.8
0.2
50
0.4
100
150
200
6
250
所有试剂加入后混匀,可立即在721分光光度计上测定595nm处的吸光度(Abs595nm),以蛋白质浓度为横座标,Abs595nm为纵座标作图制作标准曲线。
2、样品测定
在做标准曲线的同时,取另一支试管加入1ml待测样品,然后加入5ml考马斯亮蓝显色液,混匀后测定Abs595nm。
由Abs595nm值从标准曲线中查出待测样品中的蛋白质浓度。
为了提高待测样品结果的准确性,可同时对待测样品做一重复。
实验六 液化型淀粉酶活力的测定
熟悉并掌握测定液化型淀粉酶活力的原理和方法。
液化型淀粉酶(即α-淀粉酶)能催化淀粉水解成小分子的糊精和少量麦芽糖和葡萄糖。
本实验以碘的呈色来测定水解作用的速度,从而衡量酶活力的大小。
三、试剂与器材
1、原碘液:
称取碘液11克,碘化钾22克,加入少量水,使碘完全溶解后,定容至500毫升,藏于棕色瓶内。
2、稀碘液:
取原碘2ml,加碘化钾20克,用水溶解并定容至500ml,藏于棕色瓶中。
3、2%可溶性淀粉溶液:
精确称取可溶性淀粉2.0克(以绝干计)。
用10ml水调匀,倾入90ml水中,再加热煮沸2-3分钟,使溶液透明为止,冷却后定容至100ml,此溶液需新鲜配制。
4、0.02M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH=6.0):
称取柠檬酸(C6H8O7•2H2O)8.07克,磷酸氢二钠(Na2HO4•12H2O)45.23克,加水溶解至100ml,配制后用pH计校正到pH=6.0.
5、标准“终点色”溶液
(1)精确称取氯化钴(CoCl2•6H2O)40.2439克,重铬酸钾0.4878克,加水溶解并定容至500ml。
(2)0.04%铬黑T溶液:
精确称取铬黑T(C20H12N3NaO7)40mg,加水溶解并定容至100ml。
取
(1)液40ml与
(2)液5.0ml混合,即为标准“终点色”溶液,此液宜冰箱保存,有效期为15天。
1、调色板(白色) 1块
2、试管2.5×
25cm 1支
3、恒温水浴箱 1只
4、烧杯100ml 1只
5、容量瓶 1只
6、漏斗 1只
7、移液管20ml、5ml、0.5ml各1支
四、操作
1、待测酶液的制备
精确称取酶粉1.0000-2.0000克。
加入小烧杯内,先用少量40℃0.02MpH6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液溶解,并用玻棒捣研,将上清液倾入容量瓶内(容量瓶大小根据酶粉活力单位数商定稀释倍数后选择),沉渣部分再加入少量上述缓冲液,如此反复捣研3-4次,最后全部移入容量瓶中,用上述缓冲液定容至刻度,摇匀,用四层纱布(或滤纸)过滤,滤液即为待测之酶液。
如为液体样品,可直接过滤,吸取一定量滤液于容量瓶中,加上述缓冲液稀释到刻度,摇匀,备用。
2、测定
(1)取标准“终点色“溶液2ml,滴于调色板空穴内,作为比较终点颜色的标准。
(2)吸取2%可溶性20ml及pH6.00.2M柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液5ml,置于大试管中,在60℃恒温水浴中预热4-5分钟,然后加入待测之酶液0.5ml,立即记录时间,充分摇匀,定时用滴管从试管中取出反应液约0.5ml,滴于预先盛有稀碘液(约1.5ml)的调色板空穴内,当穴内呈色反应由紫色逐渐变红棕色,直至与标准“终点色“相同是,即为反应终点,并记录时间T(分钟)。
五、计算
在60℃pH6.0的条件下,1小时液化1克可溶性淀粉的酶量为1个酶(活力)单位,酶活力用1克酶粉或1毫升酶液于60℃pH6.0条件下,1小时液化可溶性淀粉的克数也就是酶单位数来表示。
式中:
T为反应时间(分)
60为60分钟
20×
2%为可溶性淀粉的量(克)
n为稀释倍数
0.5为吸取待测酶液的量
六、注意
1、酶反应时间应控制在2-2.5分钟内,否则应改变稀释倍数重新测定。
2、本实验中,吸取2%可溶性淀粉及酶的量必须准确,否则误差较大。
七、思考题
本实验中,为了使测得的酶活力准确,哪些实验数据必须非常准确,为什么?
实验七盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳法
分离血清蛋白质
学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和操作方法,并应用于血清蛋白质的分离。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种区带电泳,该凝胶是由丙烯酰胺单体(简写为Acr)和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺(简写为Bis),在催化剂的作用交联成三维网状结构的凝胶,属含有酰胺基侧链的脂肪大分子化合物。
AcrBis聚丙烯酰胺
常用的催化剂(包括催化剂和加速剂)有两种:
①过硫酸铵一四甲基乙二胺(TEMED)系统称化学聚合;
②核黄素(需光)--TEMED系统称光聚合。
在这二种催化体系中,TEMED起催化加速剂的作用,它可以促使过硫酸铵和核黄素产生游离基,而诱发聚合反应。
采用不同浓度的Acr和Bis,可以得到不同孔径的凝胶,因此可按分离物质的大小,形状来选择凝胶浓度。
凝胶浓度选用表
蛋白质分子量
>104
104~4×
104
4×
104~105
105~5×
105
>5×
选用凝胶浓度(%)
20~30
15~20
10~15
5~10
2~5
一般常采用7.5%聚丙烯酰胺凝胶来分离蛋白质,用2.4%聚丙烯酰胺凝胶来分离核酸。
本实验采用不连续盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳,所谓不连续即电泳系统是由二种以上不同的pH、缓冲液和凝胶孔径组成,多用于分析浓度较稀的样品。
电泳凝胶上层是低浓度大孔胶称为浓缩胶,此种胶的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷一盐酸(简称Tris-HCI缓冲液),pH6.7,下层为小孔径凝胶称为分离胶,它的缓冲液是pH8.9的Tris-HCI,该实验具有很高的分辩力是因为有三种效应:
即浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。
Ⅰ
样品在样品胶内
Ⅲ
样品在小孔径的分离胶内被分离
Ⅱ
样品在浓缩胶内被浓缩
不连续凝胶电泳基本原理示意图
浓缩效应:
样品通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层,甚至有的能浓缩几百倍,为什么样品会在浓缩胶中压挤成层呢?
这是因为样品胶和浓缩胶是用PH6.7的Tris-HCI缓冲液是Ph8.3,因为甘氨酸大,这三种离子带有同性电荷,在一定的电场作用下,它们的泳动率是不一样的,而且它们的有效泳动率是按照下列次序排列的。
即:
mCl-aCI->m蛋a蛋>m甘a甘。
M为电压梯度,a为解离度,ma为有效泳动率。
根据有效泳动率的大小,最大的称为快离子(或先行离子,这里是Cl-),最小的称为慢离子(或随后离子,
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 生物化学 实验 modify