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09工作报告
脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞生物特性的对比
工作报告
脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞体外诱导定向迁移和分化、及相关分子机制的研究
1.项目概述
体外比较脂肪基质干细胞(ADSCs)和骨髓基质干细胞(BMSCs)向受损PC12细胞定向迁移和分化能力的差异,并探讨其可能分子机制。
分别分离培养脂肪组织来源和骨髓组织来源的间充质干细胞(MSC),流式细胞检测两种细胞表面标记。
实验分组包括正常培养的PC12细胞上清液+ADSCs或BMSCs、受损PC12细胞上清液+ADSCs或BMSCs、正常PC12细胞+ADSCs或BMSCs共培养、受损PC12细胞+ADSCs或BMSCs共培养,对照组为单独培养ADSCs或BMSCs细胞。
流式细胞分析趋化因子受体的表达,ELISA分析PC12细胞分泌趋化因子水平,Transwell检测细胞迁移能力,Real-timePCR检测miR-125a-3p的表达水平,westernblot检测干细胞多能性标记Nanog、Oct4、Sox2、神经元特异性标记NSE,以及miR-125a-3p潜在靶基因IGF-2的表达水平,流式细胞分析NSE+细胞百分比。
ADSCs和BMSCs均表达趋化因子受体CXCR6、CXCR1、CCR2、CCR5和CCR7。
受损PC12细胞分泌趋化因子增加,CCL5水平最高。
与受损PC12细胞共培养后,ADSCs和BMSCs迁移能力增强。
各诱导组中,Nanog、Oct4、Sox2表达水平有不同程度的降低,同时miR-125a-3p表达下调,IGF-2表达上调,并出现NSE表达。
其中细胞共培养组Nanog、Oct4、Sox2、miR-125a-3p表达水平显著低于其他实验组,NSE、IGF-2表达水平显著高于其他实验组。
我们的结果提示,受损PC12细胞对于ADSCs和BMSCs具有较强的趋化和诱导分化作用,在受损PC12细胞诱导下miR-125a-3p表达下调,解除了对IGF-2的抑制,这可能是促进两种干细胞发生分化的分子机制之一。
脂肪基质干细胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)和骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalstemcells,BMSCs)是两种在组织修复和再生的研究中应用十分广泛的间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)。
作为成体干细胞,ADSCs和BMSCs具有很多相似的生物学特性,如很强的自我更新能力,具有多向分化潜能,经移植可以治疗某些组织损伤和变性疾病。
ADSCs与BMSCs相比,具有取材方便,损伤小,获得细胞数量多的特点,因此ADSCs是否能够代替BMSCs成为干细胞移植的丰富细胞来源,是目前研究的热点。
细胞归巢和定植对干细胞治疗效果至关重要。
在脑缺血损伤模型中,MSCs能够经静脉到达损伤部位,并修复受损神经细胞。
动物实验表明,通过动脉或静脉注射,干细胞有向受损组织细胞迁移的能力。
在此过程中,趋化因子可能对于干细胞定向迁移具有重要作用。
研究显示,把SDF-1α直接注射到神经损伤部位后,可以趋化MSCs到达颅内,且注射部位可见分化的神经细胞。
因此,明确MSCs定向迁移的分子机制,对于以MSCs为基础的细胞治疗中枢神经系统损伤和变性疾病可能具有重要的指导作用。
