哺乳动物细胞核移植教案概要.docx
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哺乳动物细胞核移植教案概要
哺乳动物细胞核移植教案
ChapterOneNuclearTransplantationofMammaliancells
cartoonyang
(中国生命科学论坛动物科学与动物医学第1版主)
摘要:
本文综述了近年来哺乳动物细胞核移植的相关进展。
关键词:
哺乳动物细胞核移植进展
Introduction
Themergeofaspermandanovum(fertilization)recoversthediploidcellmarkingthebeginningoftheindividualdevelopment.Intheembryonicdevelopment,varioustypesofcellsareoriginatedfromthezygotsuchasmusclefibers,neuronsandhemocytesetc.Aquestionhasbeenaskedifthedifferentiatedcellsinthedevelopmentcouldresumetheinitiationstatusorpluripotentstageunderpropercircumstanceswhichcouldgiverisetoothertissuesandeventhebodyasawhole.Istheprocessirreversible?
Toanswerthequestion,thefamousGermanembryologistSpemmanbroughtouttheideatotransplantthenucleiofcellsintheanaphaseofdevelopmenttodenucleatedovarestartingtheprocessin1938.Theaimoftheexperimentistotestifythetotipotencyofpartiallyorcompletelydifferentiatedcells.In1952,BriggsandKingconductedthefirstnucleartransplantationintadpoles.1n1962,thenucleitransplantofgastrulaendoblastbredfertilexenopus,whichdemonstratedthecellspostgastrulastagedonotundergoirreversiblechange.Alltheseexperimentsshowtheinferiorcreatureslikeamphibianpossessatleastpartofdifferentiatedsomaticcellscouldrecovertheirtotipotencytodeveloptoadultstagewiththeeffectofoocytecytoplasmaandthishaslaidthefoundationformammaliannucleartransplantation.
引言
一个精子和一个卵子的结合(即受精),恢复二倍体,从而开始了一个个体的发育。
在胚胎发育过程中,很多不同类型的细胞都是由受精卵发育开始的。
它们有一些专门发育为肌肉细胞,有一些发育为神经细胞,还有发育为血细胞等。
从这里就引出了一个问题:
在哺乳动物胚胎发育过程中,细胞发生了分化,但是在适宜环境下,已分化的细胞能否重新恢复到发育的起始状态,再重新发育成其它类型细胞组织的多能性,甚至发育成完整个体的全能性呢?
细胞的分化是不是发生了不可逆的变化?
为了回答这个问题,早在1938年,德国著名胚胎学家Spemann提出了将发育后期的胚胎核移到无核的卵子中使其重新发育的设想,实验的目的就是为了检验部分分化或完全分化细胞的全能性。
