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1.1核昔类:
研究人员已从冬虫夏草中分离出3一去氧腺昔(虫草素)、尿吻咤、次黄嚎吟、尿昔、腺喋吟、肌昔、鸟朴、腺昔等核昔类成分,其中虫草素和腺昔是虫草主要活性成分。
核昔类化合物核昔类物质(腺昔、尿昔、鸟昔伪冬虫夏草有效成分之一,尤以腺营具有明显的药理作用[1]。
1951年,由加拿大学者cunningham等从虫草的培养物中分离得到冬虫夏草素(cordycepin)。
国内学者吕瑞绵等从西藏产冬虫夏草中分离得到尿嚓咤、腺嚎吟、腺嚓岭核什。
徐文豪等报道,水溶性核昔类成分主要集中在子座部分,虫体含量甚低。
虫草素是一种广谱抗菌素。
20世纪90年代解军等引首次用高效液相色谱法定量测定了冬虫夏草中虫草素的含量,这也是国内外首次直接定量测定冬虫夏草中虫草素含量。
腺昔含量日前是评价冬虫夏草内在质量的主要指标,《中华人民共和国药典》年版一部把腺昔定为冬虫夏草的含量测定项目,规定冬虫夏草含腺昔不得少于0.010%。
李绍平等[2]用高效毛细管电泳法测定天然和人工冬虫夏草中核昔类成分含量,结果显示人工虫草核昔含量明显高于天然虫草新采集的天然冬虫夏草核昔类成分含量极低,而采集日久者核昔类成分含量较高。
1.2氨基酸:
我国学者报道冬虫夏草含有蛋白质20.06%-26.40%,由天门冬、苏、丝、谷、脯、甘、撷、蛋、亮、异亮、酪、苯丙、赖、组、精、胧、半胧、色氨酸组成,其中包括了8种人体必需氨基酸。
天然冬虫夏草以谷氨酸、色氨酸及酪氨酸为主。
人工虫草菌丝粉含粗蛋白约35%,不仅含冬虫夏草中18种氨基酸,而且人体必需氨基酸的含量均高于天然冬虫夏草}刀。
冬虫夏草在临床上的补益、辅助治疗消化系统及神经系统疾病,抑制病菌及增强免疫功能等作用,可能与其富含上述氨基酸有必然联系。
1.3D一甘露醇:
前已从冬虫夏草中分离出甘露醇单体,并通过物理和化学反应鉴定其结构为D一甘露醇。
汪宝琪等用高碘酸钾一联苯胺显色,采用薄层扫描法,测得西藏产冬虫夏草中D-甘露醇的含量为8.4%。
冬虫夏草的产地、种类、测定方法的不同,对甘露醇含量报道的差异较大,多数报道为5%一8%。
王化远等对不同生长期虫草子座、虫体中甘露醇的含量比较发现,子座中甘露醇的含量不高于7%,虫体中甘露醇的含量均高于7%,且随着子座的发育,甘露醇的含量逐渐增高。
此外,杨跃熊等还测定了几个冬虫夏草主产地中分属不同种寄主昆虫的冬虫夏草中甘露醇的含量,研究结果表明,冬虫夏草中甘露醇的含量主要与其产地、寄主及生长期等因素有关。
1.4幽醇类:
冬虫夏草子座、虫体中均含有街醇及其衍生物,其中麦角幽醇是真菌类的特征肖醇,在冬虫夏草中含量相对稳定,通常将麦角街醇作为质量控制指标之一。
李绍平等[3]对不同来源的天然与人工冬虫夏草中游离麦角街醇含量进行比较,表明不同来源的天然冬虫夏草中游离麦角街醇含量差异显著,但均明显高于人工虫草菌丝。
1.5无机元素:
孟庆繁等[4]对人工培养蛹虫草与青海产野生冬虫夏草的氨基酸含量进行测定,结果表明:
野生冬虫夏草中所含有的各种氨基酸,在人工培养虫草的子实体及菌丝体中都存在,且后者的精氨酸及脯氨酸含量明显高于野生冬虫夏草。
