新冠核酸检测技术PCR实验室质量体系文件第三部份项目类SOPWord下载.docx
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抱怨的处理程序
26-27
S0P_18-14
实验室记录的管理
28-29
S0P_18-15
实验室化学试剂的管理及配置标准操作程序
30-32
S0P_18-16
标本的采集、验收和保存的标准操作程序
33-35
S0P_18-17
标本与扩增板次唯一标识编号程序
36-36
S0P_18-18
实验室室内质量控制标准操作程序
37-38
S0P_18-19
实验室室间质量评价标准操作程序
39-39
SOP_18-20
新型冠状病毒核酸检测结果分析与报告管理及可疑、阳性结果讨论审签制度
40-48
S0P_18-21
新型冠状病毒核酸检测疑似阳性结果、可疑结果处置应急预案
49-53
第二部分仪器类SOP
S0P_18-22
移液器使用、维护与校准标准操作程序
54-55
S0P_18-23
移动紫外线消毒车使用、维护与校准操作程序
56-56
S0P_18-24
传递窗操作程序
57-57
S0P_18-25
生物安全柜使用、维护与校准操作程序
58-60
S0P_18-26
CleancubeMini过氧化氢空间消毒器使用、维护与校准操作程序
61-64
S0P_18-27
台式高速冷冻离心机使用、维护与校准操作程序
65-66
S0P_18-28
高压蒸汽灭菌器使用、维护与校准标准操作程序
67-68
S0P_18-29
超净工作台使用、维护与校准标准操作程序
69-69
S0P_18-30
旋涡振荡器使用与维护标准操作程序
70-70
S0P_18-31
冰箱使用、维护与校准操作程序
71-72
S0P_18-32
天隆GeneRotex96全自动核酸提取仪使用、维护与校准程序
73-74
S0P_18-33
MA-6000基因扩增检测仪使用、维护、校准程序
75-81
S0P_18-34
优思达UC0102核酸扩增检测分析仪使用、维护、校准程序
82-84
第三部分项目类SOP
S0P_18-35
临床标本的处理(核酸纯化)程序
85-86
S0P_18-36
新型冠状病毒2019-nCoV基因(达安红盒)扩增检测操作规程
87-92
S0P_18-37
新型冠状病毒2019-nCoV基因(金豪)扩增检测操作规程
93-97
S0P_18-38
新型冠状病毒2019-nCoV基因(之江)扩增检测操作规程
98-103
S0P_18-39
优思达新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测操作程序
104-106
SOP_18-40
新型冠状病毒2019-nCoV基因(中元)扩增检测操作规程
107-111
文件审批者;
发布日期:
年月曰
S0P_18-35临床标本的处理(核酸纯化)程序
1. 目的
保证标本处理标准化、规范化,使不规范操作因素对实验结果造成的影响减至最小。
2. 范围
新冠病毒核酸提取。
3. 职责
新冠病毒标本检测项目的工作人员按此文件操作执行。
4.工作流程
4.1接收样本
在接收样本前,检测人员需要按照三级防护标准穿戴好,穿着防护衣、护目镜、隔离衣,并戴上N95口罩、双层手套,穿上靴套等。
然后用75%的乙醇对实验室内的生物安全柜的空间和台面以及核酸提取仪等进行消毒,还需对标本转运箱进行消毒,并核对被检样本姓名、性别、年龄、编号及检测项目等,待确认转运箱完好后将其放入生物安全柜。
4.2病毒灭活
已经使用含服盐的灭活型标本采样管的实验室,这一环节无需进行灭活处理,直接进行核酸提取,而使用非灭活型标本采样管的实验室,则有56°
C孵育30分钟热灭活的处理方式,病毒灭活后为避免开盖后气溶胶污染实验室和检测人员,常温静置15分钟以上再执行下一步操作。
4.3核酸提取
1) 标本操作人员穿戴三级防护用品,在生物安全柜内将离心管依次编号。
2) 取出病毒提取试剂,对应标本编号。
3) 用旋涡混匀器对标本进行混匀,把可能含有病毒核酸的细胞从拭子标本中洗脱下来。
4) 在生物安全柜当中,一人开盖,一人加样,用移液器加混悬液200uL标本到提取液当中。