研究发现Nanog、Oct4、Sox2参与未分化胚胎干细胞的自我更新过程,维持干细胞的多能性,具有向其他3个胚层细胞分化的能力。
Nanog功能缺失将导致小鼠胚胎干细胞向其他细胞类型分化。
Oct4通常作为一种未分化细胞的标记,其表达水平受到严格调节,对于调节干细胞多能性和早期细胞分化非常关键。
Sox2参与调节胚胎发育并决定细胞命运,通过调节Oct4的表达诱导生成多能干细胞。
目前研究表明,MicroRNAs(miRNAs)能够调节细胞分化,决定细胞命运,但对于miRNAs在间充质干细胞多向分化过程中的作用研究较少。
miR-27通过调节Wnt信号通路促进成骨细胞分化[12],Wnt信号通路诱导miR-29a的转录,使其在成骨细胞分化过程中表达上调[13]。
miR-125a是miRNA家族成员之一,包括两种成熟体形式:
miR-125a-3p和miR-125a-5p。
最近研究表明miR-125a-5p是肺癌的转移抑制因子,但对于miR-125a-3p的报道较少。
迄今为止,ADSCs和BMSCs是否具有相似的向损伤组织细胞的定向迁移能力,以及向损伤神经元分化能力及其分子机制尚无定论。
本研究拟观察体外培养的ADSCs和BMSCs表达几种趋化因子受体的水平,通过细胞迁移实验观察受损PC12细胞分泌的趋化因子,对ADSCs和BMSCs的定向迁移作用,比较不同趋化因子诱导ADSCs和BMSCs向受损PC12细胞迁移能力的差异。
再观察体外培养的ADSCs和BMSCs在诱导分化过程中几种干细胞多能性标记和神经元特异性标记的表达,通过细胞共培养实验观察不同实验组对ADSCs和BMSCs向神经元的诱导分化作用,体外比较两种干细胞分化能力的差异,并观察在此分化过程中miR-125a-3p及其潜在靶基因IGF-2表达水平的变化,探讨其调节ADSCs和BMSCs诱导分化的可能分子机制,为体内移植ADSCs和BMSCs治疗中枢神经系统变性疾病(如AD)提供实验基础。
2.必要性、可行性和重大意义
2.1必要性
神经系统疾病是严重影响人类健康的疾病,国内外人口死亡的前四位原因(心血管病、肿瘤、脑血管病、痴呆)当中,神经系统疾病占据两种(脑血管病和痴呆)。
全球患有神经系统疾病的患者数目众多,仅美国和英国每年的医疗费用就高达约600多亿英镑,约合3000多亿人民币。
我国是世界上人口最多的国家,也是神经系统疾病病人最多的国家。
中枢神经系统的损伤如脑挫裂伤、脑干损伤或脊髓横断性损伤等常常导致灾难性的后果,且近10年其发病率一直居高不下;小儿脑瘫的发病也呈上升趋势,我国每年脑瘫儿的数量以平均44.66万名的速度递增,现有脑瘫患儿超过260万例,而全球以超过1000万例;此外,我国每年因中风而死亡的人数达510万,每年大约有260万人死于心脑血管疾病,每天就是7000多人,每12秒就有1人因心脑血管疾病而死亡。
诸如上述的多种危重疾病对社会、家庭、个人都造成不可估量的损失,而干细胞治疗将给此类的人类许多不治之症患者带来福音,其独特的疗效是目前传统治疗方法及药物所不可比拟的,因此干细胞治疗的应用潜力及社会价值极其巨大。
2.2可行性;
我院为沈阳脑科医院,床位180张,每年收治大约4000余住院患者,其中脑卒中患者占大约80%左右。
技术成熟可行,掌握了细胞培养技术和C6大鼠脑缺血模型制作。
本实验室可完成免疫细胞化学、免疫荧光组织化学、WesternBlot、RT-PCR等实验中应用的研究手段。
实验中所需药品均可从相应公司购得。
已阅读了大量文献,对实验的目的,原理,国内外进展及实验方法有了一定程度的了解,对面临的困难及解决办法有了一定的了解。
实验者学习过细胞培养,免疫组化、WesternBlot、RT-PCR等实验手段。
资金和设备到位,医院自筹5万资金进行实验设备的配套和更新。
-80度的冰箱,PCR仪,电泳仪,离心机等设备到位。
