碱性蛋白酶改性豌豆蛋白的起泡性能研究Word格式文档下载.docx
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2.1.2主要实验仪器-7-
2.2实验方法-8-
2.2.1基本组成成分的测定-8-
2.2.2碱性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉-8-
2.2.3起泡性的测定-9-
2.3实验设计-9-
3实验结果与讨论-9-
3.1单因素结果与分析-9-
3.1.1加酶量E/S(W/W)-9-
3.1.2底物浓度-10-
3.1.3酶解时间-11-
3.1.4温度影响-12-
3.1.5PH影响-12-
3.2响应面实验设计与结果-13-
3.2.1实验结果回归分析-14-
3.2.2响应面实验优化分析与结果-16-
致谢-21-
参考文献-22-
1引言
1.1本课题研究的目的和意义
在近几年中,植物蛋白质在新的食品或者传统食品构成中,都得到重视和研究[1]。
我国人口众多,蛋白质资源不足,充分利用农副产品加工工业中的大量副产物作为新蛋白质资源进行开发加工制成有价值的产物,已成为一项解决我国蛋白质资源不足的长期战略任务[2]。
蛋白质由于是氨基酸组成的,供人体生长,提供食品的功能特性,所以是必不可少的食物成分[3]。
但由于大多数豆类蛋白质的分子量大,分子内部结构复杂,使得豆类蛋白的消化率远不及牛奶等动物蛋白[4]。
随着国民经济的发展及膳食结构的合理化,不断应用新技术改造食品传统加工工艺已成为势不可挡的局面[5]。
植物蛋白质资源的综合开发利用一直是蛋白质利用研究的重点[6]。
基于消费者对安全的考虑和饮食文化,蛋白质工业向植物蛋白转变[7]。
因为在食品和非食品领域都有需求,植物蛋白产品正在蓬勃发展[8]。
食品趋势中更多的局限于大豆蛋白仅仅是因为关于其它植物蛋白研究的较少[9]。
为了深度开发豌豆蛋白质资源和提高产品附加值,豌豆蛋白质功能特性的研究显得十分必要。
豌豆经分离去除淀粉后,残夜浓缩后得到豌豆蛋白质,它具有很高的营养价值,蛋白质含量在63%-68%之间,氨基酸含量大于60%,具有较高的消化吸收率(大于80%),作为食品添加剂可替代部分肉蛋白用于食品加工中,如火腿肠,香肠等加工中[10]。
蛋白质改性的发展方向主要为采用新的酶类在分子层面改性修饰蛋白质,强化某些需要的特性,以获得具有特殊功能的专用型蛋白质[11]。
蛋白质的起泡性质是食品所需的一个非常重要的功能特性,搅打或起泡过程,包括气泡在固相或半固相中的分散及稳定,可以是食品材料中产生气孔结构,是食品加工过程中的一个单元操作。
起泡操作一般用于制作轻质食品,并通过改变内聚力及柔韧性等方面来改进食品的表观及质地,起泡操作利用零成本的空气作为原料,已经制作出了很多适合消费者选择的食品,食品的起泡性质不仅取决于气体膨胀率及泡沫大小分布,还与气泡的微观结构及主体与气相界面组分的分散度有关[12]。
蛋白质的功能性质一般是指能使蛋白质成为人们所需要的食品特征而具有的物理化学性质,即对食品的加工,贮藏,销售过程中发生作用的那些性质,这些性质对食品的质量及风味起着重要的作用,蛋白质的功能性质与蛋白质在食品体系中的用途有着十分密切的关系,是开发和有效利用蛋白质资源的重要依据。
因为食品加工影响食品的功能和营养,选择先进的技术和条件研究蛋白质在是必须的[13]。
蛋白质分子构想作用力包括氢键,疏水作用,二硫键以及静电相互作用等[14]。
蛋白质的功能性质可分为水化性质,表面性质,蛋白质-蛋白质相互作用的有关性质三个主要类型,主要包括有吸水性,溶解性,保水性,分散性,黏性和粘结性,乳化性,起泡性,凝胶作用,调色性。
1.2国内外研究现状
目前,豌豆蛋白质提取以及功能特性研究的文献报道较少,陈宝江等人研究了豌豆蛋白作为饲料蛋白源的可行性,为了更好的利用豌豆蛋白质和提高产品附加值,豌豆蛋白质功能特性的研究显得十分必要。
本实验首次从蛋白酶浓度,底物浓度,酶解时间,温度,PH等方面对豌豆蛋白质起泡性(FAI)和泡沫稳定性(FSI)两个方面进行系统研究。
1.3主要研究内容
1.3.1酶解对蛋白质的影响
酶解主要引起蛋白质三个方面的变化:
1极性基团如氨基和羧基数目增加,从而使蛋白质与水的作用得以加强;
