省骨干教师培训生物显微镜.docx
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省骨干教师培训生物显微镜
实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察
微生物的个体微小,肉眼难以见到,要研究它们,必须要用显微镜来观察。
因此,显微镜是研究微生物的重要工具。
显微镜是一种精密的光学仪器使用时必须了解其基本原理和构造,才能充分发挥其性能。
一、目的要求
1.学习并掌握显微镜油镜的使用技术及维护的基本知识。
2.使用油镜观察细菌的几种基本形态。
3.用悬滴法在高倍镜或油镜下观察细菌的运动。
二、生物显微镜、相差显微镜及其油镜的使用原理
(一)、显微镜的结构与油镜使用原理
1.显微镜的构造
图1-1为单目普通显微镜,现已较少使用。
其结构可分为两大部分:
光学部分和机械部分。
光学部分通常是由接目镜、接物镜和照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)组成的。
它使检视物放大,造成物象,是显微镜的重要组成部分。
机械部分由镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台移动器、粗调节器、细调节器等部件组成。
它起着支持、调节、固定等作用。
图1-1普通光学显微镜结构示意图
1.接目镜2.镜筒3.粗调节器4.细调节器5.转换器6.接物镜7.载物台8.光圈9.聚光器10.反光镜
2.显微镜的放大倍数和分辨率
(1)显微镜的放大倍数
显微镜放大物体,首先经过物镜第一次放大造像,再经过目镜在明视距离内第二次放大
选像。
因此,显微镜的放大倍数等于接物镜的大倍数和接目镜放大倍数的乘积,即:
显微镜放大倍数=接物镜放大倍数接目×放大倍数
(2)显微镜的分辨率
显微镜的分辨率是表示显微镜辨析物体(两端)两端之间距离的能力,能够辨析物体两
点间的距离愈小,则分辨率愈高,分辨率的高低,首先取决于物镜民的镜口率所使用光线的波长,见图(1-2)。
图1-2物镜的光线入射角
显微镜的分辨率可以用以下公式表示:
式中D:
为物镜分辨出物体两点间的最短距离;
λ:
为可见光的波长(平均0.55μm);
n:
为物镜和被检标本间介质的折射率;
α:
为镜口角(即入射角)。
λ愈大,D值愈大,分辨率愈低,n和α愈大,D值愈小,分辨率愈高,因此,可以通过降低光线波长,增大介质折射率和加大镜口角(入射角)来提高分辨率。
3.油镜使用的原理
对于个体微小,用高倍镜仍观察不清的微生物,则必须使用油镜。
使用时,需要在标本和物镜间加入一种镜头油。
如香柏油,所以叫油浸接物镜,简称油镜。
一般在镜头上有一黑圈或红圈的,表示为油镜物镜,也有的“以IO”或“HI”字样来表示。
由于油镜镜面很小,使用时检视物与镜面又非常靠近(0.14~0.19mm左右),因而使进入镜头的光线较少。
当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时,由于玻片与物镜之间的介质为空气(接物镜干燥系)。
空气折射率为1,由于空气与玻片的密度不同,使光线受到曲折,发生散射现象,结果进入物镜的光线必然减少,这样就降低了视野的照明度。
若载玻片与物镜之间的介质不是空气,而是一层油质,一般常用香柏油,其折射率为1.515,与玻璃的折射率(1.52)相近。
光线通过载玻片可直接通过香柏油进入物镜而几乎不发生折射(接物镜油浸系),使视野增加进光量,这样就能使物像更加清晰,见图1-3。
图1-3干燥物镜与油浸系统物镜光线通路
(二)显微镜的一般使用方法(主要是油镜的使用)
1.用前检查
从显微镜箱中取出显微镜时,用左手拿镜臂,左手托镜座,直立移动,轻放在平稳的桌面上,检查各部零件是否齐全,镜头是否清洁,否则报告老师。
2.调节光照
正确的照明是获得良好检查效果的前提、用粗调节器提升镜筒,将低倍物镜旋到镜筒下方,使镜头和载物台距离约为5mm左右,左眼看目镜调节反光镜镜面角度(在天然的光线下观察,一般用平面反镜;若以灯光为光源,则一般多用凹面反光镜)。