人员配备合理。
参与研究的人员配备合理,有领导人员,有数位博、硕士以及护理人员。
学历较高,可以胜任高精尖的研究工作。
并且青年工作人员占大多数,保证参与研究的时间和精力。
领导重视和支持,由院长、副院长成立的科研单位,提供资金,领导和协调神经实验室和各方面的关系和工作。
保证科研工作的顺利完成。
2.3重大意义
迄今为止,ADSCs和BMSCs是否具有相似的向损伤组织细胞的定向迁移能力,以及向损伤神经元分化能力及其分子机制尚无定论。
本研究拟观察体外培养的ADSCs和BMSCs表达几种趋化因子受体的水平,通过细胞迁移实验观察受损PC12细胞分泌的趋化因子,对ADSCs和BMSCs的定向迁移作用,比较不同趋化因子诱导ADSCs和BMSCs向受损PC12细胞迁移能力的差异。
再观察体外培养的ADSCs和BMSCs在诱导分化过程中几种干细胞多能性标记和神经元特异性标记的表达,通过细胞共培养实验观察不同实验组对ADSCs和BMSCs向神经元的诱导分化作用,体外比较两种干细胞分化能力的差异,并观察在此分化过程中miR-125a-3p及其潜在靶基因IGF-2表达水平的变化,探讨其调节ADSCs和BMSCs诱导分化的可能分子机制,为体内移植ADSCs和BMSCs治疗中枢神经系统变性疾病(如AD)提供实验基础。
3.国内外发展现状及趋势,市场需求分析
为抢占干细胞这一科技制高点,世界各国纷纷投入大量的人力、物力和财力加紧研究开发,并已取得应用性成果。
日本在2000年启动的“千年世纪工程”中,将干细胞工程作为四大重点之一,于第一年度就投入了108亿日元的巨额资金。
英国于2000年第一个将干细胞研究合法化,2005年英财政大臣称将建立全国性干细胞研究网络,以巩固英国在该领域的领先地位,2006年,欧盟议会通过干细胞研究拨款法案,干细胞研究在欧盟从系拥有“合法身份”。
此外,德国、新加坡等多个国家也把干细胞研究作为生物高技术研究的重点,而且投资建立了大批专业化干细胞工程技术研究中心。
瑞典、巴西也于2005年通过立法支持干细胞研究。
最新数据显示,目前全球大约有600项临床实验均涉及干细胞治疗。
美国FDA目前已批准多项干细胞临床应用研究计划,涉及的疾病包括退行性神经病变如帕金森氏病、缺血性心脏病、小儿脑部损伤、Crohn氏病,急性移植物抗宿主排斥反应(GVHD),Batten氏病等。
4.基础和条件,与项目相关的前期工作情况
4.1基础和条件
4.1.1本人一直致力于脑血管病、阿尔海默氏病的研究工作。
并且对脑血管病的干细胞治疗有所研究,在国家级杂志发表相关论文,两篇论文在国际会议发表;
4.1.2作者一直追踪脑血管病、阿尔海默氏病的诊断和治疗的最新研究进展,并且对脂肪基质细胞、骨髓基质细胞研究多年,对干细胞临床应用参加多次相关的研究学习。
4.1.3有有攻读博士基础实验经验,有相关合作的神经分子生物学实验室,有PCR仪,高速离心机,电泳仪等相关仪器来完成DNA的储存,提取,扩增以及测序等工作。
4.2相关前期工作情况。
近年来,与科室人员密切配合,开展了《脂肪基质干细胞经侧脑室立体定向移植治疗脑缺血的研究》、积极参与《骨髓间质干细胞对多巴胺能神经元的保护作用》、《沈阳地区脑卒中患者ALOX5AP(5-脂氧合酶激活蛋白)基因多态性分析》、《罂粟碱选择性开放血脑屏障后增强BFGF对脑缺血的保护作用》等课题研究。
《脂肪基质干细胞经侧脑室立体定向移植治疗脑缺血的研究》获沈阳市科技进步三等奖。