5) 裂解10分钟。
6) 把裂解好的核酸提取盒放入半自动核酸提取仪当中,按预先设置好的程序提取核酸。
7) 核酸提取完成后在生物安全柜内,将提取的核酸加至PCR扩增反应体系。
4.4核酸分析,等待结果
在生物安全柜内,将提取的核酸加至PCR扩增反应体系,然后将构建好的扩增体系放入扩增仪,进行核酸扩增后分析。
4. 5消毒,废物处理
一系列步骤完成后,需要对实验废物进行处理,并对实验仪器、桌面、地面进行消毒。
待检测结果出来后,对检测到的阳性、可疑阳性样本按SOP_18-20《新型冠状病毒核酸检测结果分析与报告管理制度》、S0P_18-21《新型冠状病毒核酸检测疑似阳性结果、可疑结果处置应急预案》进行处置。
5相关记录
5. 1YCXZYY/JYK-JL-SOP_18-35-01附表21PCR实验室流程图
S0P_18-36新型冠状病毒2019-nCoV基因
(达安红盒)扩增检测操作规程
1. 名称
新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)
2. 目的
规范新型冠状病毒(2019-nCoV)RNA荧光定性PCR项目检测试验,确保检测结果的准确性和重复性。
3. 方法
TaqMan探针实时荧光定性。
4. 检测原理
基于一步法RT-PCR技术,选取2019新型冠状病毒(2019-nCoV)ORFlab和N基因作为扩增靶区域,设计特异性引物及荧光探针(N基因探针采用FAM标记,ORFlab探针采用VIC标记)用于标本中2019新型冠状病毒RNA的检测;
同时包括内源性内标检测系统(内标基因探针采用Cy5标记),用于对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程的监控,可减少假阴性结果的出现。
5. 样品
咽拭子、痰液等
6. 试剂
中山大学达安基因股份有限公司
组分名称
规格
数量
主要成分
PCR检测试剂
(大包装,96人份/盒)
2019-nCoVPCR反应液A
918HL/管
2
特异性引物、探针、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液
2019-nCoVPCR反应液B
204M-L/管
热启动Taq抗体酶、Taq酶、OMMLV酶、dNTPs、UDG酶、RNasin
2019-nCoV阴性质控品
450ML/管
含2019-nCoV内标片段
(RNaseP基因)的假病毒、TE
NC(ORFlab/N)阳性质控品
400ul/管
含2019-nCoV目的片段的假病毒、含2019-nCoV内标片段(RNaseP基因)的假病毒、TE
7.仪器
苏州雅睿生物技术有限公司MA-6000实时荧光定量PCR仪。
8.操作步骤
8.1PCR试剂准备(I区)
8.1.1从试剂盒中取出2019-nCoVPCR反应液A、2019-nCoVPCR反应液B,室温融化后振荡混匀,掌上离心机离心10秒后使用。
8.1.2取N个(N=待测样本个数+NC(0RFlab/N)阴性质控品+NC(ORFlab/N)阳性质控品)PCR反应管将各组分充分混合后进行短时离心,以使管壁上的液体全部离心至管底,之后将20ul扩增体系分装到PCR管中。
将装有PCR反应液的PCR管置I区〜II区传递窗。
NC单人份扩增体系配制如下表:
扩增体系
17ul
3ul
20ul
8.1.3试剂准备区清洁:
每次完成配液操作后,用75%的酒精清洁实验室台面,用2000mg/L含氯消毒剂清洁实验室地面,打开实验室紫外线,人员退出实验室。
8.2核酸模板提取(II区)
核酸提取:
取200ul液态样本进行核酸提取。
采用西安天隆科技有限公司提供的核酸提取或纯化试剂盒;
具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。
8.3加样(II区)
在配制好体系的PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、待测标本核酸、阳性质控品、弱阳性质控品各5ul,盖紧管盖,6,OOOrpm离心数秒后,置II区〜III区传递窗。
