PCR-RFLP方法检测猪氟烷基因Word格式.docx
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随着生活水平的提高,人们对猪肉品质的要求也越来越高,猪的肉质问题已引起了消费者和养猪生产者的广泛重视。
虽然影响猪肉品质的单个基因可能很多,但目前影响猪肉品质的基本明确的主效基因之一就是氟烷基因(Hal)。
氟烷基因又称氟烷敏感基因或猪应激综合症基因,是最早发现的主效基因之一,它是一个不完全显性的常染色体上的隐性基因,该基因阳性纯合子(HalnHaln)一般具有瘦肉率高、生长速度快和饲料报酬低等重要经济性状,但降低了猪肉的品质[1]。
这主要是因为该基因的隐性纯合子易产生应激综合症(PSS),而应激综合症是产生PSE肉的直接原因。
猪在应激情况下,如长途运输、屠宰等,会对应激原刺激过度敏感,进而呼吸急促、心跳亢进、肌肉僵直,机体内水、电解质代谢紊乱,甚至突然死亡。
PSE肉是猪肉的一种主要的质量缺陷,特点是肌肉呈灰白色,质地柔软,具渗出性或水性[1]。
此类肉由于失水而收缩,加工产量低,多汁性差,食用质量一般低于正常质量,大大降低了猪肉的经济价值
[1]。
它的发生和发展,给世界各地的养猪生产、猪肉加工和销售造成了巨大的经济损失。
在我国,由于高瘦肉率猪种的
引入和利用,PSE肉的发生率也在不断上升。
目前,猪氟烷基因型的检测是通过PCR获得猪HAL基因包含CDS序列第1843位碱基突变点的DNA片段。
当HAL基因未发生突变(CC型),即阴性纯合子,HhaⅠ限制性内切酶(酶切DNA序列是:
5’GCG↓C3’)可以识别GCGC序列,包含该酶切位点的DNA片段可以被该酶消化;
当两条染色体的C碱基完全突变为T时,即阳性纯合子,酶切位点消失,变成5’GTGC3’,不能被HhalⅠ切割;
当为杂合子时,HhalⅠ限制性内切酶仍可以将其中一条DNA片段消化。
1材料方法
1.1仪器与耗材
不同规格移液器,PCR仪,电泳仪,水平电泳槽,电子天平,药品勺,250mL锥形瓶,称量纸,电炉,凝胶成像系统,恒温水浴锅,不同规格离心机,不同规格一次性Ep管,不同规格一次性Tip头,一次性PE手套,操作板,等。
1.2材料与试剂
1.2.1实验材料
猪耳组织DNA。
猪耳组织于市场购买。
1.2.2试剂
PCR反应相关试剂:
含有镁离子的PCR缓冲液,特定的上下游引物,dNTP,TaqDNA聚合酶,灭菌双蒸馏水。
凝胶电泳相关试剂:
琼脂糖,100×
TAE或者100×
TBE缓冲液等,DNA分子量标准,上样缓冲液(6×
Loadingbuffer),溴化乙锭(EB)或者替代物。
酶切相关试剂:
HhalI限制性内切酶,酶切缓冲液,等。
1.3实验步骤
1.3.1猪基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测
将200mg猪耳组织样剪碎,置于1.5mL离心管中,加入800μL裂解液、25μL蛋白酶K,混合均匀,置于50℃恒温水浴锅中孵育14~20h,直至看不见组织块为止。
取出,往离心管中加入400μLTris饱和酚、384μL氯仿、16μL异戊醇,室温振荡10~15min,放入离心机,以12000g离心10min。
-3-
离心后,取上清液于1.5mL离心管中,加入700μL(或与上清液体积相当)异戊醇沉淀,轻轻摇晃,直至百色絮状DNA出现,再以12000g离心10min。
弃上清液,留下沉淀物,加适量75%乙醇溶解,再加入100μL灭菌双蒸馏水,低温保存备用。
同时,配制1%琼脂糖凝胶备用。
用天平称取0.3g琼脂糖,倒入250mL的锥形瓶中,加入30mL的1×
TAE溶液,均匀混合后,用电炉加热约3min,使琼脂糖充分溶解,小心取出,等温度降至50~60℃时,加入2μL的核酸染料,摇匀后轻轻倒入到专用槽中,防止气泡出现,并插上梳子。
待凝胶充分凝固后,小心移去梳子,向点样孔中加入1μLDNA溶液与5μL上样缓冲液,同时在其中一梳孔中加入DNA分子量标准。
将凝胶块放入电泳槽内,以200V电泳15~20min。
将凝胶块取出,置于紫外灯或凝胶成像系统下进行观察或拍照,有亮橘色条带即表明DNA提取成功。
将成功提取的DNA置于低温保存备用,并清理未提取出DNA样品。
1.3.2猪HAL基因的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
登录GenBank或者EBI生物学网站,获得猪HAL基因序列,分析并设计引物,目的片段包括含有CDS序列第1843
位碱基。
按照表1配制反应体积为20μL的PCR反应体系。