作者主攻方向干细胞的基础研究于临床应用;《Transwellco-culturesystemofADSCsandAβ1-40injuredPC12invitro》及《IMPROVEMENTOFCEREBRALISCHEMIABYLATERALVENTRICLEINJECTIONOFDIFFERENTIATEDADIPOSESTEMCELLS》;在2005年及2007年美国神经科学年会海报区展示;撰写论文数十篇,其中《骨髓基质干细胞与受损PC12细胞的共育体系减少PC12的凋亡》在《中华神经科杂志》发表,《脂肪组织源性基质细胞经侧脑室立体定向移植治疗大鼠局灶性脑缺血的实验研究》等文章在《中华神经医学杂志》上发表,《Transwell培养体系中受损PC12细胞促进骨髓间质干细胞向神经元样细胞的转分化(英文) 》、《人脂肪组织源性干细胞分化为神经元样细胞的能力及可塑性 》在《中国组织工程研究与临床康复》等刊物上发表。
5.总体目标、考核指标、主要研究内容、实施进度安排
5.1总体目标;本研究拟观察体外培养的ADSCs和BMSCs表达几种趋化因子受体的水平,通过细胞迁移实验观察受损PC12细胞分泌的趋化因子,对ADSCs和BMSCs的定向迁移作用,比较不同趋化因子诱导ADSCs和BMSCs向受损PC12细胞迁移能力的差异。
再观察体外培养的ADSCs和BMSCs在诱导分化过程中几种干细胞多能性标记和神经元特异性标记的表达,通过细胞共培养实验观察不同实验组对ADSCs和BMSCs向神经元的诱导分化作用,体外比较两种干细胞分化能力的差异,并观察在此分化过程中miR-125a-3p及其潜在靶基因IGF-2表达水平的变化,探讨其调节ADSCs和BMSCs诱导分化的可能分子机制。
5.2考核指标;
5.2.1本研究拟观察体外培养的ADSCs和BMSCs表达几种趋化因子受体的水平,通过细胞迁移实验观察受损PC12细胞分泌的趋化因子,对ADSCs和BMSCs的定向迁移作用,比较不同趋化因子诱导ADSCs和BMSCs向受损PC12细胞迁移能力的差异。
5.2.2观察体外培养的ADSCs和BMSCs在诱导分化过程中几种干细胞多能性标记和神经元特异性标记的表达,通过细胞共培养实验观察不同实验组对ADSCs和BMSCs向神经元的诱导分化作用,体外比较两种干细胞分化能力的差异,并观察在此分化过程中miR-125a-3p及其潜在靶基因IGF-2表达水平的变化,探讨其调节ADSCs和BMSCs诱导分化的可能分子机制。
项目实施年限:
2009.1-2011.12
年度计划安排:
2009年1-6月检索文献、完善实验设计
2009年7-12月细胞模型、预实验
2010年1-6月细胞培养、细胞模型
2010年7-12月检测生化指标
2011年1月-6月整合数据
2011年7月-12月统计学分析、发表论文、结题
完成时间:
2011年6月
6.技术创新点、关键技术内容
6.1主要技术创新点;
ADSCs和BMSCs是否具有相似的向损伤组织细胞的定向迁移能力,以及向损伤神经元分化能力及其分子机制尚无定论。
6.2研究的关键技术内容
比较不同趋化因子诱导ADSCs和BMSCs向受损PC12细胞迁移能力的差异。
体外比较两种干细胞分化能力的差异,并观察在此分化过程中miR-125a-3p及其潜在靶基因IGF-2表达水平的变化,探讨其调节ADSCs和BMSCs诱导分化的可能分子机制
7.实施的技术路线、工作路线
通过ELISA方法发现受损PC12细胞能够分泌趋化因子,又通过流式细胞方法检测到ADSCs和BMSCs表达相应的趋化因子受体,再通过Transwell细胞迁移实验证实ADSCs和BMSCs具有向受损PC12细胞的定向迁移能力,通过westernblot方法检测各实验组诱导下,ADSCs和BMSCs中干细胞多能性标记Nanog、Oct4、Sox2和神经元特异性标记NSE的表达水平的改变,验证各实验组对ADSCs和BMSCs不同程度的诱导分化作用;通过westernblot方法检测各实验组诱导下,ADSCs和BMSCs中IGF-2表达水平的改变,探讨IGF-2在ADSCs和BMSCs向损伤神经元分化过程中的作用
