荧光定量操作.docx
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荧光定量操作
样品取回后,冻于-70冰箱中。
样品包括组织样和血清样品。
检查目的基因的表达情况。
需要作的工作如下:
1、首先是组织总RNA的提取。
提取步骤见TRNZOL试剂说明书。
2、组织mRNA提取后进行反转录,得到cDNA样品。
3、以CDNA样品为模板进行特定基因的扩增(可先用普通PCR验证/为了验证表达的差异,应采用定量PCR,并选用内参基因)
注意:
为了让提取的RNA质量可靠,每次研磨的组织样品不能过多,这就要求我们在取样是不能取太多的样品,而且所取样品必须准确、可靠。
否则会导致后续试验都不准确。
一.总RNA提取准备工作:
、
(一)基本器材和试剂
1.实验器具与材料
(1)移液枪:
1ml、200ul、10ul
(2)枪头:
1ml、200ul、20ul
(3)枪头盒:
1ml一个,200ul和20ul的枪头盒至少一个
(4)EP管1.5ml、100ul
(5)研钵:
据一次提取RNA样品多少定.
(6)容量瓶:
1000ml
(7)盐水瓶:
100ml
(8)广口瓶几个(配75%乙醇,盛放氯仿,异丙醇等用)
2.实验器具的处理与准备
(1)塑料制品:
(包括吸头、EP管等)将塑料制品逐个浸泡于0.1%DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压锅灭菌(121-126℃)至少30分钟,后在60-70℃烘烤箱中烘干,试验前将枪头放入枪盒。
优级耗材可直接使用。
(2)玻璃制品:
(主要是玻璃研磨器)先泡酸过夜,冲洗干净后,在0.1%DEPC水中泡8小时左右(过夜),37℃烘干,用蒙锡纸包裹送至干烤(100-200℃)3次。
(3)金属制品:
(镊子等)先洗干净,再送干烤3次。
(不需要泡DEPC水)
3.试剂配制和准备
(1)DEPC水:
泡实验器具的DEPC水的配制:
1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。
DEPC处理水的配制:
100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压去除未反应的DEPC。
(2)75%乙醇(最好在抽提时现配):
用无水乙醇和DEPC水配制(DEPC水:
无水乙醇=1:
3),然后放于-4℃预冷备用。
(3)异丙醇:
放入棕色瓶。
(4)氯仿:
放入棕色瓶。
(5)Trizol:
100ml/瓶存放于4℃。
4.抽提RNA工作台面准备
1.在仅用于RNA抽提的超净工作台抽提RNA
2.工作台面用用RNAase失活剂处理。
(二)总RNA提取步骤:
1.采样
样品采集需均一,迅速,组织样品避免血液污染,样品采集后迅速置于液氮或是-70℃.
2.样品的研磨:
先用少许液氮将研钵冷却,然后取少许组织样放于盛有液氮的研钵内迅速研磨成细粉末,取约少100mg样品于预先加入1mlTrnzol的EP管中,用力颠倒混匀,室温静置5分钟,充分裂解细胞。
3.加入氯仿
向每管中加0.2ml氯仿。
盖紧管盖,用漩涡振荡仪振荡15s(也可用手用力振荡1分钟左右),使其充分混匀,静置2-5min。
4.离心分离
4℃下12000g离心15分钟,样品会分成三层:
黄色的有机相,中间层和上层无色的水相,RNA主要在水相中,把水相(约500μl)转移到新管中,注意不要吸取到蛋白层。
5.转移上清
将含有RNA的上层清液转移到新的1.5mlEP管中后(约500ul),再加入0.5ml异丙醇,轻轻混匀后静置10分钟
6.RNA沉淀
然后4℃12000g离心10分钟,弃上清。
离心前RNA沉淀经常是看不见的,离心后在管侧和管底形成白色胶状沉淀。
7.RNA洗涤
加入1ml75%乙醇(4摄氏度预冷),轻轻洗涤沉淀,4℃,7500g×5min,弃上清。
注意在倒出液体时不要倒出沉淀,剩余的少量液体短暂离心,然后用枪头吸出,注意不要吸弃沉淀。
此步可重复.
