刺五加对脑出血大鼠细胞凋亡的影响.docx
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刺五加对脑出血大鼠细胞凋亡的影响
刺五加对脑出血大鼠细胞凋亡的影响
作者:
刘天丹黄良国王凤英蒋国红
【摘要】 目的观察刺五加(AS)对脑出血(ICH)大鼠脑细胞凋亡及其对凋亡调控蛋白Bcl2、Bax的影响及对ICH脑组织的保护作用。
方法雄性Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组与治疗组。
治疗组又分为AS大剂量组和小剂量组。
用胶原酶注入大鼠尾状核建立ICH模型。
治疗组给予AS干预,在不同时间点处死大鼠,测定血肿周围组织细胞凋亡、Bcl2和Bax水平。
结果AS治疗组分别于12h、1、3、7d凋亡细胞低于模型组(P<0.01,P<0.05)。
AS治疗组Bcl2水平分别于12h、1、3、7d表达高于模型组(P<0.01,P<0.05)。
Bax于12h、1、3、7d时AS治疗组表达低于模型组(P<0.01,P<0.05)。
结论AS能明显减少ICH后神经细胞凋亡,升高Bcl2表达水平,降低Bax表达,保护ICH后神经细胞。
【关键词】脑出血;刺五加;细胞凋亡;Bcl2;Bax
【Abstract】ObjectiveToobservetheeffectsofAcanthopanaxsenticosus(AS)onbrainapoptosisandexpressionofBcl2,Baxproteininratsafterintracerebralhemorrhage(ICH)andexploretheprotectivemechanismofASonneuralcell.MethodsMaleWistarratsweredividedrandomlyintonormal,model,shamoperatedandtherapygroups.ThetherapygroupincludedhighandlowdoseAStherapygroups.ModelsofICHwereestablishedonlocalinjectionofcollagenaseintocaudatenucleus.ThetherapygroupratsweretreatedwithAS.RatsofallgroupswerekilledatspecifictimesandapoptosislevelandthechangeofBcl2,Baxweredetected.ResultsApoptosiscellsintherapygroupweresignificantlydecreasedcom
paredwiththatofmodelgroupat12h,1,3and7d(P<0.01,P<0.05).TheexpressionofBcl2proteinintherapygroupweresignificantlyincreasedcomparedwiththatofmodelgroupat12h,1,3and7d(P<0.01,P<0.05).Theexpressio
nofBaxproteinintherapygroupweresignificantlyincreasedcomparedwiththatofmodelgroupat12h,1,3and7d(P<0.01,P<0.05).ConclusionsAScouldgreatlyreducetheamountofapoptosiscellsafterICH,whichprobablyrelatestohighexpressionofBcl2proteinandlowerexpressionofBaxprotein.
【Keywords】Intracerebralhemorrhage;Acanthopanaxsenticosus;Apoptosis;TUNEL;Bcl2;Bax
脑出血(ICH)后血肿周围组织继发性损伤机制研究为临床药物干预治疗ICH提供了科学依据。
刺五加(AS)对缺血性脑损伤的治疗作用已被临床与动物实验所证实,对于出血性脑血管病,临床上也已广泛应用。
AS治疗ICH机制,目前尚不完全清楚。
本实验旨在观察ICH后血肿周围组织神经细胞凋亡和Bcl2、Bax蛋白表达基础上,采用AS干预治疗,探讨AS对其影响及脑保护作用。
1材料与方法
1.1实验材料