他通过头发结扎将蝾螈的受精卵一分为二,有核部分可正常发育和卵裂,并发育到16细胞期,无核部分当移入另一个卵裂球的细胞核时,也能发育成为正常的幼虫,证实了蝾螈未分化的卵裂球具有发育的全能性。
1952年,Briggs和King等将已发生了分化的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵,构建核移植胚,最后发育出了完整的蝌蚪。
这是首次进行的细胞核移植尝试获得成功。
Gurdon等(1962)利用原肠期内胚层细胞进行核移植,分别产下可育爪蟾。
由此证明:
自原肠胚以后的细胞仍然没有发生不可逆的改变,可以支持核移植胚发育到成体。
这些实验结果证实,两栖类等低等动物至少有部分已分化的体细胞在卵母细胞质的作用下,可以恢复其全能性而重新发育到成体。
这也为哺乳动物核移植奠定了基础。
1哺乳类动物细胞核移植研究进展
1.1哺乳类动物胚胎细胞核移植研究进展
哺乳动物核移植研究始于1975年,研究远远晚于两栖类动物,其主要原因是由于哺乳动物的受精在体内发生,而且哺乳动物早期胚胎的体外培养(InVitroCulture,IVC)技术和早期胚胎显微操作技术在当时没有建立起来。
牛津大学Bromhall(1975)将兔子的胚胎细胞核移植到未受精的卵母细胞内,部分可发育到囊胚阶段,但成功率相当低。
由于不能进行染色体和供体特异性标记分析,因而这些发育的胚胎来源是否是注入的细胞核,或者是胚胎自身的细胞核都不能作一清楚的解释。
鉴于当时的哺乳动物核移植理论和技术都尚未完善,人们大多将研究的重点放在了卵裂球的分离和胚胎切割上。
然而,由于胚胎分割和卵裂球分离技术本身的局限性,动物克隆的数量非常有限,未能达到人们所希望的预期效果,于是人们一直也在探索动物核移植的克隆方法。
在1981年,Illmensee和Hoppe将小鼠囊胚的内细胞团(InnerCellMass,ICM)的细胞核移植到去核的受精卵内,获得了首批克隆的小鼠。
这是世界上首次获得哺乳动物克隆成功的报道,但是其实验未被其他的研究人员所重复,人们仍对核移植技术仍缺乏信心。
直到1983年这种局面才被Mcgrath和Solter打破,他们首次利用显微操作技术和细胞融合技术,将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植,得到了产仔,并建立了重复性很高的核移植程序,使得核移植效率大大提高,人们对核移植技术的应用前景看到了希望。
随着核移植技术程序的建立,哺乳动物细胞核移植的研究发展很快。
1986年,Willadsen等用绵羊早期胚胎的卵裂球作供体,用去核的第二次减数分裂中期(SecondMeioticMetaphase,MII)卵母细胞作受体,并用电融合的方法代替了仙苔病毒诱导供体卵裂球与去核卵母细胞融合,研究发现电融合方法比病毒融合法更有效,核移植胚胎的体外发育能力更强,重组胚移植后获得了核移植后代,这是首次在家畜上获得了成功。
他们的实验阐明了哺乳动物胚胎细胞核移植中两个全新的观念:
(1)作为核受体,卵母细胞比受精卵有更大的优越性;
(2)绵羊桑椹胚的细胞核具有发育的全能性,并建立了以早期胚胎卵裂球为供体,MII期卵母细胞为受体胞质以及用电融合方法诱导供体细胞核和受体胞质融合这一整套技术。
该技术极大推动了核移植技术的发展,并成功运用于其它动物,获得了胚胎克隆牛(Pratheretal,1987)、兔(Stice&robl,1988)、猪(Pratheretal,1989),和猴(Mengetal,1997)等。
虽然胚胎细胞核移技术的发展总体相似,但是各动物胚胎细胞核移植的发展过程是有所不同的,下面将分别对各种哺乳动物的胚胎细胞核移植技术研究进展作一简单的概述。
1.1.1小鼠