冬虫夏草微量元素研究报道较多,但种类和含量有差异,目前报道的微量元素有30余种,仲伟鉴等[5]用PS一6电感祸合等离子体发射光谱仪测定冬虫夏草及人工虫草菌丝体无机元素含量,其中P、K、Mg、Fe、Ca的含量较高,As、Cd、Sb、Hg的含量较低,另外还有Y、Yb、R、R玩Br。
有人推测冬虫夏草的抗癌作用与含叭C。
、Fe、Cu有关,也有报道冬虫夏草直接抗癌作用不强,但它能增强环磷酸胺、62琉基喋吟作用,这种协同增强抗癌作用是否与冬虫夏草含有多种微量元素有关,有待于进一步探讨。
1.6多糖成分:
虫草生长中,能产生大量多糖。
将冬虫夏草用盐酸水解,NaoH中和,Et0H沉淀蛋白,标准裴林试剂滴定,测得粗糖为23.87%。
白云娥等[61用硫酸一葱酮比色法测定了粗糖中含糖为42.0%。
1.7维生素类:
冬虫夏草含有vit.A,Vit.E,Vit.BI,Vit.BZ,VitB12和Vit£多种维生素,Vit.B12:
2.6一4.4g/kg一Vit,Bl:
401-635mg/kg一l、Vit.E:
223一3Olmg/·
kg]。
1.8其它成分:
冬虫夏草中还含有4种烷烃、1个三烷基取代苯酚、1个烯醇和1个烯醛、5种多胺类成分,以及12种有机酸。
1947年汤腾汉分析冬虫夏草含粗纤维素18.53%,灰分4.1%,水分10.84%。
另外,有报道冬虫夏草含有单质硫和硫磺圈、磷脂酞胆碱。
2.药理作用
2.1冬虫夏草对免疫系统的影响
2.1.1对单核一巨噬细胞系统的影响:
单核一巨噬细胞属于机体的非特异性免疫系统,研究认为虫草对该系统有广泛的激活作用:
可使腹腔粘附细胞、脾脏巨噬细胞、肝脏枯否细胞体积增大、胞浆增多、核质疏松,细胞内酸性磷酸酶活性增强而呈激活状态,可明显提高血浆碳清除率和肝、脾吞噬指数。
2.1.2对NK(自然杀伤细胞)和IAK〔淋巴因子活化的杀伤细胞)细胞活性的影响:
NK、LAK在抗病毒感染中起重要作用,在抗肿瘤机制中大量的DZ甘露醇糖及多糖类物质是一种非特异性免疫增强及调节剂,可激活机体的免疫活性细胞,尤其是T淋巴细胞、淋巴因子及单核一巨噬细胞系统,从而攻击癌细胞,发挥其抗肿瘤作用。
2.1.3用冬虫夏草制剂给小鼠灌服、能明显提高机体单核一巨噬细胞系统的吞噬功能,吞噬指数及吞噬百分率均明显提高,而且,巨噬细胞内酸性磷酸酶的活性亦明显增高,进一步证实虫草能使小鼠巨噬细胞内溶酶体的数量增加,并使细胞处于激活状态。
虫草具有对抗硫哇缥吟(一种免疫抑制剂)的作用,呈现非常明显的保护T细胞的功效。
还能增强肝枯否氏细胞的吞噬能力及促进脾巨噬细胞的增殖。
经大量临床实践,皆谓冬虫夏草有“益肾”之功。
上海中医学院龙华医院陈以平等报道,用冬虫夏草治疗慢性肾功能衰竭患者,取得较好疗效。
祖国医学中所称的“’肾”,与现代医学的机休免疫功能状态是紧密相关的。
凡机体免疫功能低下,均有“肾虚”,尤其“肾阳虚”,的关系最为密切。
冬虫夏草的“益肾”作用,可能即为现代医学的提高机体免疫功能,而对单核巨噬细胞的吞曦功能的加强,可能为其重要的药理学基础之一。
冬虫夏草水解产物含6种必需氨基酸,而对肾衰病人补充必需氨墓酸是有益的,使其内环境由不平衡达到平衡,从而改善患者的健康状况。
虫草还能加快小鼠机体对其血中胶体炭粒的清除速度。
2.1.4能调节体液免疫功能:
可对抗由氢化考的松及环磷酞胺所致的体液免疫功能低下,提高小鼠血清溶血素水平及脾细胞的免疫溶血活性,而对正常小鼠体液免疫无影响。