标本制备区清洁:
每次完成试验操作后,医疗垃圾用2000mg/L含氯消毒剂喷洒至完全湿润,用鹅颈式封扎,带出二区高压处理后按规范处置。
用75%的酒精清洁实验室台面,用2000mg/L含氯消毒剂清洁实验室地面,打开实验室紫外线,人员退出实验室。
8.4PCR扩增检测(III区)
8.4.1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。
8.4.2循环参数设定:
序号
步骤
{皿反
时间
循环数
1
反转录反应
50°
C
2分钟
循环1次
预变性
95°
3
变性
5秒
循环10次
退火、延伸
60°
35秒
4
循环32次
退火、延伸及检测荧光
8.4.3样品设置
在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型。
9. 结果分析
选择定性分析模式,自动调整阈值,必要时可手工设定,以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值不出现任何数值为准,也可根据仪器的实际情况进行调整。
10. 质控标准
10.12019-nCoV阴性质控品:
FAM和VIC检测通道无Ct值或无明显扩增曲线,
Cy5通道Ct<25;
10.22019-nCoV阳性质控品:
FAM和VIC检测通道Ct值<22;
10.3以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行。
10.4每批上样检测应当在剩余加样孔中设置1个弱阳性质控样本和三个阴性质控样本(2份
生理盐水和1份阴性混合样本)。
3份阴性质控样本随机放在临床样本中间。
弱阳性质控
测定为阳性,3个阴性质控全部测定为阴性,视为在控。
反之,则为失控,不可发出报
告,应分析原因,必要时重新检测样本。
11.结果判断
FAM通道(green)
N基因
VIC通道(yellow)
ORFlab基因
Cy5通道(Red)内标(RNaseP基因)
结果判定
Ct值>30或无Ct值
Ct值W30
阴性
有或无扩增曲线
阳性
复检:
内标Ct值>30或无扩增曲线样本需重新取样检测;
内标Ct值W30样本可对已提取核酸重新检测或重新取样检测
Ct值>30
或无Ct值
Ct值>30或无扩增曲线
复检结果判读如下:
(1) 、FAM通道或VIC通道复检结果阳性(Ct值s£
30),Cy5通道为阳性(Ct值@30),可
判样品为新型冠状病毒2019-nCoV阳性;
(2) 、FAM通道和VIC通道复检均为阴性(Ct值>30,或无Ct值),Cy5通道为阳性(Ct值
W30),可判样品为新型冠状病毒2019-nCoV阴性;
(3) 、FAM通道、VIC和Cy5通道复检均为阴性(Ct值>30,或无Ct值),需再次重新取
样进行检测。
【阳性判断值】
根据临床样本检测结果,利用ROC曲线法最终确定本试剂盒的目标基因N和ORFlab阳性判断值为30,内标基因RNaseP阳性判断值为30。
【检验结果的解释】
(1) 、每次实验均需检测阴性质控品,阳性质控品,质控品结果满足质量控制要求时方可进行
检测结果的判定;
(2) 、FAM和VIC检测通道为阳性时,由于体系的竞争关系,Cy5通道(内标通道)结果可能
为阴性;
(3) 、报告建议采用以下格式:
阴性结果报告格式为:
新型冠状病毒2019-nCoVRNA阴性;
阳性结果报告格式为:
新型冠状病毒2019-nCoVRNA阳性。
【检测方法的局限性】
(1) 、性结果也不能排除新型冠状病毒感染,需要排除可能产生假阴性的因素,包括:
样本质
量差;
技术本身存在的原因,如病毒变异、PCR抑制等。
(2) 、样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存质量有关,不合理的样本采集、转运、储
存及处理过程均有可能导致错误的检测结果;
(3) 、样本处理时没有控制好交叉污染,可能出现假阳性结果;
(4) 、病毒在流行过程中的基因突变则可能导致假阴性结果;