小鼠的胚胎细胞核移植的研究开展较早,也是最早获得了核移植后代。
1981年,Illmensee和Hoppe将小鼠囊胚的ICM细胞核移植到去核的受精卵内,获得了首批克隆小鼠。
1983年,Mcgrath和Solter首次利用显微操作技术和细胞融合技术,将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植,得到了产仔,并建立了重复性很高的核移植程序,使得核移植效率大大提高。
除了这些取得突破的研究外,Hoppe和Illmensee(1981)的研究证明了孤雌生殖胚胎的ICM细胞含有发育个体所需的所有基因,这些细胞具有发育的全能性。
在细胞周期的调整和核质互作上,Cheong等(1993)发现细胞周期早期的胚胎细胞核在受体细胞质中可以发生发育程序的重排,核移植胚胎的发育率明显提高,并获得了核移植后代。
1996年,Kwon和Kono等通过改进方法,获得了4个和6个遗传上完全相同的继代核移植后代。
另外有研究表明,小鼠囊胚期的滋养层细胞与ICM细胞一样具有发育的全能性(Tsunda&Kato,1997;Sotomaruetal.,1999)。
1.1.2牛
实验动物中的胚胎细胞核移植研究为家畜的核移植研究奠定了扎实的技术基础。
而在家畜中,牛的胚胎细胞核移植研究的历史较为久远,研究的投入是最大的,也取得了丰硕的成果。
1987年,Robl等首次进行牛的核移植研究,他们将1-8细胞期胚胎的细胞核移到去核的合子内,结果1-细胞期胚胎的细胞核移植后构成的重组胚可以发育到出生,而处于其它细胞期的胚胎细胞核移植后均不能支持重组胚发育超过4-细胞期。
同年,Prather等(1987)用Willadsen相同的核移植技术程序(Willadsen,1986),将16-32细胞期胚胎的卵裂球移入去核的体内或体外成熟卵母细胞内,最后出生了1头核移植牛犊,其成功率为1%。
Bondioli等(1990)用16-64细胞期胚胎作核移植供体,获得了7头来自同一核供体胚胎表现型的牛犊,移植的成功率达20%。
Stice和Keefer(1993)获得了54枚来自同一供体胚胎的克隆胚胎,其第一、二、三代克隆胚胎移植后均产下了牛犊。
Ector等(1995)克隆与再克隆囊胚发育率(12.9%与14.9%)和妊娠率(35.7%与33.3%)没有差异性。
而Heyman等(1995)用体外受精(InVitroFertilization,IVF)胚胎作为核移植供体,核移植胚胎的囊胚发育率达到了22.6%,这与体内胚胎作为核移植供体核的囊胚发育率相似(30.2%)。
而在国内这方面的研究也取得了进展,李雪峰等(1996)成功的获得了我国第一头胚胎克隆牛。
1.1.3猪
1989年Prather等利用合子间的原核交换,并利用电脉冲使供体原核和去核合子融合,得到了7头仔猪,而利用2-8细胞期胚胎的核融合去核的MII期卵母细胞,体内移植后形成11%的桑椹胚,移植88枚核移植胚胎至受体母猪仅生下了1头仔猪,成功率不到1%。
因此后来的研究也着重转向影响猪胚胎细胞核移植的因素。
同牛一样,猪的核受体卵母细胞既可用体内成熟的也可用体外成熟的(Pratheretal.,1991)。
但由于当时卵母细胞的体外成熟培养系统还不够完善,使得体外成熟卵母细胞质量较差而不能完成胚胎的体外发育全过程(Nagashimaetal.,1992)。
Prather等(1990)在研究发现,猪核移植胚发生了发育程序的重排,出现供体核膨胀,并认为核的膨胀程度与卵裂球的发育时期无关。
在猪卵母细胞激活上,研究表明:
采用合适的场强1次电脉冲就足以激活猪卵母细胞,增加脉冲次数并不能提高激活率(Pratheretal.,1989;Prochazkaetal.,1992;Nagashimaetal.,1992;赵浩斌等,1999)。
而在胚胎发育的早期阶段基因表达和蛋白质合成研究中,也有了初步的成果。