调节光线强弱,然后调节聚光镜的位置(酌予升降),直至视野内得到最均匀最适宜的光度为止。
3.低倍镜观察
低倍物镜视野面广,焦点深度较深,易于发现目标确定观察位置,故应先用低倍镜观察为宜。
将载片标本(涂面朝上)置于载物台的标本夹上,并将标本部位处于物镜的正下方,转动粗调节器,使镜头下降至镜面距离检视物大约10mm处。
然后以左眼看目镜,另一眼睁开,一边观察视野,一边扭动粗调节器使镜头缓慢地升高,至视野内出现物像后,改用细调节器上下微微转动,仔细调节焦距和照明,直至视野内获得清晰的物像,选择适宜部位,移到视野中心,待换中、高倍镜观察。
4.依次再进行中倍、高倍观察
在物镜依次由低倍至中倍、高倍的观察过程中,应逐次上升聚光镜以调节光线亮度,同样选择适宜的部位移至视野中央。
5.油镜观察
将聚光镜提升至最高点,转动转换器,移开高倍镜,使高倍镜和油镜成“八”字形,在标本中央滴一小滴香柏油,使油镜镜头浸入香柏油中,微微转动细调节器,可见清晰物像,如果油镜上升已离开油面还未看清物像的话。
需重新调节。
此时可从侧面注视,用粗调节器将镜筒小心地降下,使油镜浸在香柏油中,其镜头几乎与标本相接。
应特别注意不能压在标本上,更不能用力过猛否则不仅压碎玻片,也会损坏镜头。
用左手向上转动粗调节器,当视野中有模糊的标本物像时改用细调节器,直到看清物象为止。
6.换片
另换新的标本片,必须从第三条开始操作。
7.用后必须清洁、复原
观察完毕,上旋镜筒,先用擦镜纸擦去镜头上的油,然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯(香柏油溶于二甲苯)擦去镜头上的残留油迹,最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。
机械部件用细软布擦去灰尘和冷凝水,下降镜筒,将接物镜转成八字形置于载物台上。
下降聚光镜,(切勿使接物镜与聚光镜相碰受损),反光镜垂直于镜座。
放进显微镜箱中锁好,并放入指定的面微镜柜中。
8.显微镜保养和使用中的注意事项
(1)不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
(2)镜面只能用擦镜纸擦,不能用手指或粗布擦,以保证镜面的光洁度。
(3)观察标本时,必须依次用低倍镜、中倍镜、高倍镜,最后用油镜、当目视接目镜时,特别在使用油镜时,切不可用粗调节器向下旋,以免物镜碰到胶片损伤镜面或压碎玻片。
(4)观察时,两眼睁开养成两眼能够轮换观察的习惯以免眼睛疲劳,并目能够在左眼观察时,右眼注视绘图。
(5)拿显微镜时,一定要右手拿镜臂,左手托镜座,不可单手拿,更不可倾斜拿动。
(6)显微镜应存放在阴凉干燥处,以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。
(三)、Nikon显微镜的使用方法
1.Nikon显微镜的结构
Nikon显微镜YS100是目前实验室微生物学实验所使用的双目显微镜,其结构示意图见图1-4和1-5。
图1-4Nikon显微镜的结构示意图1
图1-5Nikon显微镜的结果示意图2
2.Nikon显微镜的使用方法
为了充分了解这一显微镜。
更好地掌握这一精密仪器的性能及其使用,本实验对显微镜的结构及功能作较详细的介绍,指导教师作进一步的示范操作。
因此,在使用时必须严格的按本实验的操作规程操作。
具体的操作规程如下:
(1)接通电源。
(2)打开主开关。
(3)移动电压调整整旋,使光亮度适中。
(4)把标本固定在载物台上。
(5)放松粗调锁挡。
(6)用低倍物镜,旋转粗调和微调控制钮来进行对焦。
(7)调节双目镜筒间距和视度差。
调节左右双目镜简间距调节座,其与视场合而成一。
旋转左右目镜套筒,使镜长补偿环刻度的数值与双目镜筒间距的刻度相一致。
边旋转租调、微调按钮,边在标本上对焦。
(8)再适当调节照明亮度。
(9)使焦台正确地对准标本。
(10)锁紧粗调锁挡