表1PCR反应体系(20μL)
成分
体积/μL
10×
Buffer(含Mg2+)
2
dNTPs
1.6
TaqDNA聚合酶
0.2
上游引物
0.4
下游引物
DNA模板
ddH2O
15
总体积
20
在配制上述溶液时,一般将除了DNA模板外的所有成分混合,均匀分装到灭菌的用于PCR扩增的Ep管中(0.2mL
规格)。
在分装好的Ep管中加入DNA模板,盖紧盖子,瞬时离心,使各成分混合均匀。
设置如下PCR程序:
首先95℃预变性5min,然后94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸40s,进行35个循环,最后,72℃延伸5min后冷却到4℃保存。
用琼脂糖凝胶电泳检测扩增的效果。
1.3.3猪HAL基因的突变检测(RFLP)
经琼脂糖凝胶电泳检测后,PCR产物可以直接用于RFLP检测。
按HhaI内切酶说明书要求,取10uLPCR产物,2uL10×
Buffer,0.5uLHhaⅠ内切酶(10U/uL),加ddH2O至20uL,37℃温育3h,琼脂糖凝胶电泳检测,并拍照。
2结果分析
2.1PCR结果
有6个样本的DNA成功经PCR扩增,得出的的目的DNA片段全长659bp(含上、下游引物),无杂带,见图1
M 1 2 3 4 5 6 7 8
2000
1000
750
500
250
100
图1氟烷基因PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳图
(1~8:
氟烷基因扩增产物;
M:
marker)
2.2氟烷基因HhaⅠ酶切分析
被采用HhaⅠ内切酶对扩增出的氟烷基因659bp片段进行酶切分析,酶切电泳图谱较清晰,见图2。
若氟烷基因未发生突变,HhaⅠ限制性内切酶可将659bp长度的DNA片段切割成493bp和166bp两条带,即基因型HalNHalN;
若为HalNHaln杂合子,酶切电泳时可见659bp、493bp和166bp三条带;
HalnHaln氟烷基因阳性纯合子第1843位碱基发生了突变,不能HhaⅠ内切酶酶切,电泳时只有659bp一条带[2]。
酶切结果显示,8个猪个体中有3个呈现两条带(495bp+165bp),即为阴性纯合子,表明这3头猪的氟烷基因型为HalNHalN,不含有有害的氟烷基因型Haln。
图2 氟烷基因PCR产物HhaⅠ酶切电泳图
(1~8:
氟烷基因NN型个体;
3讨论
用于检测氟烷基因的组织除了猪的耳尖肌肉组织外,还可以用猪毛等组织。
在孙有平与包承玉[3]的研究中,共采集了56头丹麦长白猪(其中1头为1周龄的仔猪、26头种公猪、29头种母猪)的猪毛样品,粗提取DNA,进行PCR扩增,得到659bp在氟烷基因中(即兰尼定受体基因)中第1843个碱基的特异片段,经过HhaⅠ酶切和电泳来检测氟烷基因的变异,即其基因型。
结果表明:
56头长白猪中,阳性猪(nn)1头,占1.79%,杂合子猪(Nn)为18头,占23.14%,阴性猪(NN)为37头,占66.07%。
杂合子数实际值显著高于理论值,说明杂合子猪具有杂种优势,因而易被选作种用。
HhaN基因频率0.82,Hhan的基因频率为0.18。
并证明,每头猪采集
2~4根含毛囊的毛样,就可进行PCR扩增,采样方便且一次可大批量进行。
且从1周龄仔猪开始至成年的种猪,均可
用毛样进行基围诊断。
枫泾、“长(丹)×
上”、“皮杜×
长上”不同组合148头猪的氟烷基因,其基因型频率NN有41头,占27.7%;
Nn有82
在曹建国[4]等人的研究中,利用猪毛PCR-RFLPs方法检测“皮枫”、长(丹)、“长(丹)×
皮枫”、“大约克×
皮枫”、
头,占55.4%;
nn有25头,占16.9%。
并表明,此检测法成本低、速度快、准确性高,能检出氟烷基因阴性、阳性或
杂合子,可有效地防止氟烷基因纯合子在商品猪中出现,加快猪种的改良步伐。
参考文献
[1]初晓娜,王贞,张荣昌.影响猪肉品质的主基因及其研究进展[J].中国饲料,2007,
(2):
20—22
[2]伍少钦,唐荣福,吴志君,邓志欢.利用猪毛PCR-RFLPs方法检测氟烷基因[J].广西畜牧兽医,2007,23(5):
214—216
[3]孙有平,包承玉.通过猪毛检测丹麦长白猪氟烷基因的变异[J].畜牧兽医学报,1996,27
(2):
137—141
[4]曹建国,赵芳根,等.利用猪毛PCR-RFLPs方法检测氟烷基因[J].上海农业学报,1998,14(4):
23—26
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- PCR RFLP 方法 检测 烷基