Schoenbeck等(1992)研究表明猪胚胎基因组从4细胞期的16h开始控制发育,Prather和Rickords(1992)的研究发现RNA的合成与加工始于4细胞期的24h,并认为卵母细胞质对核的重排不受母体-合子转变(Maternaltozygotatransition,MZT)的影响。
Parry和Prather等(1995)将8-细胞期胚胎的卵裂球融合于去核MII期卵母细胞内,发现在核移植胚胎上发现有51KD的蛋白质带,并证明了蛋白质是由胚胎卵裂球带入的RNA所合成的。
我国窦忠英(1997)和赵浩斌等(1997)用与Prather等(1989)相同的方法得到了克隆猪。
1.1.4兔
兔子胚胎细胞核移植研究起始于1975年,Bromhall等首次将兔桑椹胚的卵裂球细胞注入到成熟后激活的卵母细胞内,得到了发育的囊胚。
Stice和Robl(1988)用电融合方法将8-细胞期的卵裂球移入去核的MII期卵母细胞内,获得了世界首批6只基因型完全相同的核移植兔。
随后Collas和Robl(1990)改进电激活和电融合技术,以16-细胞期胚胎细胞核为供体核,230枚重组胚移植后有23只仔兔出生,这是到目前为止效率最高的报道。
Collas和Robl在兔的细胞核移植上的贡献特别大。
他们的研究为以后的体细胞核移植奠定了基础。
他们在兔核移植胚胎细胞核质同步对核移植的影响以及供体核形态结构变化上进行了详细的研究,得出了如下的研究成果:
随着供体胚胎的发育,胚胎卵裂球构建的重组胚发育力下降,囊胚期ICM细胞构建的重组胚仍可发育到囊胚,而滋养层细胞构建的重组胚发育阻滞于8-细胞前,供体细胞核的形态重塑对核移胚的发育有利(Collas&Robl,1991)。
G1期的卵裂球移入去核的MII期卵母细胞内时,重组胚发生早熟性染色体凝集(PrematureChromosomeCondensation,PCC),中期染色体和纺锤体形态正常,核移植胚的囊胚率发育率也高,而早S期和晚S期的卵裂球移入MII期去核卵母细胞时,中期染色体和纺锤体出现异常,核移植胚胎的发育率降低(Collasetal,1992a,b)。
在Collas和Robl(1991)的研究理论指导下,Yang等(1992b)将采集的8-细胞期胚胎经体外培养20~24h发育到32-64细胞期后的卵裂球再用作核移植的供体细胞核,获得了8只仔兔,证明了体外培养到32-64细胞期的胚胎仍具有发育的全能性。
黄少华等(1993)首次实验证明,兔冷冻-解冻胚胎也能进行核移植,其结果与新鲜胚胎的的核移植胚在激活率、融合率及分裂率上无显著差异。
之后,我国科学家王斌等(1995),周琪等(1996,1999)也获得了胚胎细胞核移植兔。
在兔核移植研究中一般体内成熟的卵母细胞作为受体胞质,Park等(1998)尝试了用体外成熟14h的卵母细胞进行核移植,发现用兔体外成熟卵母细胞同样可以获得核移植后代。
关于兔继代核移植报道较少。
1995年,周琪等获得了第三代继代核移植兔胚。
1998年,Rao等尝试用冷冻保存的兔核移植胚胎进行继代核移植,得到了继代核移植囊胚,但未得到后代。
Piotrowska等(2000)用兔8细胞胚胎卵裂球进行继代核移植,发现重组胚的发育率无影响,将第三代继代核移植重组胚移入受体后获得了克隆个体。
1.1.5羊
绵羊是继小鼠后第二个获得核移植后代的哺乳动物,也是最早获得核移植后代的家畜。
早在1986年,Willadsen用8-16细胞期的胚胎作为核移植供体,首次用去核的MII期卵母细胞作为核移植受体,并用电融合方法代替仙苔病毒来诱导供体卵裂球细胞与受体胞质相融合,获得了核移植后代。
该方法成为以后核移植的常规方法,为以后其它家畜胚胎细胞核移植和体细胞核移植的成功奠定了技术基础。
随后Smith和Wilmut(1989)用绵羊16-细胞和ICM作为核移植供体,采用该方法进行核移植,都得到了活的后代,该研究首次证明了绵羊ICM细胞仍具有发育的全能性。