(11)调节孔径光栏。
(12)依次用低倍、中倍、高倍观察。
(13)油镜观察,移开高倍镜,在载玻片的标本中加一滴香柏油,旋转油镜至油液中,旋转微调控制钮,并将聚光镜调高与载片紧贴,即可见到清晰的物像。
(14)观察完毕,清洁、复原。
先将电压调节旋或复原,关闭主开关,切断电源。
放开粗调锁档。
油镜的处理:
先用擦镜纸擦去镜头上的油,再用沾有二甲苯的擦镜纸再擦镜头,最后再用干净的擦镜纸将镜头擦干净。
(15)放入保存箱中。
(四)、Olympus生物显微镜
Olympus生物显微镜由日本进口的一种双目光学显微镜,它使用方便,分辨率高并且有立体感,是研究微生物的良好工具。
1、显微镜的结构与性能
(1).显微镜的结构
OIYMPUS生物显微镜的结构示意图见图1-6和1-7。
主要有由双筒目镜、物镜、镜筒、镜架、转换器、机械载物台、载物台、聚光镜、底盘等组成。
目镜放大倍数为
10×
15×
物镜放大倍数为
10×
20×
40×弹簧加重
100×弹簧加重
(2)显微镜操作部分的性能
插头、主开关、电压调节旋钮载物台十字调节钮、夹紧器、微调控制钮、粗调控制钮、粗调控制钮的重量调节环、镜筒夹紧螺旋栓、双目镜筒间距的刻度、镜筒长补偿环、最低电压调节螺丝、保险丝支架。
一次电压转换刻度盘和粗调锁档等组成。
镜筒长补偿环是用来调节双目镜筒间距的刻度,补偿双目镜筒的视度差。
载物台十字调节钮可以前后左右调节。
电压调节旋钮用来调节显微镜的光度,随着数字增大,电压随之增加亮度也增大。
粗调控制钮的重量调节环,如顺时什的方向旋转这重量调节环则就变重。
图1-6Olympus显微镜的结构示意图1
图1-7Olympus显微镜的结构示意图2
粗调锁档是为了防上标本和物镜的碰撞,以及使对焦简单化的装置。
用粗调控制或把焦点与标本对好后,固定这个锁裆,就能限制粗调广限。
因此即使再度对焦点,也用粗调调至停止的位置上,焦台就大致相合,而用微调控制钮就调出正确的焦点。
一次电压转换刻度盘:
用前必须把一次电压转换刻度盘与电源电压相一致。
2、显微镜的使用方法
使用方法与Nikon显微镜的使用方法相类似。
(五)、Olympus相差显微镜
暗视野显微镜可以看到活的微生物的轮廓但是观察不清楚内部结构,因为生物细胞的内
部结构大部分都是透明的。
相差显微镜可以克服这方面的缺点。
1、相差显微镜的工作原理
人的肉眼只能够分辨光波的波长(颜色)和振幅(亮度)的差异,而不能分辨光波相应的差异、微生物细胞经过染色后,可以看得更清楚,这是由于改变了光波的波长(有的也同时改变了振幅〕。
透明的物体不能改变光波的波长和振幅、只能使光波的相位发生改变。
因此,在普通显微镜下,活细胞内的显微结构是不易看到的。
相差显微镜具有一个特殊的由环状光圈与聚光镜组合的转盘聚光镜,通过这个特殊的装
置,就可把光波的相位差异变为振幅的差异,从而使人们肉眼即能观察到活细胞的细微结构,
并有立体的感觉。
在微生物研究工作中,经常应用相差显微镜来观察微生物的活细胞结构、鞭毛的运动等。
2、相差显微镜的装置
(1)环状光圈
环状光圈装在显微镜的聚光镜下,使光线只能从环状部分通过形成一个空心圆筒状的光柱,通过聚光镜照在载玻片的标本上。
(2)相差物镜(具有环状相板)
相差物镜是相差显微镜的主要装置。
在物镜的后焦平面上加一相板,相板上涂一层物质(多为氯化镁等喷涂而成),使光波相对地提前或阻滞1/4波长。
由于直射光的强度远远大于绕射光,即便是两者反向而发生干涉作用,其效果还是不够明显,所以要降低直射光的透光度,使相环呈暗色,使大约25%的直射光通过,环状相板上的暗环与环状光圈上的亮环,大小是配合的,通过透明标本的直射光,一定要准确地经过环状相板的暗环,以减弱视野亮度,增进观察效果。
相差物镜常刻有红色的ph样标记,ph是phase(相)的缩写。
欧林巴斯相差物镜用红圈来代表相差物镜。
(3)定中心望远镜(也称辅助目镜)
这是一种工作距离长的低倍望远镜。
使用时拔出目镜,安装在镜简上端,调整环状光圈的中心与物镜的光轴完全在一直线上。
(4)辅助固定板手
(5)绿色滤光片。