健康Wistar大鼠126只,雄性,体重250~300g,由中国人民解放军第三军医大学大坪医院动物中心提供;原位末端标记法(TUNEL)试剂盒购于美国Roche公司;Ⅶ型胶原酶(1.5kU/支)购于美国Sigma公司;兔抗大鼠Bcl2、Bax单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购于北京博奥森生物工程有限公司;AS注射液(20ml/支,批号2)由黑龙江完达山制药厂生产。
1.2实验方法
1.2.1动物模型制作
参照Rosenberg的大鼠ICH模型制作方法〔1〕,实验大鼠禁饮食12h之后,以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉,俯卧位固定于立体定位仪上。
局部消毒后“丁”字形剪开颅顶皮肤,按照《大鼠脑立体定位图谱》〔2〕定位尾状核,前囟为0点,向右旁开3mm,向前0.2mm,牙科钻钻透颅骨,钻孔直径0.8mm,微量注射器针头垂直刺入脑组织,进针5.5mm(右侧尾状核所在部位)。
向大鼠的右侧尾状核缓慢注入0
.5μl(1U)胶原酶,留针10min后缓慢拔出穿刺针,缝合皮肤,予局部消毒。
假手术组以等量生理盐水代替胶原酶注入右侧尾状核。
动物苏醒后,放回笼内饲养,正常进食进水,室温37℃左右。
1.2.2大鼠选入标准
根据Bederson神经缺损体征评分法〔3〕进行综合等级评分。
缺损体征达3级及以上者为制模成功。
断头取脑后沿进针道切开可见明显血肿。
不符合条件的大鼠弃去,重新补充。
1.2.3大鼠分组与给药随机将大鼠分为5组。
①正常组:
大鼠6只,普通饲养,不作任何处理,饲养1w后断头取脑制作标本。
②假手术组:
大鼠30只,普通饲养,术后3h以2ml生理盐水腹腔注射,以后每日1次,直到处死为止。
③模型组:
大鼠30只,制作ICH模型(见上述)术后处理同假手术组。
④AS小剂量组:
制模成功后,每日给予AS注射液,6.25ml/kg体重,加生理盐水至2ml,每日1次腹腔注射。
⑤AS大剂量组:
制模成功后,每日给予AS注射液31.25ml/kg体重,分2次腹腔注射,二次注射间隔8h以上,直到处死为止。
除正常组外分别在术后6、12h、1、3、7d断头取脑制作标本,每个时间点观察6只大鼠。
1.2.4组织取材
在相应的时间点用水合氯醛麻醉大鼠,开胸,左心室插管灌注,右心耳剪开引流。
先灌注生理盐水150ml,再以4%多聚甲醛灌注至大鼠发白僵硬,然后快速断头取脑。
沿穿刺针道冠状面自上向下切开至尾状核处,可见血肿灶。
以穿刺点为中心,冠状面取厚度5mm脑组织置于4%多聚甲醛液中固定4h,脱水后石蜡包埋。
以血肿灶为中心制作水平位脑组织切片,切片厚度4μm做苏木素伊红(HE)染色和免疫组织化学染色。
1.3检测方法
1.3.1HE染色方法观察组织病理学变化
切片经梯度酒精水化、HE染色、封片等程序处理后,在光学显微镜下观察血肿周围组织病理变化。
1.3.2血肿周围组织细胞凋亡水平TUNEL染色法检测细胞凋亡。
切片经过氧化氢、复合消化液处理,加末端脱氧核苷酸转移酶(TdT),37℃孵育1h,用链霉亲和素孵育,DAB显色,HE复染。
对照组以磷酸盐缓冲液(PBS)代替人末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。
阳性细胞核呈棕黄色颗粒状。
高倍光镜下(400倍)计算凋亡指数(AI),即每张片选取不重叠10个细胞数最多的高倍视野,计算每个视野中凋亡细胞与总细胞数的百分比和10个视野的平均凋亡细胞百分数,再计算每个时间点(6张切片)平均凋亡细胞百分数。
1.3.3血肿周围组织Bcl2与Bax的表达检测
采用SP方法,加1∶200兔抗大鼠Bcl2、Bax一抗,经过二抗处理,链霉亲和素孵育,DAB显色,HE复染。
Bcl2与Bax阳性细胞胞浆呈棕黄色染色。
计算每个时间点(6张切片)平均阳性细胞数,方法同前述。
1.4统计学处理
采用SPSS13.0统计学处理软件,数据采用x±s表示。
经过方差齐性检验后,组间两两比较采用单因素方差分析。
2结果
2.1病理形态学结果
HE染色400倍切片中,可观察到血肿周围部分细胞体积缩小,细胞核浓染,细胞核染色质聚集于细胞核一侧呈新月形,并大小不等的核碎片,见图1。
2.2AS对血肿周围组织细胞凋亡的影响
凋亡细胞在TUNEL染色下胞核呈棕褐色。