2.1.5对细胞免疫的调节作用:
虫草对DNCB所致的小鼠迟发性过敏反应有双向作用:
对家兔血淋巴细胞转化有促进作用。
有实验证明,虫草制剂尚具有抑制抗体形成细胞的作用,显示既有增强细胞免疫的功能,又有抑制体液免疫的作用,因而它具有调节细胞和体液免疫的功效,这为临床上应用虫草制剂治疗某些免疫功能紊乱的疾病,提供了依据。
2.1.6对免疫器官的影响:
通过促进脾脏DNA的生物合成,增加核酸与蛋白质的含量,促进脾淋巴细胞的增殖而实现,皮下及腹腔注射能显著增加小鼠的脾脏重量及加速脾脏核酸和蛋白质更新的速度。
免疫器官脾脏的RNA、DNA及蛋白质等成分明显增加,且能显著提高小鼠琳巴细胞E玫瑰花结形成的百分率。
给小鼠灌服冬虫夏草混悬液,能明显增加阳虚小鼠胸腺和脾脏的重量,可见,虫草能增强机体的免疫和抗病能力而起到滋补作用。
虫草多糖对网状内皮系统及腹腔巨曦细胞的吞曦功能有明显的激活作用,能促进淋巴细胞的转化,使血清l舀及血浆皮质酮升高,能使脾脏朋显增重及脾中浆细胞明显增生,并能对抗考的松及环磷酞胺所致的脾脏重量及白细胞下降,特别是能对抗考的松所致腹腔巨噬细胞功能的降低和血浆皮质酮的抑制,而不降低考的松的抗炎作用。
这对目前探寻减少皮质激素对免疫功能降低及垂体一肾上腺轴反馈抑制等不良反应而不减弱激素的治疗效果更具有医疗意义。
滋阴类中药可对抗糖皮质激素反馈神制作用,故虫草多褚的上述效应可视为虫草的滋阴作用。
2.1.7Shahed等研究发现在缺血再灌注小鼠肾脏中,虫草提取物能显著下调致凋亡细胞因子TNF。
及炎症因子MCP一1的表达。
同时虫草组亦下调casPase3(胞内丝氨酸蛋白酶)的活性,该酶被认为是凋亡路径的终止酶。
虫草提取物明显提高肾功能,在缺血60而n及再灌注3h时显著下调致炎症及致凋亡基因的表达。
由此可推测虫草提取物在肾脏移植中具有潜在的治疗价值。
程代薇等[7]固通过研究复方虫草制剂在人一猪间异种皮肤移植中孵化皮片和局部外用,观察到局部应用复方虫草制剂可明显延长皮片存活时间,其机制与虫草抑制细胞免疫及体液免疫有关。
2.2冬虫夏草对呼吸系统的影响:
冬虫夏草能扩张支气管、祛痰平喘。
魏涛等[8]选用二月龄雌性昆明小鼠,随机分为空白对照、低剂量(0.sglkg·
bw)和高剂量(1.og/kg·
bw)3组,连续灌胃17d和27d后分别进行镇咳、祛痰和体内抗炎实验;
同时还研究了冬虫夏草菌丝体的体外抗菌作用。
与对照组比较,低剂量虫草菌丝体能降低浓氨水致咳小鼠的咳嗽次数44.4%(P<
0.05),延长咳嗽潜伏期108.1%(P<
0.01),并能降低二甲苯致耳廓肿胀厚度40.2%(P<
0.05);
高剂量虫草菌丝体能降低浓氨水致水鼠的咳嗽次数49.4%(P<
0.01),延长咳嗽潜伏88.4%(P<
0.ol),提高酚红排泌量75.0%(P<
0.ol),并降低二甲苯致耳廓肿胀厚度36.4%(P<
0.05)。
体外抗菌实验显示虫草菌丝体具有抑制黄色葡萄球菌、肺炎球菌和乙型链球菌的作用,其作用机制有待于进一步研究。
以上结果表明冬虫草菌具体有镇咳、祛痰和抗菌消炎作用,有清咽润喉之功用。
另外,魏涛等网通过实验发现灌服冬虫夏草菌丝体后的大鼠肺巨噬细胞内酶活性有明显的提高,冬虫夏草能显著改善肺部免疫功能。
冬虫夏草能防治肺气肿!