使光源波长一致,增加干涉效果。
3、相差显微镜的使用方法
(1)相差装置的安装
欧林巴斯相差显微镜是将普通的生物显微镜的聚光镜拆下,然后把转盘聚光镜安装在聚
光镜支架上,方位记号要向前,聚光镜的上透镜平面要和镜台平面一致。
将绿色滤光片放在滤色镜座上。
(2)相差物镜的安装:
将相差物镜由低倍、中倍、高倍、油镜按顺时针方向安装在转换器上。
物镜的放大倍数为
10×
20×
40×弹簧加重
100×弹簧加重
(3)安放标本
将标本安放在载物台上、并用夹紧器夹紧。
(4)对光
先以相差物镜与普通目镜对光,旋转相差转盘至方位记号为“0”时停止,这时通光孔正位于聚光镜下面。
使用低倍相差物镜,把标本移向视野中央,推动电压调整旋钮,调节光源亮度,高度和位置,便得到光亮均匀的视野。
(5)调焦:
用粗调控制钮和微调控制钮调节焦,看清物像时为止。
(6)旋转相差转盘
使环光圈的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应。
例如,使用10倍相差物镜时,要在方位记号表示10倍的位置停止旋转。
(7)中心调节
拔出普通目镜,插入定中心望远镜,一边看望远镜,一边旋转自镜镜筒使上升降,对准焦点就可看到清楚的亮环和暗环。
再进行中心调节,如果两个圆环不能完全重合而有误差,则使用聚光器上左右侧的锁状螺旋——光环中心调节器,进行精密的调节,使两环完全重合。
在调节过程中若亮环比暗环小而位于暗环内侧,此时可降低聚光镜;若亮环大于暗环时,可升高聚光镜,升到最高限仍不能矫正,即就是载玻片过厚的缘故,要更换较薄的载玻片。
载片的厚度要求在0.8mm-l.2mm。
(8)相差观察
最后拔出定中心望远镜,插入普通目镜就可利用普通明视野的微检方法进行相差观察。
每更换标本或改变不同倍率的相差物镜时,都必须按上述方法重新调节中心,否则光轴不一致。
三、实验材料
1.显微镜(显微镜灯)、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。
2.细菌三种形态的染色标本。
3.培养12-18h的枯草杆菌(Bacillussubtilis)
4.盖玻片、凹玻片、接种环、酒精灯。
四、实验程序
(一)细菌三种基本形态的观察
识别细菌首先要从形态特征入手,细胞形态观察包括菌落形态和个体形态,这里主要是指个体形态的观察、细菌个体形态包括活细菌观察和涂片染色观察、在一般实验室条件下,常常用染色观察来识别细菌的形态。
1.结合油镜的使用,观察三张细菌染色片(球状菌、杆状菌和螺旋状菌),边观察边绘图。
2.看示范镜观察双球菌、四联球菌、并绘图。
(二)细菌运动性的观察(示范)
有些细菌具有鞭毛,它是运动器官,在水中能自由快速地运动。
观察细菌的运动一般采用水浸片法,悬滴法、半固体培养法,常用水浸片法和悬滴法来观察细菌的运动性。
1.水浸片法
用接种环取培养12—18h的枯草杆菌菌液一环,置于干净的载玻片中央,盖上盖玻片(注意不使产生气泡),用低倍镜确定部位后,再换用中倍至高倍或油镜观察。
2.悬滴法
取一洁净的盖玻片。
按无菌操作要求,用接种环从斜面低部取培养12—18h的枯草杆菌菌液一环,置盖玻片中央,要求菌液保持为圆形突起的水珠。
另取凹玻片一块,在凹窝周围涂一圈凡士林,再将带菌液的盖玻片翻转,使液滴悬于凹玻片之凹窝处上方避免菌液触及凹窝的边和底,并略按盖玻片,使凡士林密封边缘,以减少菌液蒸发,这样可以保持较长时间观察。
(见图1-6)。
悬滴片制成后,先用低倍镜找到水滴,再换高倍镜观察。
用此法可以区别细菌的运动性,也可用于观察细菌的繁殖方式,孢子发芽等。
图1-6悬滴法观察细菌运动性
1.载玻片2.凹窝3.盖玻片4.悬滴5.凡士林或浆糊
思考题
1.油镜与普通物镜在使用万法上有何不同?
应特别注意些什么?
2.使用油镜时,为什么必须用镜头油?
3.镜检标本时,为什么先用低倍镜观察,而不是直接用高倍镜或油镜观察?
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