8. 晾干
室温放置晾干(不要晾的过干,RNA过分干燥后会很难溶解,大约晾干2-3分钟左右,见乳白色沉淀变成透明胶冻状即可)
9.溶解
根据实验需要及得到RNA量的多少,加入30-100μl无RNase水,反复吹打、混匀,充分溶解RNA。
为了保证RNA的浓度在可用范围,可使用20-30μl水溶解。
若浓度过大可再稀释。
预防RNase污染,应注意以下几方面:
1.经常更换新手套。
因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。
2.使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3.RNA在TRNzol试剂中时不会被RNase降解。
但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除
RNase。
4.配制溶液应使用无RNase的水。
(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%(v/v),放置过夜,高压灭菌)。
TRnzol法抽提总RNA流程图
液氮研磨组织并取样约100mg,加入预先盛有1mlTRnzol的EP管中
振荡混匀后,室温5分钟
↓
加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)
旋涡仪振荡混匀15S,(用手使劲摇动1分钟替代)室温静置2-5分钟
↓
4℃,离心12000g,15分钟
↓
转上层水相(约400-500μl)于另一新1.5mlEP管中
加等体积异丙醇(约400-500μl),混匀后室温10分钟
↓
4℃,离心12000g,10分钟
↓
弃上层清液后,加4度预冷的75%乙醇(用高压后的DEPC水配)1ml
4℃离心7500g,5分钟
↓
弃上清,可短暂离心后,用枪吸取多余的液体,空气干燥约30分钟(不能完全干燥)
↓
溶于DEPC处理水中至30μl(20μl-30μl)
(可在55-60℃水中,<10分钟助溶)
↓融解RNA
立即保存于-70℃超低温冰箱中,或立即用于逆转录
注意:
1.样品量和Trizol的加入量一定要按组织100mg,1mlTRIzol的比例,不能随意增加样品量或减少Trizol量,否则会使内源性RNase的抑制不完全,导致RNA降解
2.实验过程必须严格防止RNsae的污染。
二.RNA质量和浓度检测
分别采用1.0%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白检测仪检测所抽提的总RNA的质量和浓度。
1琼脂糖凝胶电泳检测抽提的RNA的质量:
⑴取10×TBE缓冲液20ml加水至180ml,配成1×TBE缓冲液;
⑵称取1.0g琼脂糖置于200ml锥形瓶,加入100ml1×TBE缓冲液,加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀;
⑶待琼脂糖胶液冷却至50~60℃(手感容器能耐受)时,加入5µlGoldview,摇匀;⑷倒胶:
迅速放好梳子后将凝胶缓缓倒入制胶膜中。
凝胶的厚度在3~5mm之间。
避免产生气泡,尤其梳子周围不能有气泡,若有气泡可用吸管小心吸去。
凝胶通常需要在室温中放置30~45min。
凝胶完全凝固后,将凝胶放入电泳槽中,加入电泳缓冲液,液面应高出凝胶表面1mm小心移去梳子和隔离板,保持点样孔完整;
⑸加样:
用移液枪将RNA液和6×载样液在无RNA酶的离心管中混匀,点样于样品孔中,并同样加DNAMarker于点样孔;
⑹电泳:
加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源,观察正负两极是否有气泡出现,如负极气泡比正极多,则证明电泳槽已经接通电源。
100V电泳0.5h,当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳;
⑺观察和照相:
在波长为254nm的长波长紫外灯下,观察是否出现两条完整的条带:
28S和18S,分别为4800bp和1900bp,如果完整,则说明RNA质量可靠,并在凝胶成像系统下照相保存图片。
2核酸蛋白检测仪检测RNA的浓度:
取5µl总RNA和45µl1×TE于比色杯,用枪头混匀,在RNA程序下测样品相应数值,即:
样品号,260nm吸光度,280nm吸光度,320nm吸光度,260/208nm吸光度比值,样品稀释倍数,样品中RNA的含量(µg/ml,ng/µl)。
3.DNaseⅠ处理用无RNase的DNaseⅠ处理,消除总RNA中痕量DNA的污染,操作步骤如下:
⑴在微量离心管中配制下列反应液,总量50µl;
总RNA30µg
10×DNaseⅠBuffer5µl
DNaseⅠ(RNase-Free,5U/µl)2µl
RNaseinhibitor(40U/µl)0.5µl
DEPCH2O12.5µl
⑵37℃反应20~30分钟;
⑶加入50µl的DEPCH2O;
⑷加入100µl(等量)的苯酚/氯仿/异丙醇(25:
24:
1),充分混匀;
⑸13,200rmp离心5min,取上层(水层)移至另一微量离心管中;
⑹加入100µl(等量)的氯仿/异丙醇(24:
1),充分混匀;
⑺13,200rmp离心5min,取上层(水层)移至另一微量离心管中;
⑻加入10µl(1/10量)的3M醋酸钠(PH5.2);
⑼加入250µl(2.5倍量)的冷无水乙醇,-20℃放置30~60分钟,以沉淀RNA;
⑽13,200rmp离心15min,弃上清;
⑾缓慢加入75%乙醇200µl,13,200rmp离心5min以清洗沉淀,弃上清。
重复清洗一次,弃上清,用离心机短暂离心10s,用Tip头吸干残留乙醇;
⑿空气干燥10min(注意:
切勿过分干燥,否则RNA将会很难溶解且A260/280会小于1.6),加30µlDEPCH2O溶解10min,样品保存于-80
三.反转录
(一)准备工作
1实验器具与材料:
(1)移液枪:
200ul、10ul
(2)吸头:
200ul、20ul
(3)EP管1.5ml、200ul
2,实验器具的处理与准备
塑料制品:
(包括吸头、EP管等)
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压至少30分钟,后在60-70℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。
优级耗材可直接使用.