2多肽链平均分子量降低;
3蛋白质分子构想发生变化。
这三个作用均有利于蛋白质在水中的溶解。
1.3.2蛋白质的起泡性与泡沫稳定性
蛋白质的起泡性包括气泡能力和泡沫稳定性,其中起泡能力是指蛋白质在加工中体积的增加率,即形成泡沫的能力,而泡沫稳定性是指泡沫产生后的稳定能力,即泡沫的寿命,溶液起泡的主要机理是因为液相表面张力的降低,蛋白质类起泡剂能降低表面张力的能力有限,但是它可以形成具有一定机械强度的薄膜,这是因为蛋白质分子之间除了范德华力外,分子中的羧基与氨基之间有形成氢键的能力。
生成的这种膜能够有效降低液相的表面张力,从而形成稳定的泡沫。
不过蛋白质溶液要形成气泡,还首先应充分溶解蛋白质,使到达气泡表面的蛋白质浓度提高,这样才能最终使膜生成。
蛋白质的起泡性与蛋白质浓度,PH值及温度有关,比如大豆蛋白,以偏碱性的PH值为有利,一般最佳发泡温度为30摄氏度。
如大豆分离蛋白丰富的性能和品质,所以其在食品组成中更有研究吸引力[15]。
脂质的存在对蛋白质的起泡有不利的影响,而糖类则可提高粘度,增加泡沫的稳定性。
常见的蛋白质的功能特性改善技术有:
物理改性,酰化作用,磷酸化作用,脱氨基作用,糖基化作用,共价交联作用,蛋白质水解作用。
物理改性是利用加热,机械作用,高频振荡等方式来改变蛋白质的物理性质[16]。
1.3.3蛋白质改性的两大技术与优缺点
蛋白质水解作用又可以分为非酶法和酶法两大类,非酶法是最常使用的改性技术,由于其反应简单,应用广泛和效果显著的特点而倍受欢迎,但是非酶法也存在着反应条件苛刻,试剂专一性不强,最终产品中出去未反应试剂较困难等不足之处,酶法改性已有了很大的发展,酶促反应速度快,条件温和,专一性强,更重要的是一些低廉生物酶的出现,酶法反应通常为湿法反应,生产成本高[17]。
但是不破坏氨基酸结构,产生有害物质的可能性小,安全性高,水解产物是小分子肽和氨基酸,易为人体消化,吸收,也更适于食品加工领域的应用[18]。
1.3.4蛋白质的功能特性与结构的关系
豆类蛋白的功能特性与其结构有关,即氨基酸组成,排列顺序,构象,分子的形状和大小,电荷分布以及分子内和分子间键的作用,高比例的极性残基影响肽链间相互作用,水化作用,溶解性和表面活性,疏水性相互作用在在蛋白质三级折叠中相互作用,影响乳化作用,起泡性和风味结合能力,带电氨基酸能增强静力相互作用,起到稳定球蛋白,巯基能被氧化形成二硫键,硫醇和二硫化物的相互转化会影响流变特性,共价键和非共价键的性质和数量决定了蛋白质的大小,形状,表面电荷,所有这些性质又受PH,温度等环境因素及加工处理的影响。
1.3.5蛋白质泡沫的定义与影响因素
蛋白质的泡沫主要由蛋白质溶液包裹着的小气泡群体组成,溶液受到急速的机械搅拌时,有大量的气体混入,形成许多水-空气界面,蛋白分子吸附到这些界面上,降低界面张力,促进界面形成,所谓的稳定性,就是指泡沫形成以后能保持一定时间,并具有一定的抗破坏能力。
所以蛋白质可否作为良好的起泡剂取决于以下两个方面的能力,即蛋白质迁移至界面的速率和其形成稳定膜的能力[19]。
最后在稳定的泡沫体系中,蛋白质多肽链相互作用缔合形成连续的分子间聚合物,包围空气泡。
此泡沫是由液态连续相包裹空气分散相所形成,PH值,能量供应和溶质的存在都会影响蛋白的起泡能力[20]。
2实验材料和方法
2.1实验材料
2.1.1主要实验材料与试剂
豌豆蛋白粉:
山东健源食品有限公司。
碱性蛋白酶:
Alcalase2.4LFG,诺维信中国投资有限公司。
十二水合磷酸氢二钠(分析纯),柠檬酸(分析纯)。
2.1.2主要实验仪器
箱式电阻炉SX-2.5-10型上海实验电炉厂
全自动定氮仪2300福斯特卡托公司(瑞典)
电子分析天平AY-120日本岛津制作天平所
磁力加热搅拌器78-1江苏省金坛市医疗仪器厂
电热恒温水浴锅HH-S北京中兴伟业仪器有限公司
精密PH计PHS-3C型上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂
电热鼓风干燥箱101型北京市永光明医疗仪器厂
恒温振荡器CHA-S金坛市华峰仪器有限公司
离心机LDA-2北京医用离心机厂
高速切乳化机FA25上海弗鲁克液体机械制造有限公司
2.2实验方法
2.2.1基本组成成分的测定
水分含量的测定:
按GB5009.3—2010直接干燥法测定