(5) 、试剂盒的检测结果仅供临床参考,对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其它
实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
12.性能指标(厂家提供)
12.1本试剂盒的分析灵敏度为500copies/mL;
检测国家灵敏度参考品S,符合要求。
12.2交叉反应:
与新型冠状病毒种属相近或引起症状相似的其他病原体(如甲型流感病毒(H1N1、H1N1(2009)>
H3N2、H5N1、H7N9),乙型流感病毒(B/Yamagata、B/Victoria),副流感病毒(I型、II型、m型),呼吸道合胞病毒(A型、B型),鼻病毒A,鼻病毒B,鼻病毒C,腺病毒(1型、2型、3型、4型、5型、7型、55型),肠道病毒(A型、B型、C型、D型),人偏肺病毒,EB病毒,麻疹病毒,人巨细胞病毒,轮状病毒,诺如病毒,腮腺炎病毒,水痘一带状疱疹病毒,肺炎支原体,肺炎衣原体,军团菌,百日咳杆菌,流感嗜血杆菌,金黄色葡萄球菌,肺炎链球菌,化脓性链球菌,肺炎克雷伯杆菌,结核分枝杆菌,烟曲霉,白色念珠菌,光滑念珠菌,新生隐球菌,冠状病毒(NL63,0C43,HKU1,229E),SARS冠状病毒和MERS冠状病)以及人基因组DNA无交叉反应。
12.3外源性干扰物质:
样本中存在新型冠状病毒的治疗药物,如苯福林(100ug/mL)、羟甲哩琳(100ug/mL),氯化钠(0.9%)、倍氯美松(100ug/mL),地塞米松(100ng/mL)、氟尼缩松(100ng/mL)、曲安奈德(100ng/mL)、布地奈德(100ng/mL)、莫米松(100Ug/mL)、氟替卡松(100ug/mL)、盐酸组胺(lOOlig/mL)、干扰素(300U/mL)、扎那米韦(100ug/mL),利巴韦林(100ug/mL),奥司他韦(100ug/mL),帕拉米韦(100Pg/mL)、洛匹那韦(100ug/mL)>
莫匹罗星(100ug/mL)、左氟沙星(100ug/mL)、阿奇霉素(100ug/mL),妥布霉素(100ug/mL),利托那韦(100ng/mL)、美罗培南(100Pg/mL)、阿比多尔(100yg/mL)>
头抱曲松(100ug/mL)对试剂盒的检测结果无干扰。
12.4咽拭子和痰液样本中可能存在的内源性物质如全血(10%)和粘液(20ug/mL)对试剂盒的检测结果无干扰。
12.5精密度:
强阳性样本批内/批间精密度,日内/日间精密度,不同操作者之间的精密度变异系数均不大于5%;
检测国家参考品R精密度变异系数小于5%。
12. 6阳性参考品符合率:
5份企业阳性参考品符合率均为100%;
检测国家参考品P1-P7,符
合要求。
12.7阴性参考品符合率:
10份企业阴性参考品的符合率均为100%;
检测国家参考品N1-N22为阴性。
12.8临床评价:
在3家临床机构完成604例样本的临床试验,与已上市的同类试剂相比:
阳性符合率为97.64%,阴性符合率为99.71%,总符合率为98.84%。
13. 生物参考区间
阴性。
14. 干扰反应(或污染源)
14.1样本之间污染。
14.2试剂、耗材(如Tip头)、设备(移液器、离心机、扩增仪等)污染。
14. 3产物及其他质粒污染。
15. 安全防护措施
具体请参见《新冠核酸检测质量与安全管理手册》、《生物安全管理手册》。
16. 临床意义
体外定性检测新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的咽拭子、痰液样本中、新型冠状病毒(2019-nCoV)ORFlab和N基因。
该检测可用于2019年12月以来,新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的肺炎疫情期间,相关病例的辅助诊断和此次疫情的体外诊断应急储备。
17. 相关文件
17. 1新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)产品说明书。
17. 2全国临床检验操作规程(第4版)。
17. 3《新冠核酸检测质量与安全管理手册》