洲,对由氯化福雾化吸人法所致的大鼠肺气肿实验模型有一定的预防作用,用药组肺组织基本保持原有结构,肺泡数无明显减少,肺组织结构清晰。
2.3冬虫夏草对泌尿生殖系统的影响:
减少尿NAG酶的排泄,维护肾小管的保钠功能,促进肾小管细胞修复再生,保护肾功能及溶酶体酶的作用,能够对抗或减轻药物的肾毒性。
陈划能有效降低肌配(cr)和血尿素氮(BuN),减慢肌配清除率(Ccr)下降,提高白蛋白和血红蛋白浓度,减少尿蛋白量,降低血脂,纠正慢性肾衰的脂质代谢紊乱。
对实验性“肾阳虚”小鼠的体重减轻、肾上腺及胸腺萎缩有明显的预防作用;
能增加去塞丸雄性小鼠的包皮腺、精囊重量;
对雌性小鼠的子宫、肾上腺重量和体重也有明显增加作用;
能使大鼠离体子宫收缩明显加强、振幅增大。
2.4冬虫夏草对心血管系统的影响:
冬虫夏草所含腺昔是种内源性喋吟核什,具有舒张血管、降低血压、减慢心律、增加CAMP含量等多种生理活性,对心律有双向调节作用,CS蛋白质提取物(CSP)对小鼠静脉注射,能显著抑制主动脉压(MAP)。
32mgPkg浓度的CsP可导致MAP降低58士4mmHg(从107士6降到49土3mmHg),且作用时间超过45分钟。
肾上腺素预先处理过的主动脉环,用浓度巧ougPmL的csP可引起高度的血管舒张,达68.93%。
研究显示cSP诱导的血管舒张是由内皮细胞层释放的含氮化合物和内皮细胞层衍生超级化因子间接导致的,CSP中含有可松弛血管壁以降低MAP的成分存在,CS及CS菌丝水提液可使离体豚鼠及兔心心律减慢、心输出量和灌脉流量增加,CS菌丝体醇提物可增加麻醉犬冠脉血流量,降低冠脉、脑及外周血管阻力和降压。
CS发酵液巧olllgpkg静注及灌胃对神经垂体素所致兔心肌缺血、甲状腺素及去甲肾上腺素所致大鼠应急性心肌梗死有保护作用。
CS醇提物能对抗乌头碱、BaC12诱发的大鼠心率失常。
抗心肌缺血,增加冠脉血流量,增加心脑组织对氧的摄取利用,明显抑制血小板聚集作用及缺血小鼠脑内血栓素的形成。
2.5冬虫夏草对神经系统的影响:
具有中枢抑制作用,有镇静、抗惊厥和降温作用。
CS能明显减少小鼠自发活动及睡眠时间,并延长戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间。
CS醇提物还可拮抗苯丙胺的中枢兴奋作用,对抗烟碱和戊四哇所致小鼠惊厥,减少死亡率,还可使正常体温降低,显著延长士的宁所致惊厥的潜伏期}均。
2.6冬虫夏草对消化系统的影响:
护肝、抗纤维化作用:
能减轻肝脏的炎性细胞浸润和肝细胞变性坏死;
同时能抑制总胶原、I、111型胶原在肝内的沉积,并可使已形成的胶原重新吸收,其作用与秋水仙碱相仿。
同时能抑制小鼠血清ALT,AST活性,降低其与肝组织中LPO的含量,并减轻其增大的肝脾重量指数,降低血清中的TNF水平。
2.7冬虫夏草物质代谢的影响:
补充机体必需氨基酸和微量元素,从而改善患者的健康状况。
调节只大物质代谢,具有促进蛋白质代谢和降脂、降糖作用。
能显著降低链脉菌素所致糖尿病小鼠,以及肾上腺素引起的高血糖小鼠的血糖水平。
虫草素和D一甘露醇有抗脂质过氧化活性,对自由基有清除作用,并能通过抑制LDL脂质过氧化而控制粥样硬化进展。
抗疲劳作用。
动物负重游泳时间和常压耐缺氧时间均明显延长,LDH活力增高,糖原储备增加,Mb·
和MDA含量明显降低。
3冬虫夏草的人工培养及质量标准
3.1冬虫夏草的培养基培养
冬虫夏草人工接种培养实验已进行多年[9];
用冬虫夏草无性型菌株低温发酵培养则已工业生产。
而在固体培养基上培养则报道不多。
在美国和日本常用大米于塑料袋和玻璃瓶中培养虫草。
经检测大米培养基能产生阻碍生长的代谢产物,在这种培养基上腺苷和虫草菌素含量都很低。