灰分含量的测定:
按GB5009.4—2010灼烧称重法测定
粗脂肪含量的测定:
按GB5009.5-2003索氏抽提法测定
粗蛋白含量的测定:
按GB5009.5—2010凯氏定氮法测定
缓冲溶液的配制如下:
表一磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(1/15mol/L)的配制
pH
1/15mol/LNa2HPO4
1/15mol/LKH2PO4
4.92
0.10
9.90
5.91
1.00
9.00
6.98
6.00
4.00
8.04
9.50
0.50
8.98
10.00
1/15mol/LNa2HPO4的配置:
取23.876gNa2HPO4·
12H2O溶于蒸馏水后定容至1000mL;
Na2HPO4·
12H2O分子量=358.14。
1/15mol/LKH2PO4的配置:
取9.073gKH2PO4溶于蒸馏水后定容至1000mL;
KH2PO4分子量=136.09。
豌豆蛋白的基本成分组成
表二豌豆蛋白粉的基本成分组成及含量(%)
总蛋白
粗脂肪
水分
灰分
氮溶指数
76.38
1.64
5.86
23.68
2.2.2碱性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉
采用碱性蛋白酶(Alcalase)对豌豆蛋白进行酶解,准确称取一定量的豌豆蛋白粉于锥形瓶中,加入一定pH的缓冲溶液,放入事先调好温度的恒温振荡箱中振荡溶解20min;
按一定的酶与底物质量之比(E/S)添加酶,在恒温振荡器中酶解一定时间;
将锥形瓶置于沸水中灭酶10min,自来水冷却;
定容,离心(4000r/min,10min),取上清液待用。
2.2.3起泡性的测定
用移液管量取上清液20mL于100mL小烧杯中,用高速切乳化机以10000r/min的速度搅打2min后立即转入量筒中,分别记录0min时和30min后的泡沫体积V1和V2,按下式计算:
起泡能力=均质停止时泡沫体积(V1)/搅打前液体体积×
100%
泡沫稳定性=均质停止后30min泡沫体积(V2)/均质停止时泡沫体积(V1)×
2.3实验设计
采用碱性蛋白酶水解豌豆蛋白,探讨加酶量、酶作用时间、底物浓度、酶作用温度、pH对豌豆蛋白起泡能力及泡沫稳定性的影响。
在单因素试验的基础上,利用响应面分析法(responsesurfacemethodology,RSM)中的Box-Behnken软件对水解条件进行优化,进一步研究各个因素及其交互作用对豌豆蛋白起泡能力及泡沫稳定性的影响,建立响应面模型的回归方程并对每一个系数的显著性进行统计分析。
3实验结果与讨论
3.1单因素结果与分析
3.1.1加酶量E/S(W/W)
底物浓度4%,30min,50℃,pH8.0的前提下,采用0.00%,0.04%,0.08%,0.12%,0.16%,0.20%的酶浓度,在底物浓度、酶解温度、pH值等其它因素不变的情况下,增大碱性蛋白酶用量增加,豌豆浓缩蛋白的起泡能力及起泡的稳定性逐渐增加,当加酶量达到0.16%时,起泡性与泡沫稳定性达到最大值,随后开始慢慢减小。
这可能是由于有限酶的催化水解使蛋白质分子柔性增加,疏水基团充分暴露,因而使蛋白质分子能迅速吸附至气—水界面,并随即将界面张力下降至低水平能力,增强了起泡性。
然而,由于低分子质量肽不能在界面形成具有黏附性质的膜,因而过度的水解会损害起泡能力,当酶用量达到一定程度后,由于底物浓度不能对酶达到饱和,导致酶的作用受到抑制,酶用量的增加不能再提高起泡性。
如图1所示,
图一加酶量对起泡性与泡沫稳定性的影响
3.1.2底物浓度
采用2%,4%,6%,8%,10%的底物浓度,豌豆蛋白在酶浓度、酶解时间、酶解温度、pH值不变的条件下,在较低底物浓度时,随着底物浓度增加,起泡性和起泡稳定性逐渐增大。
这可能因为随着底物浓度的增加,使蛋白液表面的浓度提高,从而增加了亲水基团和疏水的非极性基团,增大了蛋白酶与底物蛋白分子肽键的接触机会,使得气泡易于形成,提高了蛋白质的起泡性。
当底物浓度增加达到8%时,起泡性与泡沫稳定性达到最大值,随后当底物浓度继续增大时,起泡能力开始呈现下降趋势,这可能是因为底物浓度较大时,在不断受热的情况下,小分子进一步聚合形成可溶性的聚合多肽,界面张力增加,起泡性逐渐减小。