3,试剂配制和准备:
(1)DEPC水:
泡实验器具的DEPC水的配制:
1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。
逆转录中所用的DEPC水的配制:
100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压,后分装到几个1.5mlEP管中,-20℃中保存备用。
(2)RT中所需要的各种试剂
1,RT试剂盒.
2,DEPC处理水或生化专用的RNase-free水.
3,10uM浓度的引物.
(二)RT步骤
用RT试剂盒进行转录(10ul体积)。
1,准备200u的EP管
2,冰上操作:
按试剂盒说明书进行反应体系的配制.
3,配制好后,轻轻振荡以混匀样品,用小离心机将所有样品都离至管底。
4,按说明书上的反转录条件在普通PCR仪上进行反转录.
5, 反转录完成后,其管内产物即为PCR的模板.以10UL的反应体系来说,每次反应所需的模板量仅为1UL.
6,分装处理并做好标记,为了保证模板的完整性,应对反转录后的模板进行分装.分装后-20℃保存,PCR进再单管取样,减少模板冻融次数。
1.按下列组分配制RT反应液(在冰上进行,总体系10µl)
5×PrimescriptTMBuffer2µl
PrimescriptTMRTEnzymeMixⅠ0.5µl
OligodTPrimer(50µM)0.5µl
Random6mers(100µM)0.5µl
TotalRNA4µl
RNaseFreedH2O2.5µl
2.轻轻混匀后7500rmp离心3~5sec;
3.在下列条件下进行反转录反应:
37℃,15min,(反转录反应);85℃,5sec(反转录酶的失活);
4.反转录产品-20℃保存待用。
四.普通PCR
(一)引物的稀释
在引物合成回来后,立即存放于-20冰箱内。
由于引物合成的量很少,稀释前先用离心机高速离心(10,000rpm,1min),将DNA制品的粉末都离心至管底,然后加上引物nmol*10体积的无菌水,轻轻上下振荡5-10分钟,再次离心10,000rpm,1min,制成100uM的保存液,再取少许别稀释成10&20uM工作液,原液或工作液-20保存。
这样即可以减少引物被污染的机会,又可以减少因多次冻融而使引物降解或断裂,进而影响实验结果。
在溶解DNA制品是,我们是先将其制备成100uM的保存液,然后再稀释成实验浓度。
配制100uM的保存液的方法。
灭菌水的使用量:
体积(ul)=nmol数*10.
1umol=1000nmol=1000000pmol
1uM=1umol/L=1nmol/ml=1pmol/ul
(二)PCR准备
1、实验器具与材料:
(1)移液枪:
200ul、10ul
(2)吸头:
200ul、20ul
(3)枪头盒:
放置200ul和20ul的吸头一个
(4)EP管1.5ml、200ul
2,实验器具的处理与准备
塑料制品:
(包括吸头、EP管等)送至高压30分钟次,试验前将枪头放入吸头台。
3,试剂配制和准备:
(1)超纯水:
100ml盐水瓶内装40ml超纯水,送至高压,后分装到几个1.5mlEP管中,-20℃中保存备用。
(2)PCR中所需要的各种试剂:
Master-mix,cDNA模板,Primer,无RNAase水.
(三)PCR步骤
1,准备200ulEP管
2,确定各成分的添加量(参照试剂盒说明).
3,在冰上操作,并放置在设定程序的PCR仪.
4,再电泳检测结果
5,1.取0.2mlPCR管,依次加入下列试剂(PCR总反应体系为10µl):
第一链cDNA1µl
上游引物(10µM)0.5µl
下游引物(10µM)0.5µl
2×TaqPCRMasterMix5µl
ddH2O3µl
五.荧光定量
1、实验器具与材料:
(1)移液枪:
200ul、10ul、1000ul
(2)吸头:
200ul、10ul、1000ul
(3)枪头盒:
1000ul、200ul、10ul(2个)
(4)EP管:
1.5ml、200ul
(5)白管:
低位白色八联管
2.反应体系
1.取0.2mlPCR管,依次加入下列试剂(PCR总反应体系为10µl):
第一链cDNA1µl
上游引物(10µM)0.5µl
下游引物(10µM)0.5µl
2×TaqPCRMasterMix5µl
ddH2O3µl
反应体系(总体系为12.5µl):
SYBRPremixExTaqTM(2×),6.2.5µl;上游引物(10µM),0.25µl;下游引物(10µM),0.25µl;第一链cDNA,1µl;ddH2O,4.75µl。
其中SYBRPremixExTaqTM(2×)内含MgCl2、TaqHS(HotStarTaqpolymerase,热启动酶)、dNTP、SYBRGreenⅠ等。
3.反应程序
反应程序:
①预变性:
95℃,1min;②扩增:
95℃,5s;60℃,30s;共40个循环;③融解曲线:
95℃,0s;50℃,30s;95℃,0s(温度变化速率为0.5℃/s)。
反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线,进行PCR定量时制作标准曲线等。
采用双标准曲线法计算各基因mRNA的相对表达量。
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