8.关联行动
8.1基本建设、技术改造、技术引进、国际合作等情况;
我院神经内外科系辽宁省一级重点科系,由市政府批准为沈阳脑科医院(脑病研究所),床位数180张居东北之首,由主任医师11名,副主任医师16名和数十名主治医师及部分出国留学归国人员组成,床位利用率为100%以上,近12年来,有十几名研究生在我科实验室完成课题,并答辩毕业。
我科有专门的神经生化室、细胞培养实验室和动物实验室。
有主管技师3名进行实验。
科内有三名博士研究生,均从事干细胞研究。
曾获沈阳市政府和沈阳市卫生局颁发的沈阳市科技进步奖、科技成果奖10项,在国内外学术期刊上发表研究论文近80篇。
8.2组织管理措施;
我院由院长、副院长、科室负责人亲自挂帅责成负责科研同志与各协作单位组成科研小组,以资源共享为基础,协调各科室及协作单位人员和设备;神经基础实验室已初具规模,核心设备即将全面启用,我科负责科研工作同志按照分工定期按计划完成实验负责人。
8.3其它必要的支撑和配套条件情况。
合理搭配的人员,实验所须的化学仪器和离心机,-80度冰箱,以及PCR仪,电泳仪等。
9.资金预算
9.1总投资预算;
医院自筹资金5万,市科委科技三项基金申请10万。
其中三项费用为实验能源材料费用(8.5万)样本采集费、免疫试剂盒、PCR扩增等,资料印刷0.5万,差旅费0.5万,鉴定验收0.5万;自筹资金作为补充费用。
9.2资金筹措及来源渠道。
医院自筹5万,申请基金10万。
10.效益情况
10.1成果;
通过westernblot方法检测各实验组诱导下,ADSCs和BMSCs中干细胞多能性标记Nanog、Oct4、Sox2和神经元特异性标记NSE的表达水平的改变,验证各实验组对ADSCs和BMSCs不同程度的诱导分化作用。
结果显示,单独培养的ADSCs和BMSCs表达较高水平的Nanog、Oct4、Sox2,不表达神经元特异性标记NSE,表明在未受到各实验组诱导的情况下,ADSCs和BMSCs保持其干细胞多能性,而在受损PC12细胞及其上清作用下表达NSE,开始向神经元分化。
和BMSCs相比,与受损PC12细胞共培养后,ADSCs显示出更强的分化能力,NSE+细胞百分比更高,提示ADSCs移植用于治疗神经变性疾病的效果可能优于BMSCs。
通过westernblot方法检测各实验组诱导下,ADSCs和BMSCs中IGF-2表达水平的改变,结果表明,单独培养的ADSCs和BMSCs中,miR-125a-3p表达水平较高,IGF-2表达水平较低。
随着ADSCs和BMSCs向神经元分化,miR-125a-3p表达下调,IGF-2表达上调,这提示我们miR-125a-3p可能通过抑制IGF-2mRNA的表达维持干细胞自我更新,在损伤神经元诱导下miR-125a-3p表达下调,解除了对IGF-2的抑制,从而促进两种干细胞发生分化。
但miR-125a-3p作用于IGF-2mRNA的具体机制仍有待于进一步深入研究。
10.2经济、社会、环境效益。
神经系统疾病是严重影响人类健康的疾病,国内外人口死亡的前四位原因(心血管病、肿瘤、脑血管病、痴呆)当中,神经系统疾病占据两种(脑血管病和痴呆)。
全球患有神经系统疾病的患者数目众多,仅美国和英国每年的医疗费用就高达约600多亿英镑,约合3000多亿人民币。
我国是世界上人口最多的国家,也是神经系统疾病病人最多的国家。
干细胞研究的突破将使干细胞治疗成为防治占人口总死亡率60%以上的危重病的主要手段,患者的需求迫切,需求量大。
11.风险分析,含技术、市场的风险分析等。
本项目存在临床推广及和资金不足的问题。
加强实验技术的训练和院领导的支持、国家相关法规完善能解决这些问题。
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