正常组和假手术组仅有少量凋亡细胞,两组比较差异不明显(P>0.05);模型组、AS小剂量组与AS大剂量组,6h凋亡细胞数即明显高于假手术组,1d达高峰,之后逐渐下降,但至7d仍较假手术组显著增高(P<0.01);AS小剂量组与模型组比较,凋亡细胞数于12h减少(P<0.05),1、3、7d明显减少(P<0.01);AS大剂量组与模型组比较,凋亡细胞数于12h、1d、3d、7d明显减少(P<0.01);AS大剂量组与AS小剂量组相比,凋亡细胞数于1、3d减少(P<0.05),7d明显减少(P<0.01)。
见图1和表1。
表1AS对大鼠ICH后细胞凋亡的影响(略) 2.3AS对血肿周围组织Bcl2表达的影响
Bcl2阳性细胞SP染色时胞浆呈棕褐色,主要表达于大脑皮质与基底节区。
Bcl2表达水平:
假手术组各时间点与正常组对比无显著差异(P>0.05);模型组、AS小剂量组与AS大剂量组6h时即有表达,12h时达高峰,之后逐渐下降,7d仍有相对较高表达。
三组之间差异明显。
模型组各时间点均明显高于假手术组(P<0.01);AS小剂量组12h表达高于模型组(P<0.05),1、3、7d表达明显高于模型组(P<0.01);AS大剂量组于12h、1d时表达较AS小剂量组增高(P<0.05),3、7d表达明显高于AS小剂量组(P<0.01)。
见图1和表2。
表2AS对大鼠ICH后Bcl2的影响(略)
2.4AS对血肿周围组织Bax表达的影响
Bax主要表达于血肿周围区,阳性表达细胞SP染色胞浆呈棕褐色。
假手术组与正常组很少表达,两组无显著差异(P>0.05);模型组、AS小剂量组与AS大剂量组6h时较少表达,12h时开始增加,1d达高峰,3d明显下降,7d仍有表达,三组间有明显差异。
模型组于各时间点均较假手术组明显增加(P<0.01);AS小剂量组表达于12h低于模型组(P<0.05),1、3、7d明显低于模型组(P<0.01);AS大剂量组于12h、1d、3d低于AS小剂量组(P<0.05),7d明显低于AS小剂量组(P<0.01)。
见图1和表3。
表3AS对大鼠ICH后Bax的影响(略)
3讨论
细胞凋亡是由多基因调控的细胞程序性死亡过程,是一种基本生命现象,具有维持机体正常生理过程和多细胞生物正常发育成熟的作用。
细胞凋亡受到机体的严密调控,其过程是瀑布式基因表达过程,许多基因参与这一过程。
其中包括Bcl2基因家族。
该基因家族可分抗凋亡(Bcl2、BclXL等)和促凋亡(bax、bad、bid等)两大亚族。
由Bcl2基因表达的Bcl2蛋白是一种膜合蛋白,包括分子量各为26kD的Bcl2α和21kD的Bcl2β两种相似蛋白,存在于细胞的线粒体、核膜、内质网膜等处,主要功能是抑制细胞凋亡、延长细胞寿命。
作用机制与抑制氧自由基产生、抑制Ca2+释放、阻止半胱氨酸蛋白酶3(Caspase3)激活、抑制Bax蛋白的促凋亡作用以及抑制细胞色素C释放等方面有关。
Bax蛋白是Bcl2的同源蛋白,同样存在于线粒体外膜、内质网膜和核被膜的细胞质面,能够增加线粒体膜通透性,使细胞色素C释放至细胞质并与衔接蛋白即凋亡蛋白激活因子(Apaf1)结合,促进Caspase级联反应,导致细胞死亡。
Bax还通过与Bcl2蛋白结合形成异二聚体,使Bcl2失去抑制细胞凋亡的作用。
正常细胞中,存在Bax与Bcl2微量表达,细胞是否发生凋亡,依赖于Bcl2/Bax的比例〔4〕。
研究〔5〕表明,细胞凋亡是ICH后脑组织损伤的主要原因。
ICH后神经细胞死亡分为坏死和凋亡。
坏死以神经细胞肿胀和溶解为特征,包括群体细胞死亡和继发炎症反应。
凋亡则以细胞核皱缩形成凋亡小体为特征。
血肿压迫、血肿局部血流量下降、自由基大量产生、炎症反应〔6〕、凝血酶〔7〕及血液成分如血红蛋白等因素均可诱发或加重细胞凋亡。
细胞凋亡可以被外界因素如药物、低温等中止,因而抑制细胞凋亡可促进神经功能恢复。
本实验通过应用AS干预大鼠ICH模型,观察其对ICH后凋亡细胞的影响。
AS注射液是一种中药制剂,系AS茎叶精制而成的无菌水溶液。
主要化学成分为异嗪皮定、β谷甾醇、异秦皮定甙、紫丁香树酯醇甙等。
根据祖国医学,AS具有补肾安神、益气固本、活血通络、强身延年之功效。
近年来临床应用AS注射液治疗ICH取得明显效果〔8〕,但其治疗机制仍待深入探讨。
本实验显示,细胞凋亡伴随ICH而大量产生。
但治疗组12h、1、3、7d凋亡细胞数明显低于模型组,且大剂量组疗效明显优于小剂量组。
表明AS可明显对抗ICH神经细胞凋亡。
其机制可能为:
①AS具有清除氧自由基,升高超氧化物歧化酶(SOD)活力,降低过氧化脂质LPO)作用〔9〕;②扩张脑血管,增加血肿周围局部血流量〔10〕。