Pugh等(1992)的研究表明,绵羊体外成熟卵母细胞可用于构建核移植胚胎。
1997年,Liu等在研究供体细胞与卵母细胞周期的协调性对核移植胚胎体外发育的影响发现,M期卵裂球移入MII期卵母细胞可以提高核移植胚胎的发育率(Liuetal.,1997)。
在国内,山羊的胚胎细胞核移植在国际上一直处于领先地位。
1991年,张涌等利用4-32细胞胚胎卵裂球作为核移植供体,去核的MII期卵母细胞作受体,构建的重组胚胎移植后出生了世界首批核移植山羊5只,这是我国在哺乳动物细胞核移植上的首次获得成功。
1995年,邹贤刚等通过胚胎继代核移植的方法获得了山羊4只。
1.2哺乳动物体细胞核移植研究进展
Gurdon等(1962;1975)用爪蟾,Diberardino&Orr(1992)用蛙分化的细胞进行核移植都得到了蝌蚪,证实了在两栖动物上至少部分已分化的细胞具有发育的全能性,细胞分化后在基因组上没有发生不可逆的改变,基因组上存在重新启动发育所需的所有基因,这一理论为哺乳动物体细胞核移植研究奠定了理论基础。
Czolouska等(1984)的研究表明已分化的小鼠胎儿胸腺细胞移植到激活的卵母细胞后可以发生形态重塑,形成原核样结构,推测体细胞能够支持胚胎的发育。
后来,Kono等(1991)报道了用小鼠胸腺细胞核移植后得到了发育的囊胚,但移植后未获得分娩的核移植小鼠。
由于当时普遍认为哺乳动物的细胞分化在遗传结构上发生了不可逆的改变,部分基因发生缺失,进而失去了发育的全能性,这些研究结果未引起人们的重视。
直到1997年,Wilmut等得到了举世瞩目的第一只成年体细胞核移植绵羊—Dolly后,体细胞核移植才受到广泛的关注,人们才开始重新认识细胞分化的本质以及细胞分化的理论基础。
当然,人们对“Dolly”羊也提出了置疑,但DNA指纹分析证明了Dolly的确来自成年绵羊乳腺上皮细胞(Ashworthetal.,1998;Signeretal.,1998),后来众多的体细胞核移植的成功充分肯定了该研究的结果(Schniekeetal.,1997;Wakayamaetal.,1998;Bulteretal.,1998;Shigaetal.,1999;Lanzaetal.,2000b)。
Dolly的出生,使哺乳动物核移植研究进入了一个崭新的阶段,Wilmut等建立的一整套绵羊体细胞核移植程序,如恢复体细胞核全能性的“血清饥饿法”,体细胞传代阶段确定以及体细胞克隆后代与亲本核供体间的DNA微卫星分析技术成为全世界同行公认的哺乳动物体细胞核移植技术的基本程序。
在短短的几年里,核移植研究从胚胎细胞核移植转入了体细胞核移植研究阶段,世界各地的科学家对各种类型的体细胞核移植进行了有意义的尝试。
用胎儿细胞和成年动物体细胞进行核移植的研究进展迅速,所使用的供体细胞也越来越来广泛,并取得了重大进展。
迄今为止,已有下面9种供核类型的体细胞核移植后代产生。
(1)胎儿成纤维细胞:
Cibelli等(1998)采取34日龄牛胎儿成纤维细胞产下了后代。
之后Vignon等(1999)重复了此实验,也获得产仔的结果。
后来相继得到了克隆山羊(Baguisietal.,1999;Keeferetal.,2002),克隆猪(Onishietal.,2000)和克隆兔(Chesneetal.,2002)。
(2)成体乳腺细胞:
Wilmut等(1997)从妊娠母羊乳腺中采取细胞,重复Campbell等(1996)的实验方法,成功获得了世界首例成年绵羊体细胞核移植后代—Dolly。
之后,Zakhartchenko等(1999a)用1头3岁的牛乳腺上皮细胞核移植得到了克隆牛。
(3)卵丘/颗粒细胞:
Wakayama等(1998)分离卵母细胞周围的卵丘细胞作为核供体细胞,不经培养直接作核移植,获得50多只克隆小鼠。