生长期大约2224d,其菌丝的生物转化率最多40%[10]。
在中国蚕蛹粉是一种常用的廉价基质,也可获得高质量的产品。
燕麦比大米更有利于形成高质量的活性物质,若添加植物油效果更佳。
其缺点是,燕麦可带给产品其他气味,而把虫草特有的味道掩盖。
小米是一种理想的基质,它没有强烈的气味、不阻碍菌的生长并有利于活性物质的形成。
缺点是小米含有较高的粘性物质,这类物质在灭菌后使培养基变得很粘,易导致厌氧菌的污染。
白高粱(Whitemilograin)也叫白卡菲玉米(Whitekaffircorn),是一种很好的基质。
它不阻碍菌的生长和活性组分的形成,且不影响虫草的风味。
但单独使用白高粱不能完全满足虫草的生长,若在4份白高粱中加入1份小米,可提高生长速度6倍。
在此培养基上,虫草生长时间较长,菌丝的生物转化率能达到96%以上,基质的残留物仅3%4%,且能较好地形成生物活性物质。
有趣的是,若混入小量红高粱于其中,就会明显降低生长并全面影响产品质量[10]。
3.2冬虫夏草的质量标准
目前对虫草质量的评估,有的分析甘露醇、有的分析腺苷、有的分析多糖,有的分析其他化合物,致使质量标准混乱,质量监控十分困难。
当前,如何选取一种(或某几种)特征性的生物活性物质作为质量控制标准并建立一种有效的分析方法及程序就显得十分重要。
已知,脱氧腺苷在其他真菌中目前很少发现。
Holliday等研究提出,脱氧核苷是虫草中具特色的功能性组分;
N6-二羟乙基腺苷是另一个具活性的物质。
连同腺苷和脱氧核苷一起,此3种化合物可用作虫草不同菌株和生产方法的定性和定量质控标准。
上述具重要生物活性意义的化合物,统称为羟乙基腺嘌呤核苷类物质(Hydroxyethyladeno-sineanalogs,HEAA)[10]。
用高效液相色谱(HPLC)气相色谱(GC)分析HEAA的含量是一个比测定多糖更好的定性指标。
在国内有研究者提出除腺苷类物质外,甾醇也应是冬虫夏草重要的活性成分[1112]。
4.冬虫夏草液体深层发酵技术及产品开发
4.1技术简介
冬虫夏草是传统的中草药和保健品,深受人们的喜爱。
冬虫夏草具有多种药理活性和功能,包括治疗肾衰竭、肿瘤和抗疲劳。
虫草多糖具有抗氧化作用,核苷具有抑制血小板凝聚作用,甾醇类物质具有抗肿瘤作用。
由于天然冬虫夏草产区局限、产量稀少,天然虫草供不应求,国内外市场货源紧缺,且价格较高。
为此采用现代高科技生物技术,利用从青海产新鲜冬虫夏草中分离到的虫草菌菌株,通过深层发酵培养生产冬虫夏草,研究结果表明深层发酵得到的菌丝体的有效成分与天然虫草类似,虫草多糖、甘露醇、虫草素等重要
营养成分更是高于天然虫草。
冬虫夏草深层液体发酵技术相比传统栽培模式具有以下特点:
虫草多糖、甘露醇、虫草素等有效成分含量高,质量稳定,生产成本低,可连续生产,标准化控制,不受季节气候影响等。
4.2开发产品
虫草菌粉、速食虫草燕麦片、复方虫草制剂、冬虫夏草营养液、虫草蜂王浆、虫草功能饮料。
4.3产能指标
40t冬虫夏草菌粉、200t高浓度冬虫夏草浓缩液(6个10m3)。
4.4主要经济指标每
1kg菌丝体总成本为80元,每1kg菌粉的销售价格为240元,利润率达到200%;
虫草菌粉的年销售额达1000万元,利润700万元;
冬虫夏草发酵浓缩液也可以开发相关产品。
4.5技术指标
虫草酸10.5%(天然虫草为3.1%),虫草素0.0015%(天然虫草为0.00016%),虫草多糖19.2%(天然虫草为7.0%)。
4.6主要设备
厂房约需1000m2,10m3发酵罐6个、空压机1台、锅炉1台。
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