可减轻脑水肿,改善微循环,降低血黏度,抑制血小板聚集;③具有抗炎作用〔11,12〕,抑制炎症因子对血肿周围组织的损伤。
减少炎症因子产生,从而降低了某些炎症因子参与的细胞凋亡过程。
Bax于ICH后6h即有表达,1d达高峰,表明Bax表达高峰期与细胞凋亡一致,显示其与细胞凋亡一致性。
Bcl2在ICH后12h达高峰,表达高峰较Bax提前,此可能与ICH损伤诱发细胞的保护机制激活有关。
ICH时,血肿的占位导致血肿周围组织血流量下降,局部缺血缺氧,产生大量自由基和其他细胞因子〔13〕,诱发细胞凋亡。
AS通过Bcl2表达升高阻止以上因素所诱导的细胞凋亡,发挥抗凋亡作用。
ICH后细胞凋亡和Bcl2、Bax的表达均呈现规律性的变化,从6h至7d,ICH后Bcl2与Bax表达均明显高于正常组与对照组,显示在细胞凋亡调控过程中,各种因子之间的相互拮抗作用。
AS干预后于12h、1、3、7d可明显提高Bcl2表达,于12h、1、3d可降低Bax表达,大剂量组尤为明显。
提示AS可能通过升高Bcl2表达,降低Bax表达而抑制细胞凋亡,从而发挥脑保护作用。
【参考文献】
1RosenbergGA,MunBryceS,WesleyM,etal.Collagenaseinducedintracerebralhemorrhageinrats〔J〕.Stroke,1990;21(5):
8017.
2诸葛启训主译.GeorgePaxinos,CharlesWatson著.大鼠脑立体定位图谱〔M〕.北京:
人民卫生出版社,2005:
6.
3PeelingJ,YanHJ,ChenSG,etal.Protectiveeffectsoffreeradicalinhibitorsinintracerebralhemorrhageinrat〔J〕.BrainRes,1998;795(12):
6370.
4MatsushitaK,MengW,WangX,etal.Evidenceforapoptosisafterintebcerebralhemorrhageinratstriatum〔J〕.JCerebBloodFlowMetab,2000;20
(2):
369404.
5QureshiI,SuriMF,OstrowPT,etal.Apoptosisasaformofcelldeathinintracerebralhemorrhage〔J〕.Neurosurgery,2003;52(5):
10417.
6MayerSA,LignelliA,FinkME,etal.Perilesionalbloodflowandedemaformationinacuteintracerebralhemorrhage:
aSPECTstudy〔J〕.Stroke,1998;29(9):
17918.
7XiG,KeepRF,HuaY,etal.Attenuationofthrombininducedbrainedemabycerebralthrombinpreconditioning〔J〕.Stroke,1999;30(6):
124755.
8祝红,黄良国,徐平,等.刺五加注射液治疗急性期脑出血的临床观察〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志,2007;2
(2):
1145.
9LeeYJ,ChungHY,KwakHK,etal.TheeffectsofA.senticosussupplementationonserumlipidprofiles,biomarkersofoxidativestress,andlymphocyteDNAdamageinpostmenopausalwomen〔J〕.BiochemBiophysResCommun,2008;375
(1):
448.
10白树风,杨建学.刺五加注射液对脑出血血肿及周围水肿带的治疗作用〔J〕.临床荟萃,2002;17
(2):
978.
11陈博.刺五加对重症急性胰腺炎肺损伤大鼠核转录因子HB的影响〔J〕.中国当代医药,2010;17(7):
134.
12戎爱群,江年.复方刺五加对小鼠免疫功能的影响〔J〕.中成药,2009;31(10):
16289.
13胡利华,吴江,杜丹华,等.实验性脑出血急性期灶周组织水肿及炎性因子的表达〔J〕.中风与神经疾病杂志,2006;23(5):
5524.
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