17.4《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》
17.5《医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明》(CNAS)
17.6《生物安全管理手册》
18. 相关记录
18. 1YCXZYY/JYK-JL-SOP_18-17-01附表16可接受标本记录表
18. 2YCXZYY/JYK-JL-SOP_18-17-02附表17拒收标本记录表
18. 3YCXZYY/JYK-JL-S0P_18-35-01附表21PCR实验室流程图
S0P_18-37新型冠状病毒2019-nCoV基因
(金豪)扩增检测操作规程
新型冠状病毒(2019-nCoV)RNA
根据荧光PCR技术原理,针对2019-nCoV目的基因ORFlab与N基因设计特异性引物和
Taqman探针,通过荧光PCR检测仪进行检测,从而实现对2019-nCoV的定性检测。
试剂盒以正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶P(RNaseP,RNP)的mRNA为正常人体细胞对照,对提取和检测过程进行监控。
北京金豪制药股份有限公司,新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)
成分
规格48T
2019-nCoV
ORFlab/N反应液
0.9mL/管
1管
含dNTPs、MgC12>
2019-nCoV的ORFlab/N基因及
RNP特异性PCR引物和荧光探针的混合液
酶混合液
100ul/管
逆转录酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制剂
阴性对照
1.OmL/管
无核酸水
阳性对照
200ul/管
含ORFlab基因、N基因、RNP的假病毒混合物
7. 仪器
8. 操作步骤
8. 1PCR试剂准备(I区)
8.1.1从试剂盒中取出2019-nCoVORFlab/N反应液、酶混合液,室温融化后振荡混匀,掌上离心机离心10秒后使用。
8.1.2取N个小=待测样本个数+阴性对照品+阳性对照品)PCR反应管将各组分充分混合后进行短时离心,以使管壁上的液体全部离心至管底,之后将20ul扩增体系分装到PCR管中。
将装有PCR反应液的PCR管置I区〜II区传递窗,传递至标本制备室,如不能尽快使用,可暂放与4度冰箱冷藏,2小时内用完。
PCR检测混合液
RT-PCR酶
18ul
2ul
采用西安天隆科技有限公司提供的核酸提取或纯化试剂盒陕西械备20140007号;
在配制好体系的PCR反应管中分别加入处理后的阴性对照品、待测标本核酸、阳性对照品各5ul,盖紧管盖,8,OOOrpm离心数秒后,置II区〜III区传递窗。
8.4PCR扩增检测(III区)
8.4.2循环参数设定:
反应温度
是否采集荧光
逆转录及变性
30分钟
否
95°
3分钟
扩增及荧光收集
10秒
40
55°
30秒
是
8. 4.3样品设置
9. 基线和阈值设定
基线通常按照仪器自动设置的基线即可。
基线调整原则:
选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域,起点(Start)避开荧光采集起始阶段的信号波动,终点(End)比最早出现指数扩增的样本Ct/Cq值减少1-2个循环。
阈值设定原则为阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最局点。
10. 1每批上样检测应当在剩余加样孔中设置1个弱阳性质控样本和三个阴性质控样本(2份
弱阳性质控测定为阳性,3个阴性质控全部测定为阴性,视为在控。
反之,则为失控,不可发出报告,应分析原因,必要时重新检测样本。
10.2每次试应应设置阳性对照和阴性对照,且符合以下要求,否则试验结果不成立。
10.2.1阴性对照:
无Ct值。
10.2.2阳性对照:
CT值小于33.0。
10.2.3内参:
小于等于3
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