这是继“多利”后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。
之后也相继研究成功克隆牛(Katoetal.,1999;Wellsetal.,1999)、克隆山羊(Baguisi&Overstron,2000)和克隆猪(Polejaveaetal.,2000;Cabotetal.,2001)。
(4)卵管/子宫上皮细胞:
Kato等(1998)进行了输卵管上皮细胞核移植实验,核移植后共获得94枚融合胚,其中24枚发育到囊胚阶段,移植4枚胚胎,最后产下3头牛犊。
(5)肌肉组织的细胞:
法国科学家Bulter等(1998)、Vignon等(1998)报道了用胎儿肌肉细胞作供体得到了核移植牛。
而Shiga等(1999)采取2岁公牛肌肉细胞,传代培养至少4代,经血清饥饿法或不经血清饥饿法培养均产出牛犊。
(6)成体耳部成纤维细胞:
Kubota等(2000)用1头17岁老牛的耳缘皮肤成纤维培养传代至15代,用于核移植,得到了6头核移植牛犊。
之后,Park等(2002)采用成体耳部成纤维细胞也获得了克隆猪。
(7)睾丸支持细胞:
Ogura等(2000a)采用未成熟的小鼠睾丸支持细胞进行体细胞核移植而获得了克隆小鼠。
(8)小鼠尾尖细胞:
Wakayama和Yanagimachi(1999)采用成年小鼠的尾尖细胞得到了核移植后代。
接着Kato等(1999)和Ogura等(2000b)也分别得到了来自小鼠尾尖细胞的克隆小鼠。
(9)初乳的乳腺上皮细胞:
Kishi等(2000)用从初乳中分离出的乳腺上皮细胞作核移植获得了2只克隆牛。
综上所述,自体细胞核移植绵羊成功后,体细胞核移植后代已在牛(Katoetal.,1998)、小鼠(Wakayamaetal.,1998)、山羊(Bagsuisietal.,1999)和猪(Polejaevaetal.,2000;Onishietal.,2000)等动物上获得了成功,下面将对各动物种类的研究进展进行综述。
1.2.1小鼠
小鼠体细胞核移植研究所采用的方法与其它动物有所不同,在其它动物中所采用的方法是电融合法,小鼠上常用的方法是细胞质内注射法,即通过显微操作将供体细胞直接注入去核卵母细胞内。
1989年,Tsunoda等尝试将雄性小鼠的胎儿原始生殖嵴细胞移入去核的合子内,构建的重组胚大多未发育到囊胚。
1995年,Kato和Tsunoda的研究证明了胎儿生殖细胞具有发育的全能性或多能性。
接着Kimura和Yanagimachi(1995)和Sasagawa等(1998)的研究证明成熟个体的生殖细胞(初级、次级精母细胞)具有发育的全能性,其中Sasagawa等(1998)的移植胚胎经移植后出生了2只小鼠。
1998年,Wakayama等(1998)采用不经过培养的小鼠卵丘细胞作为核供体,直接注射给去核的卵母细胞,得到了10只可育的小鼠,这也是继“多莉”后第二批哺乳动物体细胞核移植后代,它的成功有力地支持Wilmut等(1997)的试验结果。
Wakayama等(1998)同时还进行了公鼠睾丸支持细胞和雌鼠神经细胞的核移植实验并获得了附植的结果,但均中途流产。
但是Ogura等(2000a)用来源于未成熟的睾丸支持细胞作供核进行细胞质内注射,获得了后代。
用小鼠尾尖细胞作供核,也获得了克隆小鼠(Wakayama&Yanagimachi,1999;Katoetal.,1999;Oguraetal.,2000b)。
其中值得一提的是,这次Ogura等(2000b)采用的是电融合方法获得克隆小鼠的。
1.2.2牛
在哺乳动物的体细胞核移植研究中,牛的核移植研究是当今的热点,并取得了重大进展。
早1995年,Delhaise等就用核移植方法证明来自牛雄性胎儿的原生殖嵴细胞在受体胞质内可以发生发育程序的重编,
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