如图二所示
图二底物浓度对起泡性与泡沫稳定性的影响
3.1.3酶解时间
分别采用10分钟,20分钟,30分钟,40分钟,50分钟,60分钟的酶解时间试验,在酶浓度、底物浓度、酶解温度、pH值不变的情况下,随着酶解时间的延长,起泡能力随之变大,当达到30分钟时,起泡能力与泡沫稳定性达到最大值,而后起泡能力逐渐减小,达到最弱。
在酶解初期,由于豌豆蛋白质分子中的—NH2、—COOH之间形成的氢键数目增多,形成的薄膜具有足够的黏性和机械强度,使得豌豆蛋白的起泡性增加。
随着酶解过程的进行,—NH2、—COOH的数目不断增加,电荷数目也随之增加,当增加到一定程度后,气液薄膜强度降低,泡沫易破裂,起泡性也随之降低。
如图三所示:
图三酶作用时间对起泡性与泡沫稳定性的影响
3.1.4温度影响
分别采用30℃,,40℃,50℃,60℃,70℃的酶作用温度进行试验,随着酶解温度的升高,起泡性和起泡稳定性逐渐增大,当温度达到50℃时,豌豆蛋白的起泡能力及起泡稳定性最好,随着温度的继续升高,起泡性又逐渐减小,这可能是因为酶都有自己的最适温度,超过这一温度,酶就会变性。
如图所示
图四酶作用温度对起泡性与泡沫稳定性的影响
3.1.5pH影响
分别采用pH5,pH6,pH7,pH8,pH9作为酶作用pH值进行试验,在pH逐步增加的时候,豌豆蛋白气泡能力与泡沫稳定性逐步增强,在pH8时,达到最大值,而后随着pH值的进一步增加,起泡能力与泡沫稳定性慢慢减弱,pH值主要是通过改变蛋白质功能基团的电离作用和双电层厚度来影响蛋白质与蛋白质的相互作用,最终来影响凝胶强度的变化。
在近等电点处,蛋白质通常形成结块状凝胶;
在极端pH值处,由于强烈的静电排斥作用,蛋白质则形成弱凝胶。
如图五所示
图五PH对起泡性与泡沫稳定性的影响
3.2响应面实验设计与结果
根据单因素的实验结果,起泡性随底物浓度的增加,变化趋势较缓,所以我们固定底物浓度为8%,考虑加酶量、时间、温度、pH值四个因素之间的相互作用对酶解反应的影响。
本实验以起泡活性和起泡稳定性为响应值,设计四因素三水平共29个实验点的响应分析实验,在此基础上得出各因素之间的最佳组合。
实验设计及结果见下列表格:
表6响应面实验设计与结果
序号
加酶量/%
时间/min
温度/℃
FAI
FSI
1
0.16
30
9
50
255.5
44.68
2
0.2
7
55
262.0
54.30
3
20
8
267.5
50.69
4
0.12
250.0
44.80
5
40
261.5
56.81
6
254.5
54.33
325.5
69.13
262.5
49.61
246.5
46.22
10
60
264.0
51.13
11
261.0
48.81
12
275.0
58.90
13
263.5
53.38
14
62.94
15
269.0
47.25
16
266.5
55.18
17
325.0
63.73
18
268
57.72
19
260
53.25
51.81
21
264
53.59
22
247.5
43.63
23
52.80
24
63.96
25
329
63.22
26
251
46.81
27
268.5
55.40
28
263
52.97
29
279.5
56.74
3.2.1实验结果回归分析
运用DesignExpert6.0.5软件对29个试验点的响应值进行回归分析,各因素的方差分析见表
表7起泡能力方差分析表
Source
SumofSquares
DF
MeanSquare
FValue
Prob>
F
显著性
Model
18451.19
1317.94
1241.11
<
0.0001
**
A
58.52
55.10
B
28.52
26.85
0.0001
*
C
3.52
3.31
0.0901
D
88.02
82.88
A2
5544.85
5221.61
B2
5979.77
5631.17
C2
10307.15
9706.28
D2
5264.02
4957.15
AB
12.25
11.53
0.0043
AC
264.06
248.66
AD
121.00
113.94
BC
210.2
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